“頑拗植物”DNA提取與純化的問題與展望

1、“頑拗植物”DNA提取與純化的問題與展望摘要：植物DNA的提取和純化是分子生物學研究的基礎，然而大多數(shù)植物尤其是所謂的“頑拗植物”含有大量的多糖、多酚等其他次生代謝物，因此如何高效地提取高質(zhì)量的DNA成了植物基因組研究的首要前提，也是目前很多植物分子生物學研究的瓶頸。本文就目前常用的植物DNA提取和純化的方法及各自存在的問題進行了簡單的綜述。關鍵詞：DNA提取，DNA純化，“頑拗植物”The Problems and Prospect of DNA Extraction and Purification in “Recalcitrant Plant”Abstract: The DNA extr

2、action and purification of plants is the basis of the study on Molecular Biology, however, most of the plants, especially the so-called “Recalcitrant plant” contain large amount of polysaccharide, polyphenol and other secondary metabolites, therefore, how to effectively extract high quality DNA beca

3、me the first premise of plant genome research and the bottleneck of many Plant Molecular Biology research. This paper briefly summarized the commonly used DNA extraction and purification methods of plants and their existing problems of a simple review.Key words: DNA extraction, DNA purification, “Re

4、calcitrant plant”分子生物學是一門年輕而又古老的學科。早在1871年，Lankester就提出：生物不同種系間的化學和分子差異的發(fā)現(xiàn)和分析，對確定系統(tǒng)發(fā)生的關系，要比總體形態(tài)的比較研究更為重要 李興玉. 簡明分子生物學M. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2009:2.。自20世紀50年代Watson和Crick提出DNA雙螺旋模型以來，分子生物學在廣度和深度上都獲得了空前的發(fā)展。作為分子生物學研究的基礎，DNA在生物學領域的研究日漸深入 張寧, 王鳳山. DNA提取方法進展J. 中國海洋藥物, 2004, (2):40-46.。而DNA的提取是分子生物學研究的重要手段，是分子標記、

5、基因克隆、基因探測等后續(xù)研究的基礎 李繼東, 畢會濤, 李海濤等. 灰棗成熟葉片DNA提取及ISSR反應體系構(gòu)建J. 果樹學報, 2008, 25(6):837-841.- 孫璐宏, 魯周民, 張麗. 植物基因組DNA提取與純化研究進展J. 西北林學院學報, 2010, 25(6):102-106.。然而如果材料中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、多酚、酯類等次生代謝物，在沉淀過程中產(chǎn)生大量凝膠狀物質(zhì)，就會阻礙實驗的進程 顧蔚, 魏南玉, 代立娟等. 華中五味子干燥材料DNA提取方法的研究J. 生物技術(shù), 2007, 17(6):25-27.。因此，快速地提取和純化結(jié)構(gòu)完整的、高分子量的DNA對于很多分

6、子生物學的應用是至關重要的，例如長片段DNA的PCR擴增、限制性酶切、Southern印跡分析和基因文庫的構(gòu)建等 An Michiels, Wim Van den Ende, Mark Tucker, et al. Extraction of high-quality genomic DNA from latex-containing plantsJ. Analytical Biochemistry. 2003, (315):8589.。雖然目前已經(jīng)發(fā)展了很多從植物中提取純化DNA的方法，但對于很多特殊的植物材料，如“頑拗植物”、轉(zhuǎn)基因食品以及出土的古老植物材料等，這些方法并不適用，并且即使對

7、這些方法加以改進，也難以提取出高質(zhì)量的DNA。因此發(fā)展更簡單、更省時、更經(jīng)濟的DNA提取與純化方法將在很大程度上推動科研、環(huán)保、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等諸多領域的發(fā)展。本文就目前比較常用的植物DNA提取方法和近年來不同學者在研究不同植物時的改良法以及“頑拗植物”DNA的提取仍然存在的問題進行了綜述。1 植物材料1.1 “頑拗植物”在特定的條件下，植物的一些重要初生代謝產(chǎn)物，如乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、莽草酸及一些氨基酸等，會作為原料或前體，進一步經(jīng)過不同的次生代謝過程而產(chǎn)生一些“天然產(chǎn)物”如黃酮、生物堿、萜類等，這些天然產(chǎn)物稱為次生代謝物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，所有旺盛生長的細胞中都發(fā)生著次生

8、代謝物的不斷合成和轉(zhuǎn)化，在植物生命活動中起著非常重要的作用 董娟娥, 張康健, 梁宗鎖. 植物次生代謝與調(diào)控M. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學出版社, 2009:11-41.。所謂“頑拗植物（Recalcitrant plant）”，就是指那些眾所周知的很難提取DNA的植物種類，因為這些植物的細胞結(jié)構(gòu)比較復雜，并且含有很高水平多糖、多酚、皂苷、甾醇、單寧等其他次生代謝物 ZENG Jie1, ZOU Yu-Ping, BAI Jia_Yu, et al. Preparation of Total DNA from “Recalcitrant Plant Taxa” J. Acta Botanica

9、 sinica, 2002, 44(6):694-697.- 王冠明, 韓烈保, 馬秀杰等. 麥冬基因組DNA提取方法研究J. 生物技術(shù)通報, 2010, (6) :100-106.。植物細胞由原生質(zhì)體和細胞壁兩部分組成，原生質(zhì)體由細胞核和細胞質(zhì)組成，細胞質(zhì)又包括質(zhì)膜、細胞器和胞基質(zhì)。植物DNA就存在于細胞核和某些細胞器如葉綠體、線粒體中 馬煒梁, 王幼芳, 李宏慶. 植物學M. 北京: 高等教育出版社, 2009:14-20.。因此在提取植物組織DNA之前需要裂解細胞以釋放出DNA，常用的裂解植物細胞的方法包括物理和化學方法，在某些情況下需要用酶解法來消化蛋白質(zhì)或降解一些細胞組分

10、裴杰萍. DNA提取方法的研究進展J. 微生物學免疫學進展, 2004, 32(3):76-78.。正是植物組織具有堅固的細胞壁，核酸含量較少，又含有較多的各種雜質(zhì)，以及核酸酶活性高等因素，給植物DNA的分離和純化帶來了一定的困難 丁芳林, 彭書練. 黃芩高質(zhì)量DNA提取方法研究J. 湖南農(nóng)業(yè)科學, 2010, (13):2325.。1.2 植物材料的采集和處理1.2.1 材料的采集植物材料的采集與保存對提取DNA的產(chǎn)量與質(zhì)量都有很大的影響。隨著植物的成熟，植物組織中的多糖和其他一些次生代謝物的積累量會增加 Sue Porebski, L. Grant Bailey, Bernard R. B

11、aum. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol ComponentsJ. Plant Molecular Biology Reporter, 1997, 15(1): 8-15.，這樣勢必會增大提取DNA的難度。所以在選取植物材料時，盡量選取新鮮的、生長旺盛的幼嫩組織，對于這些材料通常用70%的乙醇清洗表面或浸泡1min以去除外源的DNA污染，并用滅菌去離子水沖洗干凈 張英, 柏干榮, 黃明輝等. 植物基因組DNA提取方法學評

12、析與驗證J. 藥品評價, 2004, 1(4):292-297.。而對于一些衰老的葉片，可以先在黑暗中4饑餓處理1 2d，以盡量消耗掉組織中的淀粉和其他多糖類物質(zhì)。Amit Kumar Gupta等 Amit Kumar Gupta, Harish, Manoj Kumar Rai, et al. Isolation of genomic DNA suitable for community analysis from mature trees adapted to arid environmentJ. Gene, 2011, (487):156159.認為提取所用葉片不能太嫩也不能太老，因為

13、太嫩葉的組織中，雖然DNA 含量高，但同時含糖量也高，同樣會增加提取的難度。此外，在植物受傷后，多酚類物質(zhì)很容易被氧化，所以，應盡量選取新鮮、幼嫩、無損傷的植物組織。也有研究者提出，在幼嫩組織不易得到的情況下，木本植物可以考慮使用1年生休眠的枝條韌皮部，這樣可以不受季節(jié)限制 許婉芳. 去除頑拗植物DNA提取過程中干擾物質(zhì)的方法J. 閩西職業(yè)大學學報, 2002(3):55-57.。1.2.2 材料的保存取樣后立即用浸濕的紗布包裹采集的組織材料，放置在密閉的冰盒中，這樣可使組織材料35 d仍然保持新鮮。野外遠距離采集樣本時，在可能的條件下冷凍保存（如放置于液氮中）；當不具備冷凍條件時，最好用無水

14、CaSO4和變色硅膠等干燥劑使其迅速干燥，這種方法可將材料保存數(shù)月，返回后應盡快進行DNA的提取工作。對具有大量次生代謝物的“頑拗植物”，除應盡可能采集幼嫩組織外，最好進行冷凍保存并在短時間內(nèi)進行DNA提取。植物組織材料的化學保存法，如乙醇、丙二醇處理法，通常會導致DNA劇烈降解，因此，不作為推薦的保存方法。對于采集回來的樣品如要長期保存，應經(jīng)液氮處理后貯存在80冰箱或直接儲放于液氮中，且在與提取緩沖液接觸前，應防止冰凍的樣品在空氣中融化，否則酚類易被氧化16- 易慶平, 羅正榮, 張青林. 植物總基因組DNA提取純化方法綜述J. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2007, 35(25):7789-7791.

15、。2 DNA的提取植物DNA的提取方法很多，主要包括物理法（研磨）、化學法（高鹽低pH、CTAB、表面活性劑SDS、熱酚等）和酶解法（裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等）。由于不同植物間以及同一植物的不同部位所含的化學成分差異較大，因此對不同植物DNA提取應采取不同的方法12， 馬月萍, 戴思蘭. 高鹽沉淀CTAB法提取溫室菊花基因組DNAJ. 生物技術(shù)通報, 2009, (7):90-93.。無論新鮮或其它方式保存的植物材料，在提取DNA之前，一般都要在液氮中研磨成細粉以便在裂解液中充分裂解，以得到更高的產(chǎn)率，同時低溫可抑制DNase的活性，防止DNA降解。應注意要在液氮揮發(fā)盡后再將提取液加入樣品粉

16、末中，以避免形成泡沫，浪費實驗材料14。2.1 傳統(tǒng)提取法2.1.1 CTAB法CTAB（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide）即十六烷基三甲溴化銨，是一種陽離子去污劑，既能裂解細胞，又能有效沉淀多糖，還能與核酸形成復合物，這些復合物在高鹽溶液中可解離，而在低鹽溶液中會因溶解度的降低而沉淀，使DNA和多糖分開，最后再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB 閆慶祥, 黃東益, 李開綿等. 利用改良CTAB法提取木薯基因組DNAJ. 中國農(nóng)學通報, 2010, 26(4):30-32.。CTAB法是目前應用最多的植物DNA提取法，但是傳統(tǒng)的CTAB法并不適用于“頑拗植物”DNA的

17、提取，故很多學者提出了各種適合不同植物的改良CTAB法，在不同程度上提高了DNA的提取效率。如劉錦等 劉錦, 羅成, 顧蔚等. 適于AFLP分析的華中五味子DNA提取方法改進J. 陜西師范大學學報（自然科學版）, 2009, 37(6):68-70.采用改良的CTAB法從華中五味子硅膠干燥嫩葉中提取獲得了高質(zhì)量的DNA。Jitendra Kumar等 Jitendra Kumar, Gyan P. Mishra1, Pradeep K. Naik, et al. Genomic DNA isolation from Artemisia species grown in cold desert

18、high altitude of IndiaJ. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(37):7303-7307.對傳統(tǒng)的CTAB法進行了修改，從含有大量多糖和次生代謝物的艾屬植物中有效地提取出了高純度的基因組DNA。張艷紅等 張艷紅, 沈向群, 劉旭穎等. 北方露地杜鵑 D N A的提取J. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2011, (1): 31-32.在使用CTAB法對杜鵑進行基因組DNA提取時，作了3處改進：一是同時使用較高濃度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和巰基乙醇（3），以消除杜鵑葉內(nèi)復雜的次生代謝物的影響；二是增加酚仿抽提次數(shù)，以充分去除各種雜質(zhì)；

19、三是大量提取，微量提純，以降低次生代謝物的影響，通過改進的CTAB法提出了較高質(zhì)量的DNA。2.1.2 SDS法SDS（Sodium Dodecyl Sulphate, 十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下可直接裂解細胞17。SDS通過破壞蛋白質(zhì)的次級鍵，如氫鍵、鹽鍵和疏水力，引起天然構(gòu)象的解體，使染色體離析，同時與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合，從而釋放出核DNA。通過提高鹽（KAc或NH4Ac）濃度并降低溫度（冰?。?，使SDS-蛋白質(zhì)復合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式，再通過離心后除去SDS-蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀。SDS法操作簡單，溫和，但在植物基因組DNA的提取應用中較少，因為該

20、方法不能有效去除多糖和多酚類物質(zhì)，所提取的DNA純度較低。因此SDS法主要應用于本身多糖含量不高的材料或其含量不致影響后續(xù)實驗分析的樣品以及對模板DNA質(zhì)量要求不太高的RAPD分析。但有時SDS法或經(jīng)過改進的SDS法也可提取到高質(zhì)量的DNA，其效果等同于或更甚于CTAB法 肖婷婷, 朱艷, 葉波平等. 鳶尾屬藥用植物總DNA提取方法的比較研究J. 中國野生植物資源, 2010, 29(3):47-50.- 鄒利波,黃升謀. 月季總DNA提取方法的比較研究J. 安徽農(nóng)學通報, 2007, 13(1):57-58.。如鞏艷紅等4在SDS提取液中加入低濃度PVP來提高提取純度，得出了改良的SDS法。

21、又如馬兵鋼等14在提取過程中同時加入抗氧化劑2-巰基乙醇和Vc，得到了顏色為白色至透明狀的DNA粗提液，較好的解決了其DNA褐變嚴重的問題。2.1.3 果膠酶法Steven等采用果膠酶對植物細胞破碎后的抽提混合物進行消化處理，使與DNA共沉淀的膠狀物質(zhì)分解成小的片段，從而無法與DNA一起沉淀下來，降低了DNA的純化難度，提高純化效率2。2.1.4高鹽低pH法高鹽低pH值法中的提取試劑僅為無機鹽和異丙醇，通常采用的無機鹽為醋酸鉀。高鹽是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑，與一般氯仿-異丙醇反復抽提去除蛋白質(zhì)的操作相比該法操作更方便省時，所需樣品量少，適用于瀕危植物DNA的提??；低pH則可有效地防止組織破碎及沉淀

22、大量材料時的電離化作用和酚類化合物的褐變，所得的DNA純度高，無須進一步純化，可直接進行后續(xù)反應2,23,24。如王培訓等14改進鄒氏等的方法，從干品藥材西洋參根部和布渣葉中成功提取了純度和產(chǎn)率都較好的基因組DNA；王冠明等9在對“頑拗植物”麥冬基因組DNA提取方法的研究時就發(fā)現(xiàn)，使用改良的SDS法比改良的CTAB法能得到更高的產(chǎn)率。高鹽低pH法的優(yōu)越性還在于，不采用酚、氯仿等有毒試劑，不需CTAB、SDS、酶等價格較高的試劑，技術(shù)環(huán)節(jié)也容易掌握 周鳳, 張東旭, 呂洪飛. 4種金絲桃屬植物基因組DNA提取及RAPD分析J. 山西大同大學學報（自然科學版）, 2010, 26(4):64-67

23、.。植物基因組 DNA 的提取方法還有Dellaporta和Wood及Hicks法Zigenhagen法CsCl 離心法。植物DNA提取的經(jīng)典方法簡單、高效，無需使用昂貴的儀器和藥品，提取的DNA純度較高，能夠滿足大部分分子生物學的需要，因此一直作為DNA提取的常規(guī)方法。然而這些經(jīng)典的技術(shù)操作步驟復雜、耗時長、易交叉污染 D. E. Howland, R. P. Oliver, A. J. Davy. A Method of Extraction of DNA from BirchJ. Plant Molecular Biology Reporter. 1991, 9(4):340-344.，

24、需要作若干步操作和材料與試劑的轉(zhuǎn)移，這些不容易做到自動化，也不適合加工大量標本，當僅有少量材料供分析時就格外不適用。另外，酚、氯仿等有機溶劑易造成環(huán)境污染，有損操作者的健康11。而且多數(shù)方法只能用于草本植物幼嫩組織DNA的提取，而不適用于木本植物成熟的組織，因此經(jīng)典方法的應用具有一定的局限性。2.2 新提取法針對傳統(tǒng)提取法無法滿足各種特殊植物的DNA提取工作，近年來出現(xiàn)了許多新的DNA提取法，如利用螯合樹脂、特異性DNA吸附膜、離子交換純化柱及磁珠或玻璃粉吸附等方法。這些方法主要應用于提取病毒、微生物、動物和人細胞、福爾馬林固定、石蠟包埋和冰凍組織樣品、古生物標本、含PCR抑制劑的樣本及土壤環(huán)

25、境樣品DNA。張博等用硅珠（SiO2）顆粒吸附DNA純化方法，從不同樹木葉片中均得到了高質(zhì)量的DNA樣品4。黃椰林等對常規(guī)CTAB法提取的DNA用玻璃粉懸浮液純化，所獲DNA的PCR產(chǎn)物能直接測序，較適于“頑拗植物”等富含黏多糖、單寧、多酚和萜類化合物等次生代謝物的植物樣品和長期保存的標本材料。目前國內(nèi)外開發(fā)了多種商品化的DNA提取純化試劑盒，有的是利用核酸的分子量差異，有的是利用特異性膜與DNA結(jié)合，從而達到分離、回收的目的。這些試劑盒根據(jù)材料來源的不同設計了不同的提取方法，操作簡單、高效，所提取的DNA質(zhì)量高，但價格昂貴，提取量較少，適用于樣品數(shù)量有限及DNA含量少的珍稀材料。所以有些廠家

26、推出了將DNA提取和PCR擴增結(jié)合起來的試劑盒，極大地提高了提取的工作效率。另外，還有高通量的DNA提取產(chǎn)品，如高通量組織細胞研磨儀MM301，在常溫和冷凍條件下對硬性、中硬性、韌性、脆性及纖維材料研磨破碎，每次處理樣品的個數(shù)可以多達48個甚至192個。3 DNA的純化3.1 去除多糖類雜質(zhì)由于“頑拗植物”中富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與DNA很相似，很難將它們分開，因此在“頑拗植物”DNA的提取中，多糖污染是最常遇到的問題16。多糖不但與DNA共沉淀，使DNA提取物呈粘稠的膠狀，給實驗操作帶來不便，更重要的是多糖會抑制多種酶的活性，嚴重影響分子生物學研究的下游工作。如抑制某些DNA修飾酶的

27、活性，影響用分光光度法對核酸進行定量分析等 張繼紅,陶能國,張小云等. 三種豆科植物總DNA提取方法的比較J. 湖南農(nóng)業(yè)科學, 2007, (2):31-33.。經(jīng)典的CsCl梯度離心能有效除去植物中的多糖而得到高純度的DNA，但由于梯度離心需要用到超速離心，不但耗時、設備昂貴、涉及EB、操作不便，而且DNA得率很低，因此并不用于一般的研究 Scott O. Rogers, Arnold J. Bendich. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissuesJ. P

28、lant Molecular Biology , 1985, (5): 69-76. 。近年來有很多去除植物組織中多糖的報道。Qin-Bao Li等 Qin-Bao Li, Qinyin Cai, Charles L. Guy. A DNA Extraction Method for RAPD Analysis from Plants Rich in Soluble PolysaccharidesJ. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12 (3):215-220.用葡聚糖凝膠S-1000分離和PEG 8000沉淀的方法來純化DNA，成功地從那些之

29、前發(fā)現(xiàn)很難用苯酚/氯仿提取法除去多糖的植物DNA樣品中除去了多糖類物質(zhì)。鄭泉等 鄭泉, 郭維明, 鄭勇平等. “頑拗”植物春石斛基因組DNA的提取研究J. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(3):1156-1159, 1166.在對“頑拗”植物春石斛基因組DNA提取的研究中，對CTAB法進行改進，即采用區(qū)室分隔法，用核分離緩沖液在核裂解之前先將細胞核從細胞質(zhì)中游離出來，同時保持細胞核的完整性，之后再裂解細胞核，這樣便達到了在細胞核裂解之前就已經(jīng)去除了大部分多糖、多酚等物質(zhì)的目的；將CTAB的濃度提高到3%（W/V），增強了裂解細胞和去除雜質(zhì)的能力；在采樣前將材料置于4暗處饑餓24 h，消耗自身

30、的養(yǎng)分，也起到了一定地減少多糖干擾的作用。Yong-Ki Hong等 Yong-Ki Hong, Sang-Dal Kim, Miriam Polne-Fuller, et al. DNA extraction conditions from Porphyra perforata using LiClJ. Journal of Applied Phycology, 1995, (7):101-107.，在用LiCl從某種紫菜中提取DNA的條件的研究中指出，用LiC1法提取總DNA沒有任何困難，并且不需要作任何去除多糖的處理。最主要的一點是，用LiCI 法不需要研磨組織，這樣可以節(jié)省很多程序：液

31、氮研磨以及后續(xù)的去除多糖的復雜步驟。Sghaier ZIDANI等 Sghaier ZIDANI, Ali FERCHICHI, Mohamed CHAIEB. Genomic DNA extraction method from pearl millet (Pennisetum glaucum) leavesJ. African Journal of Biotechnology, 2005, 4(8):862-866.在研究珍珠稗葉片基因組DNA提取法時用了改良的CTAB法，包括在提取液中加入1.4 M NaCl、1% PVP、1%-巰基乙醇和100%的乙醇，以及減少分離沉淀DNA的離心時間

32、，解決了由于淀粉及其他多糖與DNA的結(jié)合和共沉淀而導致的產(chǎn)率低的問題。3.2 去除多酚類雜質(zhì)“頑拗植物”中除了富含多糖外，多酚及其他次生代謝物也是DNA提取的中很棘手的問題。酚類化合物是指芳香烴中苯環(huán)上的氫原子被羥基或功能衍生物取代所生成的化合物，是植物體內(nèi)重要的次生代謝物，廣泛分布于植物組織中。在DNA提取實驗中，組織研磨時，酚類物質(zhì)容易氧化并與DNA的蛋白質(zhì)及核酸共價結(jié)合，而產(chǎn)生很難與細胞器分開的膠狀物質(zhì)，使DNA不再適于PCR擴增和限制性酶切等后續(xù)分析27。對植物中酚類化合物的去除，一般是在提取DNA時加入適量的抗氧化劑和螯合劑，如在提取緩沖液中加入巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘

33、肽及抗壞血酸等巰基試劑，在液氮研磨及提取液中加入高子螯合劑PVP（聚乙烯吡咯烷酮）或PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮）等能絡合多酚和萜類物質(zhì)，再由離心或氯仿抽提出去，都能有效的防止多酚物質(zhì)氧化成醌類，避免溶液發(fā)生褐變。Aline Borges等 Aline Borges, Mariana Silva Rosa,Gustavo Henrique Recchia, et al. CTAB METHODS FOR DNA EXTRACTION OF SWEETPOTATO FOR MICROSATELLITE ANALYSISJ. Agric. (Piracicaba, Braz.), 2009, 66(

34、4): 529-534.在用CTAB法提取甘薯DNA時，將-巰基乙醇的濃度從1%提高到了3%，并且指出在溫箱中干燥DNA時，較低的溫度對于獲得較高質(zhì)量的DNA也是很重要的。Kamal Sharma等 Kamal Sharma, Ajay Kumar Mishra, Raj Shekhar Misra. A simple and efficient method for extraction of genomic DNA from tropical tuber cropsJ. African Journal of Biotechnology, 2008, 7(8):1018-1022.，在研究熱

35、帶薯類基因組DNA的提取時提出了一個簡單而高效的方法。即改良CTAB法，其關鍵的步驟中就包括加入：2%-巰基乙醇和2% PVP，以消除多酚類物質(zhì)的影響。丁曉東等 丁曉東, 呂柳新. 從頑拗植物荔枝中提取基因組DNA技術(shù)的研究J. 應用與環(huán)境生物學報, 2000, 6(2):142145.在進行從“頑拗植物”荔枝中提取基因組DNA技術(shù)的研究時發(fā)現(xiàn)，為了避免多酚等雜質(zhì)被氧化，有很關鍵的兩步：第一是用液氮研磨材料后要立刻轉(zhuǎn)入核分離液中，否則暴露在空氣中稍一化凍，材料就會很快發(fā)生褐變，棕褐色物質(zhì)就會不可逆地與DNA結(jié)合，影響DNA的質(zhì)量；第二是在65水浴過程中，溫度回升會使多酚氧化酶恢復活性，這時要避

36、免材料與空氣接觸，管壁和管蓋上不能殘留植物組織，在液面用一層新鮮的核分離液來隔離空氣，在水浴過程中盡量不要搖動eppendorf管，可最大程度上防止多酚的氧化。其次還根據(jù)多酚等次生物質(zhì)主要分布于細胞質(zhì)和液泡中這一特點，在裂解細胞核之前先破碎細胞以除去細胞質(zhì)中的雜質(zhì)，這樣得到的DNA雖然產(chǎn)率降低，但純度更高，完整性更好。此外，還利用活性炭在高溫（65）對色素等雜質(zhì)有很強的吸附力，在裂解液中加入了2 mg活性炭粉末，也在一定程度上減輕了多酚類雜質(zhì)的影響。3.3 去除蛋白質(zhì)及RNA雜質(zhì)生化試驗表明，DNA在紫外區(qū)有強的光吸收，最大吸收波長為260 nm，而蛋白質(zhì)的為280 nm。天然雙鏈DNA的紫外

37、吸光值OD260/OD280應該大約等于1.8，小于1.8說明提取的DNA中可能有蛋白質(zhì)及酚類的污染，大于1.8則說明提取的DNA中可能還混有RNA 劉萍, 代紅軍, 張立杰等. DNA提取方法與植物種類的效應比較J. 寧夏農(nóng)林科技, 1998, (1):15-18.。馬艷芝等 馬艷芝, 張玉星. 梨屬植物基因組DNA提取部位對RAPD擴增的影響J. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2009, 22(4):1042-1045.在研究“頑拗植物”梨屬植物基因組DNA提取部位對RAPD擴增的影響時指出，DNA模板中含有較少量的RNA和蛋白質(zhì)不會影響RAPD的擴增結(jié)果，因為影響RAPD擴增的DNA雜質(zhì)往往不是RNA

38、或蛋白質(zhì)這些大分子物質(zhì)，而是多糖類和酚類等小分子物質(zhì)。即使如此，除去DNA中混雜的蛋白質(zhì)及RNA，得到純度更高的DNA對其他分子生物學的后續(xù)研究仍然是必須的。Sghaier ZIDANI等32在研究珍珠稗葉片基因組DNA提取法時對于大部分的蛋白質(zhì)是通過在提取液中加入的氯仿和/或苯酚使其變性沉淀而除去，RNA則通常是用熱的RNase A來消化。肖婷婷等 肖婷婷, 朱艷, 葉波平等. 鳶尾屬藥用植物總DNA提取方法的比較研究J. 中國野生植物資源, 2010, 29(3): 46-50.在鳶尾屬藥用植物總DNA提取方法的比較研究中還提出醋酸鉀是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑，相比用氯仿-異戊醇分層反復抽提去除

39、蛋白質(zhì)的方法，操作更加方便、省時，反應更加溫和，避免了DNA不必要的污染或損失。周鳳等25，在研究4種金絲桃屬植物基因組DNA提取及RAPD分析時提出高濃度K+有利于SDS與蛋白質(zhì)形成復合物，再經(jīng)離心或過濾得以除去。得到的DNA純度較理想，OD260/OD280值都在1.852.0之間，DNA得率高，用于RAPD擴增的結(jié)果也比較好。Kamal Sharma等34，在研究熱帶薯類基因組DNA的提取時使用改良CTAB法，及加入PEG和蛋白酶K來完全去除了蛋白質(zhì)污染。黃萱等 黃萱, 高麗美, 張永彥等. 一種優(yōu)化的植物總DNA提取方法J. 西北植物學報, 2004, 24(6):1103-1106.，在研究一種優(yōu)化的植物總DNA提取方法時對前人使用RNase A的步驟作了適當?shù)恼{(diào)整，