《科研儀器學(xué)》總復(fù)習(xí)

1、一、名解1、流式細(xì)胞術(shù)：利用流式細(xì)胞儀，對(duì)處于快速直線流動(dòng)的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性定量分析、分選的技術(shù)。2、生物芯片（DNA芯片或基因芯片）：DNA雜交探針技術(shù)與半導(dǎo)體工業(yè)技術(shù)相結(jié)合。將大量探針分子固定于支持物上后與帶熒光標(biāo)記的DNA樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。3、RCF（相對(duì)離心力）：在離心場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是“g”。4、冷凍干燥冷凍干燥（以下簡(jiǎn)稱凍干）就是將含水物質(zhì)，先凍結(jié)成固態(tài)，而后使其中的水分從固態(tài)升華成氣態(tài)，以除去水分而保存物質(zhì)的方法。5、凍干曲線將擱板溫度與制品溫度隨時(shí)

2、間的變化記錄下來(lái)，即可得到凍干曲線。比較典型的凍干曲線系將擱板升溫分為兩個(gè)階段，在大量升華時(shí)擱板溫度保持較低，根據(jù)實(shí)際情況，一般可控制在-10至+10之間。第二階段則根據(jù)制品性質(zhì)將擱板溫度適當(dāng)調(diào)高，此法適用于其熔點(diǎn)較低的制品。6PCR技術(shù)PCR技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其基本原理是根據(jù)細(xì)胞分裂中DNA的半保留復(fù)制機(jī)理，體外合成目的DNA片段的方法。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。7RT-PCRRT-PCR指逆轉(zhuǎn)錄PCR, 是指從RNA或mRNA直接擴(kuò)增獲得目的DNA片段的過程.8熒光定量PCR通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)

3、合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。9分子篩層析技術(shù)凝膠顆粒內(nèi)部呈網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)難以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，主要從凝膠顆粒的間隙里通過，所受阻滯作用小，所以大分子蛋白質(zhì)遷移速度快，先流出凝膠 。分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)則容易進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，所受阻滯作用大，所以小分子蛋白質(zhì)遷移速度慢，后流出凝膠，從而將分子質(zhì)量大小不同的蛋白質(zhì)分開。10離子交換層析技術(shù)：蛋白質(zhì)是兩性分子，在一定的pH條件下帶有電荷，不同的蛋白質(zhì)所帶有電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。這樣，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物流經(jīng)帶電凝膠時(shí)，電荷吸引作用小的蛋白質(zhì)先流過，而電荷吸引作用大的蛋

4、白質(zhì)后流過凝膠，從而把不同的蛋白質(zhì)分開。 11吸附層析技術(shù)由于不同的蛋白質(zhì)所含有的氨基酸的種類和數(shù)目不同，分子表面的極性氨基酸和非極性氨基酸的數(shù)目、分布區(qū)域不同，因此它與分子比表面積大的吸附劑間的相互作用力大小不同。根據(jù)此原理對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。 12蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組(proteome)是指基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其存在方式。13雙向電泳技術(shù)第一向:等電聚焦（IEF）：等電聚焦是利用蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線形pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。第二向:SDS-PAGE電泳：SDS-PAGE電泳是根據(jù)SDS和還原試劑將蛋白質(zhì)分子解聚后亞基的大小，在恒定的pH緩沖系統(tǒng)中的

5、分離。經(jīng)過雙向電泳能將蛋白質(zhì)在一個(gè)二維平面分開。14生物質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為廣泛使用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比（M/Z）的差異來(lái)分離并確定分子質(zhì)量。質(zhì)譜技術(shù)能從復(fù)雜的樣本中定性、定量分析蛋白質(zhì)，其靈敏度高，可達(dá)到fmol(10-15)乃至amol(10-18)，速度快，現(xiàn)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究中主要的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。15肽質(zhì)量指紋圖譜MALDI-TOF-MS常用于蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemass finger printing，PMF)鑒定。PMF是指蛋白質(zhì)被酶切位點(diǎn)專一的蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白質(zhì)的

6、氨基酸序列不同，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具特征性，所以稱為指紋圖譜(finger printing)。16基質(zhì)輔助離子化技術(shù)試樣溶解或懸浮于基質(zhì)中，激光束輻射到基質(zhì)和試樣分子上?；|(zhì)吸收激光束能量后汽化，部分試樣分子伴隨基質(zhì)的汽化而解吸?；|(zhì)吸收大部分激光能量，減少了試樣分子被激光能量破壞及過度電離成碎片離子。17超聲空化超聲波清洗的基本原理是基于超聲在液體中的空化作用，當(dāng)聲壓或聲強(qiáng)達(dá)到一定值時(shí)，清洗液中的氣泡迅速增長(zhǎng)，然后突然閉合。在氣泡閉合時(shí)，產(chǎn)生沖擊波，在氣泡周圍產(chǎn)生10121013Pa的壓力及局部高溫，這種物理現(xiàn)象稱為超聲空化18、基因槍法又稱生

7、物彈法或微粒槍法、微粒轟擊法，是依賴高速度的金屬顆粒將外源基因引入活體細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。19、Western blot(蛋白質(zhì)印跡技術(shù)) 將蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍膜或其他膜上，用抗體作為探針與之雜交，反應(yīng)之后用放射自顯影或底物顯色來(lái)檢測(cè)是否與抗體特異性結(jié)合的抗原。與DNA和RNA不同的是，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移方可完成，反應(yīng)時(shí)用堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶標(biāo)記或同位素標(biāo)記第二抗體， 二、填空1、使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞DNA、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量用（線性）放大器，檢測(cè)細(xì)胞表面表面抗原、膜受體分布（對(duì)數(shù)）放大器。2、影響DNA測(cè)序的因素：模板

8、的影響、循環(huán)測(cè)序反應(yīng)條件、電泳的影響。3、染色細(xì)胞核的染料：Hoechst33258（藍(lán)）、DAPI（藍(lán)）、FITC（綠）、Propodium Iodide（紅）、CY3（紅）。4、細(xì)胞融合的方法（電融合、聚乙二醇融合、病毒融合）。5、激光共聚焦顯微鏡的原理是利用（一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光）的成像。6、細(xì)胞穿孔的方法（電穿孔、磷酸鈣沉淀法、激光鉆孔法、微射彈法）。7、酶標(biāo)儀中的光學(xué)檢測(cè)方法（光度測(cè)定、熒光、時(shí)間分辨熒光、熒光偏振、化學(xué)發(fā)光）。8、DNA測(cè)序的主要方法（新生鏈的熒光標(biāo)記、雙脫氧末端終止法）。9、用于提取純化生物大分子理化性質(zhì)的離心機(jī)（分析性離心機(jī)），用于

9、實(shí)驗(yàn)的（制備型離心機(jī)）。10、流式細(xì)胞術(shù)前向散射（FSC，小角散射），大小與細(xì)胞直徑成正比，細(xì)胞越大，F(xiàn)SC越大；側(cè)向散射（SSC，90°散射），與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)成正比，胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜質(zhì)量越大，SSC越大。11、Ca2+熒光指示劑包括：Fura-2、indo-1、Quin-2。12、全自動(dòng)DNA測(cè)序儀主要包括電泳系統(tǒng)、激光器和熒光檢測(cè)系統(tǒng)；大致可分為自動(dòng)進(jìn)樣器區(qū)、凝膠塊區(qū)和檢測(cè)區(qū)等結(jié)構(gòu)功能區(qū)。13、全自動(dòng)DNA測(cè)序儀根據(jù)電泳方式的不同分為平板型電泳和毛細(xì)管電泳兩種儀器類型14、DNA測(cè)序過程包括：分離純化模板DNA、DNA模板定量分析、測(cè)序反應(yīng)、測(cè)序反應(yīng)后純化、on-line變性

10、、毛細(xì)管電泳和檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。15、DNA測(cè)序過程中，用熒光標(biāo)記新生鏈時(shí)，分為多色標(biāo)記法和單色標(biāo)記法；根據(jù)標(biāo)記部位不同，又分為熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法。16、激光共聚焦顯微鏡由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成。17常規(guī)PCR技術(shù)包括變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟。18常規(guī)PCR反應(yīng)體系由緩沖液、模板DNA、引物、4種脫氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶和Mg2+組成。19蛋白質(zhì)的分離純化方法中，透析、超過濾、分子篩層析、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等就是依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離純化蛋白質(zhì)的。20蛋白質(zhì)的分離純化方法中，等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、等電聚焦電泳等都是依據(jù)不

11、同蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)不同來(lái)分離純化蛋白質(zhì)； 21蛋白質(zhì)細(xì)分級(jí)方法有分子篩層析、離子交換層析、親和層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向電泳、毛細(xì)胞電泳、 等電聚焦電泳等22蛋白質(zhì)粗分級(jí)方法有硫酸銨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀、超速離心、等電點(diǎn)沉淀、透析、超濾等。23蛋白質(zhì)組研究核心技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)(如雙向電泳和多維液相層析)、蛋白質(zhì)鑒定方法(如氨基酸序列分析和質(zhì)譜技術(shù)）和生物信息學(xué)技術(shù)。24質(zhì)譜儀關(guān)鍵部件是離子源和質(zhì)量分析器是兩個(gè)關(guān)鍵的部件。其中質(zhì)量分析器決定著質(zhì)譜的準(zhǔn)確度、靈敏度和分辨率等。25核酸分子雜交探針標(biāo)記有同位素和非同位素標(biāo)記兩種，其中，非同位素標(biāo)記物主要有生物素、地高辛配體、熒光素等。2

12、6.電磁力平衡式電子天平最有代表性，其基本結(jié)構(gòu)由托盤、磁鐵、線圈、橫梁、防護(hù)罩等組成。27國(guó)家對(duì)分析實(shí)驗(yàn)室的用水規(guī)格進(jìn)行了技術(shù)規(guī)定，將其分為三個(gè)級(jí)別。其中一級(jí)水用于要求嚴(yán)格的分析實(shí)驗(yàn)，如液相色譜分析用水等；二級(jí)水用于無(wú)機(jī)痕量分析，如原子吸收光譜分析用水等；三級(jí)水用于一般化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)。28.超聲波破碎儀由超聲波發(fā)生器和換能器兩部分組成。29.CO2培養(yǎng)箱使用時(shí)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有：二氧化碳濃度、濕度、溫度。30.凍干機(jī)按系統(tǒng)可分為制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)和控制系統(tǒng)四個(gè)主要部分。31.高效液相色譜儀總體可分為4個(gè)部分，即進(jìn)樣系統(tǒng)、高壓輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。32.超凈工作臺(tái)按其工作性能分

13、為兩大類：一類為正壓型超凈工作臺(tái)，另一類生物安全超凈工作臺(tái)，又稱為生物安全柜。34.影響電子天平稱量精度的因素有預(yù)熱時(shí)間、預(yù)壓、讀數(shù)時(shí)間、樣品本身自然物理特性和變化造成的影響。35.水的純化技術(shù)：蒸餾、離子交換、反滲透、電滲析、電析去離子技術(shù)、微孔過濾、消毒滅菌。36.影響移液器準(zhǔn)確性的因素：操作錯(cuò)誤、移液器損壞、操作條件的影響。三、簡(jiǎn)答1 PCR的原理DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)、溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP，可完成特定基因的體外復(fù)制。高溫變性，低溫退火，適溫延伸2 流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)。1、實(shí)現(xiàn)對(duì)單列細(xì)胞

14、的檢測(cè)2、實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)3、多參數(shù)、多色熒光分析使對(duì)細(xì)胞識(shí)別技術(shù)更精確4、可定性定量分析細(xì)胞5、分選特定功能、性狀的細(xì)胞3 電穿孔儀與細(xì)胞融合儀的基本原理。電穿孔儀：細(xì)胞膜基本上是一絕緣體，膜兩側(cè)浸在含離子的電解質(zhì)溶液中，在外加電場(chǎng)時(shí)，膜兩邊的電解質(zhì)離子極化，形成外加膜電位差。高壓電脈沖擊穿細(xì)胞膜后，磷脂雙分子層和細(xì)胞膜均可復(fù)原。細(xì)胞膜的復(fù)原不但與脂肪分子的排列和相互間引力有關(guān)，還與其他重要因素有關(guān)，如膠體滲透作用、溶液離子作用和膜蛋白的影響等。細(xì)胞融合儀：通過非均勻電場(chǎng)的電介質(zhì)電泳作用，建立細(xì)胞(原生質(zhì)體)間的緊密接觸，形成細(xì)胞串。再利用高壓脈沖的可逆擊穿效應(yīng)使接觸區(qū)質(zhì)膜上形成微孔，胞質(zhì)通過

15、微孔融合。4 流式細(xì)胞儀的構(gòu)成模塊。流動(dòng)室與液流系統(tǒng)、光源與光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集與信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng)、分選系統(tǒng)。5 熒光檢測(cè)酶標(biāo)儀的主要模塊。1、一個(gè)激發(fā)光源（鹵素?zé)綦療?、激光?、熒光色團(tuán) (染料)3、波長(zhǎng)選擇元件：濾光片對(duì)或光柵(區(qū)分激發(fā)光和發(fā)射光）4、檢測(cè)發(fā)射光的檢測(cè)器 (光電倍增管, PMT)6 超速離心機(jī)的主要使用注意事項(xiàng)。1、離心前預(yù)冷轉(zhuǎn)子2、超速離心時(shí)，液體一定要加滿離心管，避免離心管變形3、離心后清潔離心機(jī)腔體和轉(zhuǎn)頭，并擦干腔內(nèi)冷凝水，打開門，直至腔內(nèi)恢復(fù)常溫7簡(jiǎn)述影響點(diǎn)穿孔儀和細(xì)胞融合儀的因素。1、采用指數(shù)型衰減波優(yōu)于使用方形波2、達(dá)到臨界電壓，否則無(wú)法擊穿細(xì)胞膜3

16、、對(duì)于細(xì)菌由于有外膜，臨界電壓需要加大12個(gè)數(shù)量級(jí)。8分光光度計(jì)理想的光源條件是：1、提供連續(xù)的輻射；2、光強(qiáng)度足夠大；3、在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長(zhǎng)有明顯變化；4、光譜范圍寬；5、使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格低。9、雙脫氧鏈末端終止法的原理：其原理是利用DNA的體外合成過程，但與普通PCR不同的是，雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序反應(yīng)中除有-脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入2-雙脫氧核苷三磷酸（2-ddNTP），由于沒有-OH，不能進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，使正在延伸的DNA鏈在此終止。由于存在ddNTP與dNTP的競(jìng)爭(zhēng)，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長(zhǎng)度不同的多核苷酸片段，通過電泳分離后可讀出新生DNA鏈的序列10簡(jiǎn)述熒光

17、定量 PCR定量原理及計(jì)算方法反應(yīng)最初，雖然產(chǎn)物是指數(shù)增長(zhǎng),但是熒光處于背景水平，檢測(cè)不到熒光增加.當(dāng)累積了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)時(shí)，這個(gè)循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù)，即CT。由于CT值處于指數(shù)期內(nèi)，這時(shí)的反應(yīng)成份不會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，因此熒光定量PCR結(jié)果是可靠的，可以準(zhǔn)確地反應(yīng)體系中模板的初始量。如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距由等式“2n=稀釋倍數(shù)“決定； n為閾值線上擴(kuò)增曲線之間的循環(huán)數(shù)（CT的差值）例如：10倍稀釋的DNA樣品， 2n=10 因此n=3.32，即CT值相差3.32個(gè)循環(huán)。11熒光定量PCR的應(yīng)用（1）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量，計(jì)算初始模板量（2）基礎(chǔ)研究的基

18、因表達(dá)分析研究（3）臨床病原體檢測(cè)：病人體液中目標(biāo)基因的檢測(cè)：病毒,寄生蟲,細(xì)菌（4）食品衛(wèi)生檢疫：a.轉(zhuǎn)基因食品的檢疫：根據(jù)轉(zhuǎn)入基因的特異性區(qū)段設(shè)計(jì)探針b.食品中病原微生物的檢測(cè) 12蛋白質(zhì)分離純化與鑒定的主要步驟 （1） 選擇實(shí)驗(yàn)材料（2） 實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理 （3） 蛋白質(zhì)的提取 （4） 蛋白質(zhì)粗分級(jí) （5） 蛋白質(zhì)細(xì)分級(jí) （6） 蛋白質(zhì)的鑒定 13蛋白質(zhì)鑒定的相關(guān)要素（1）蛋白質(zhì)分子質(zhì)量（2）等電點(diǎn)（3）氨基酸組成及其順序（4）免疫特性（5）結(jié)晶特性（6）生物學(xué)功能14核酸分子雜交技術(shù)的原理有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時(shí)，其相應(yīng)同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如把一段已

19、知基因（DNA或RNA）核酸序列用合適標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe), 與變性后的單鏈基因組DNA或RNA進(jìn)行雜交。再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測(cè)出來(lái)，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。15電子天平的工作原理基于通電導(dǎo)線在磁場(chǎng)中受到安培力的作用。當(dāng)秤盤上放有被稱量物體時(shí)，秤盤向下發(fā)生線性位移，觸動(dòng)電磁傳感器，使原來(lái)處于平衡狀態(tài)的兩個(gè)光敏三極管在發(fā)光二極管的光量發(fā)生變化時(shí)產(chǎn)生電流，此電流經(jīng)放大后反饋到磁鐵內(nèi)的線圈中，使受力增大，將秤盤托起，恢復(fù)至平衡位置。此時(shí)流經(jīng)線圈的電流通過取樣電阻時(shí)，產(chǎn)生電壓降，電壓值與被稱量

20、物體的質(zhì)量成正比。電壓信號(hào)經(jīng)過放大、濾波等處理后，進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換。電流模擬信號(hào)轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號(hào)后，再經(jīng)芯片處理，最終在顯示器上顯示出質(zhì)量值。16.基因擴(kuò)增的技術(shù)設(shè)備組成。由三部分構(gòu)成：模板DNA制備所需設(shè)備，主要為高速微量離心機(jī)或高速冷凍離心機(jī)；PCR基因擴(kuò)增儀；DNA擴(kuò)增結(jié)果判讀和測(cè)定設(shè)備，主要有水平低壓電泳儀、PCR核酸電泳槽以及紫外透射儀和DNA微量熒光計(jì)等。17.使用電子天平的注意事項(xiàng)1)在稱量之前，特別是稱量大量物質(zhì)或連同容器一起稱量時(shí)，一定要判斷所稱重總量是否在使用天平的稱量范圍之內(nèi)，如超出稱重范圍，往往會(huì)引起天平故障。2) 精確度高的天平常會(huì)因環(huán)境空氣流動(dòng)而引起稱量結(jié)果漂移，造成測(cè)定

21、結(jié)果不穩(wěn)定，有些型號(hào)的儀器帶有調(diào)整功能，可縮短稱量時(shí)間。3) 電子天平屬精密儀器，應(yīng)避免震動(dòng)，減少移動(dòng)。4) 稱量結(jié)束后在取走稱量物之前應(yīng)先關(guān)閉電源。5) 天平周圍及稱量盤面應(yīng)保持清潔。18.使用高壓滅菌鍋的注意事項(xiàng)1、易燃，易爆物品，禁用高壓蒸氣滅菌；銳性器械，不宜用此法滅菌；2、敷料包包扎及體積的影響：包裹不應(yīng)過大、過緊；捆扎不宜過緊；包裝使用的容器宜小而淺，并應(yīng)帶有通氣孔。瓶裝液體滅菌時(shí)，要用玻璃紙和紗布包扎瓶口；如有橡皮塞時(shí)，應(yīng)插入針頭排氣；3、物品排列疏密的影響：消毒物品的體積不應(yīng)超過滅菌室容積的85。4、降溫時(shí)待溫度自然降至60以下再打開箱門取出物品，以免因溫度過高而驟然降溫導(dǎo)致玻

22、璃器皿炸裂。5、在滅菌過程中，應(yīng)注意排凈鍋內(nèi)冷空氣，鍋內(nèi)冷空氣如排放不凈，會(huì)影響滅菌效果，達(dá)不到徹底滅菌的目的。因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬海?，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。6、在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26kJ的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。7、由于高壓蒸汽滅菌時(shí)，要使用溫度高達(dá)120、兩個(gè)大氣壓的過熱蒸汽，

23、操作時(shí)，應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，每次滅菌前，應(yīng)檢查安全閥的性能，嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作，以防壓力過高發(fā)生爆炸，保證安全使用。8、一般認(rèn)為按常規(guī)操作消毒物品就能無(wú)菌，這實(shí)際是一種錯(cuò)誤觀念。按常規(guī)操作只是一種正常消毒過程，并不能證明消毒物品已全部無(wú)菌，因此還要對(duì)滅菌效果進(jìn)行測(cè)定。最普通的檢驗(yàn)方法是將滅菌培養(yǎng)基放在37溫箱培養(yǎng)24小時(shí)若無(wú)雜菌生長(zhǎng)說明滅菌效果良好。19.超低溫冰箱警報(bào)器啟動(dòng)報(bào)警的原因檢查電源是否有問題或插頭是否被拉出插座；檢查內(nèi)部溫度計(jì)是否超出合適的范圍；檢查是否一次性置人物品過多。20.凍干過程中有兩個(gè)放熱過程和兩個(gè)吸收過程。液體制品放出熱量凝固成固體制品；固體制品在真空下吸收熱量升華成水蒸氣

24、；水蒸氣在冷凝器中放出熱量凝華成冰霜；凍干結(jié)束后冰霜在冷凝器中吸收熱量熔化成水。21.水蒸氣的流動(dòng)阻力來(lái)自以下幾個(gè)方面：1)產(chǎn)品內(nèi)部的阻力。水分子通過已經(jīng)干燥的產(chǎn)品產(chǎn)生的阻力，這個(gè)阻力的大小與干燥層的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)品的種類、成分、濃度、保護(hù)劑等有關(guān)。2)容器阻力。容器的阻力主要來(lái)自瓶口，因?yàn)槠靠谔幗孛娣e較小，瓶口處可能還有某些其他物品如帶槽的橡皮塞、紗布等造成阻力?？傊?，瓶口截面積越大則阻力越小。3)機(jī)器本身的阻力。主要是凍干箱與冷凝器之間管道的阻力，管道粗、短、直則阻力小。另外阻力還與凍干箱和冷凝器的結(jié)構(gòu)和幾何形狀有關(guān)22.基因槍的基本原理經(jīng)適當(dāng)處理后，使DNA液均勻地吸附在或包裹于微小的鎢粉或金

25、粉顆粒表面，利用基因槍的火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅(qū)動(dòng)力，發(fā)射出微彈與DNA的復(fù)合體，擊中并高速穿透真空室中受體細(xì)胞的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到將吸附于微彈上的外源DNA導(dǎo)人細(xì)胞或原生質(zhì)體，獲得整合與表達(dá)的目的。微彈復(fù)合體對(duì)受體細(xì)胞造成的損傷可以修復(fù)。23.激光共聚焦顯微鏡的工作原理？在它的光收集通道上包括兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng)：一是傳統(tǒng)的光學(xué)組件，二是共聚集光圈。所謂Confocal共聚焦是指檢測(cè)聚集光斑與檢測(cè)點(diǎn)完全重合。這種光學(xué)結(jié)構(gòu)保證了在聚集外部的光線不能達(dá)到信號(hào)探測(cè)器中。在共聚焦圖像系統(tǒng)中的基本原則是：“只有聚集點(diǎn)是亮的，其余都是暗的”。由于這種簡(jiǎn)單明了的原理使得它的應(yīng)用中有極大的

26、靈活性。通過改變聚焦光圈，可以改變掃描光束的密度從而優(yōu)化所選用的光源。通過光級(jí)NA透鏡最小可形成大約0.5微米的掃描光斑。自由變換聚焦尺寸在檢測(cè)較弱熒光時(shí)極為重要，它可以在圖形質(zhì)量及熒光亮度之間相互協(xié)調(diào)。四、問答1、激光共聚焦顯微鏡相較于普通顯微鏡的優(yōu)勢(shì)在哪里；此外，請(qǐng)簡(jiǎn)述激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用。 激光共聚焦顯微鏡能夠形成完全聚集的3D樣本圖形。定位不同的熒光染料在3D樣本圖形中的著色位置。精確測(cè)量二維、三維平面及空間結(jié)構(gòu)。具有識(shí)別空間位置的能力從而進(jìn)行三維坐標(biāo)定位。節(jié)省標(biāo)本處理時(shí)間很少需要進(jìn)行樣本包埋用顯微切片。應(yīng)用：1、檢測(cè)被一種或多熒光染料標(biāo)記的樣本2、檢測(cè)樣本熒光著色位置或其他特征3、

27、完整觀察新鮮或固定樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)4、在活細(xì)胞或組織中描繪標(biāo)記離子的熒光染料5、全程監(jiān)控GFP轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞或組織2、冷凍干燥機(jī)的工作原理及對(duì)凍干制品的質(zhì)量要求。 冷凍干燥機(jī)的工作原理是將被干燥的物品先凍結(jié)到三相點(diǎn)溫度以下，然后在真空條件下使物品中的固態(tài)水份（冰）直接升華成水蒸氣，從物品中排除，使物品干燥。物料經(jīng)前處理后，被送入速凍倉(cāng)凍結(jié)，再送入干燥倉(cāng)升華脫水，之后在后處理車間包裝。真空系統(tǒng)為升華干燥倉(cāng)建立低氣壓條件，加熱系統(tǒng)向物料提供升華潛熱，制冷系統(tǒng)向冷阱和干燥室提供所需的冷量。 本設(shè)備采用高效輻射加熱，物料受熱均勻；采用高效捕水冷阱，并可實(shí)現(xiàn)快速化霜；采用高效真空機(jī)組，并可實(shí)現(xiàn)油水分離；采用并

28、聯(lián)集中制冷系統(tǒng)，多路按需供冷，工況穩(wěn)定，有利節(jié)能；采用人工智能控制，控制精度高，操作方便。 對(duì)凍干制品的質(zhì)量要求是：生物活性不變、外觀色澤均勻、形態(tài)飽滿、結(jié)構(gòu)牢固、溶解速度快，殘余水分低。要獲得高質(zhì)量的制品，對(duì)凍干的理論和工藝應(yīng)有一個(gè)比較全面的了解。凍干工藝包括預(yù)凍、升華和再凍干三個(gè)分階段。合理而有效地縮短凍干的周期在工業(yè)生產(chǎn)上具有明顯的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。3、分光光度計(jì)吸收池的使用注意事項(xiàng)： 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在 1洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個(gè)小刷子清洗杯子。 嚴(yán)禁用手指

29、觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。 吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號(hào)。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測(cè)定吸光度“A0”，樣品杯換上樣品液后測(cè)定的吸光度為“A1”，則校正后的實(shí)際吸光度A為：A= A1-A0 高檔的分光光度計(jì)有自動(dòng)置零系統(tǒng)，可將二個(gè)杯子的偏差置零。其他重要附件：高檔分光光度計(jì)的樣品室還可以更換各種重要附件，用于各種特殊量測(cè)。如換上“積分球”，可用來(lái)檢測(cè)微弱透光和不透光的樣品。換上“凝膠掃描裝置”，可用于電泳凝膠膠條上樣品帶的掃描

30、測(cè)量。4、如何使用熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)：Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17KD)和兩個(gè)小亞基(12KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。

31、根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。5、如何使用分光光度計(jì)對(duì)核酸進(jìn)行定量。核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1 OD 的吸光值分別相當(dāng)于50g/ml的dsDNA，37g/ml的ssDNA，40g/ml的RNA，30g/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液

32、的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。6、熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法的異同點(diǎn)。1、都確定了4種熒光染料與4種ddNTP所終止的DNA片段之間的專一對(duì)應(yīng)關(guān)系2、熒光標(biāo)記引物法使熒光有色基團(tuán)標(biāo)記在長(zhǎng)短不同的DNA片段的端，可理解為熒光染料標(biāo)記過程和延伸反應(yīng)終止分別發(fā)生在同一DNA片段的兩端，且標(biāo)記發(fā)生在引物與模板的退火過程中，而終止是發(fā)生在片段延伸過程中，兩者在時(shí)間上有一定間隔3、熒光標(biāo)記終止底物法使標(biāo)記和終止過程合二為一，兩者在同一時(shí)間完成 4、在具體操作中，前者要求A、C、G、T四個(gè)反應(yīng)分別

33、進(jìn)行，而后者的四種反應(yīng)可以在同一管中完成 7、請(qǐng)比較蛋白質(zhì)與DNA測(cè)序過程的異同點(diǎn)。蛋白質(zhì)測(cè)序DNA測(cè)序測(cè)序中判斷的復(fù)雜性20種氨基酸且可能出現(xiàn)特殊的氨基酸4種核苷酸樣品的性質(zhì)不同蛋白質(zhì)和肽片段理化性質(zhì)相差很大，存在不溶性和變性的問題不同DNA片段理化性質(zhì)相差小，基本不存在不溶性和變性的問題對(duì)樣品量的依賴性常為主要限制因素只要建立了克隆，樣品量不成問題測(cè)序速度手工操作者一天完成約4-5個(gè)殘基的順序，自動(dòng)測(cè)序儀一天可完成約30個(gè)殘基的順序手工操作一天可完成數(shù)百個(gè)堿基的順序，自動(dòng)測(cè)序儀一天可完成數(shù)千堿基的順序測(cè)定準(zhǔn)確性常出現(xiàn)拼接和辨讀錯(cuò)誤準(zhǔn)確性高費(fèi)用高，對(duì)昂貴的儀器依賴性強(qiáng)較低，手工方法可滿足一般

34、測(cè)序要求8、影響電穿孔儀和電融合儀效率的因素(1) 電脈沖的幅度、時(shí)間和脈沖波形使細(xì)胞膜不穩(wěn)定而被擊破的最低電壓稱為臨界電壓。大致上14 kV/cm的電場(chǎng)加在半徑為10 m的動(dòng)物細(xì)胞上，即可產(chǎn)生膜的臨界電壓。植物細(xì)胞必須先把細(xì)胞壁去掉，剩下的原生質(zhì)體的穿孔和融合所需電壓與動(dòng)物細(xì)胞相近；細(xì)菌的外膜相當(dāng)強(qiáng)韌，所需臨界電壓也往往比普通動(dòng)物細(xì)胞高12個(gè)數(shù)量級(jí)。脈沖的幅度只是要求條件之一。脈沖的寬度也必須比膜的充電時(shí)間和膜的彈性復(fù)原時(shí)間長(zhǎng)，這樣才能保證孔道在脈沖以后有機(jī)會(huì)繼續(xù)開放一段時(shí)間。一般來(lái)說，寬度窄的脈沖，需要高幅度來(lái)彌補(bǔ)。太寬的脈沖往往會(huì)擊破融合區(qū)外的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，交流脈沖或多次脈沖能夠

35、充分利用脈沖電場(chǎng)的相向電泳壓力，所以往往比單個(gè)直流(方形)脈沖有效。如果穿孔用的電脈沖，在以峰電壓擊破細(xì)胞膜后能以較低的電壓維持孔道的短時(shí)間開放，則對(duì)提高穿孔效率有益，因此指數(shù)衰減的脈沖往往比同能量的方形脈沖有效。專門設(shè)計(jì)的脈沖形也許會(huì)比指數(shù)衰減形更有效，但指數(shù)衰減波形的脈沖最易制造，所以用途最廣。(2) 膠體滲透壓和細(xì)胞膨脹細(xì)胞被脈沖擊穿之后，水和一些離子可以自由進(jìn)入，但大分子卻不易通過擊穿的小孔。由于滲透壓的不平衡，水、部分離子和小分子會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞繼續(xù)膨脹而破裂。除非細(xì)胞膜在破裂前就復(fù)原。為避免細(xì)胞破裂，往往需要在細(xì)胞外的緩沖液加入大分子以維持滲透壓平衡。在很多情況下，允許細(xì)胞稍微

36、膨脹，會(huì)有助于引導(dǎo)藥物和分子進(jìn)入細(xì)胞，當(dāng)水或緩沖液進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，會(huì)把孔道擴(kuò)大，同時(shí)溶解在外液中的成分會(huì)隨水流被帶進(jìn)細(xì)胞。所以一般在穿孔之前，把細(xì)胞放人稍低滲透壓的緩沖液中，讓細(xì)胞略微膨脹，細(xì)胞膜的張力也因而增高，橫向張力可以幫助電壓力穿破細(xì)胞膜。已有張力的膜很容易擴(kuò)大，若用于電融合過程，初成的連接孔道也會(huì)較容易開擴(kuò)，因而促成融合。在轉(zhuǎn)染過程中，若需長(zhǎng)鏈的DNA或質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞，從理論上講，需要很長(zhǎng)時(shí)間，但由于細(xì)胞電穿孔后的復(fù)原時(shí)間僅幾十分鐘，即使電穿孔足夠大，也不可能完成這一過程。但在實(shí)驗(yàn)過程中，電穿孔的轉(zhuǎn)染效率比預(yù)期高很多。(3) 細(xì)胞膜的復(fù)原穿孔后細(xì)胞膜復(fù)原的時(shí)間和過程隨細(xì)胞而異，時(shí)間的長(zhǎng)短也

37、由復(fù)原期間的溫度、外液的滲透壓、所含離子和藥物來(lái)決定。細(xì)胞膜復(fù)原的時(shí)間長(zhǎng)些，有利于細(xì)胞外藥物的擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。對(duì)于有些操作過程，需要低溫來(lái)延緩復(fù)原時(shí)間。但在復(fù)原過程中，細(xì)胞膜仍然是有漏洞的，所以內(nèi)外的膠體滲透壓必須仔細(xì)調(diào)節(jié)。在這段時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞仍然非常脆弱，所以應(yīng)該避免機(jī)械振蕩，盡量避免使用移液管或離心操作。細(xì)胞外液所含的離子，一方面影響細(xì)胞復(fù)原期間的細(xì)胞生存，另一方面也影響細(xì)胞膜復(fù)原的速度。以上幾個(gè)最普通的因素，互相之間也有影響，例如，脈沖的強(qiáng)度和寬度大，孔也越來(lái)越多，藥物進(jìn)入快，融合的概率也高，但細(xì)胞對(duì)膠體滲透壓和離子平衡也敏感。因此無(wú)論穿孔或融合的效率，在脈沖電壓或?qū)挾壤^續(xù)增高的條件下，往

38、往會(huì)先達(dá)最高效率峰，然后急劇下降，原因就在于細(xì)胞死亡。最佳效率的條件是由多種因素匹配決定的，如果了解生物物理的原理，熟悉細(xì)胞的特性，就可以設(shè)計(jì)出適當(dāng)?shù)膬x器和程序，進(jìn)行電穿孔和電融合。9、PCR技術(shù)原理及特點(diǎn)：PCR技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其基本原理是根據(jù)細(xì)胞分裂中DNA的半保留復(fù)制機(jī)理，體外合成目的DNA片段的方法。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。其特點(diǎn)包括：（1）靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平；能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU；細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌（2）簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，24小時(shí)完成擴(kuò)

39、增（3）對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA10、蛋白質(zhì)分離純化的依據(jù)及其相應(yīng)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分子大小主要取決于蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目，透析、超過濾、分子篩層析、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等就是依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離純化蛋白質(zhì)的； 蛋白質(zhì)的帶電特性蛋白質(zhì)肽鏈的氨基末端、羧基末端、酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈R基以及堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈R基等，在不同的pH條件下會(huì)帶有不同的電荷，等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、等電聚焦電泳等都是以此為依據(jù)來(lái)分離純化蛋白質(zhì)； 蛋白質(zhì)的溶解特性大多數(shù)蛋白質(zhì)在水溶液中會(huì)形成穩(wěn)定的膠體溶液，易溶于稀酸、稀堿或稀鹽等，當(dāng)破壞膠體穩(wěn)定存在的條件時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出，硫酸銨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)分離等均依據(jù)此原理； 蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性：蛋白質(zhì)在一定的物理化學(xué)條件下會(huì)失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能以及部分理化特性等稱為變性，在變性條件不劇烈，某些蛋白質(zhì)在除去變性條件后會(huì)恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能即為復(fù)性。例如，采用尿素變性復(fù)性的方法從包含體中純化原核表達(dá)蛋白； 蛋白質(zhì)的結(jié)晶：天然蛋白質(zhì)在一定的物理化學(xué)條件下，濃度達(dá)到過飽和狀態(tài)時(shí)就會(huì)結(jié)晶析出，