石油脫硫微生物的篩選及特性研究

1、石油脫硫微生物的篩選及特性研究摘要從泰安某加油站采集土壤樣品，篩選到一株可以專一性降解二苯并囉 吩(dbt)的菌株，經(jīng)常規(guī)和生理生化鑒定判斷為紅球菌屬(rhodococcus sp.), 命名為yy-5o對(duì)dbt的降解產(chǎn)物經(jīng)分析為二疑基聯(lián)苯(2-hbp).二苯并囉楓 (dbto2)和硫酸根離子，完全符合“4s"途徑。產(chǎn)物用gibb' s試劑結(jié)合分光光 度計(jì)測(cè)試，測(cè)算出菌株的脫硫能力。脫硫試驗(yàn)表明，dbt濃度對(duì)菌株的脫硫能 力也有影響，dbt濃度過(guò)高，會(huì)抑制菌株的脫硫能力。一般在54h左右yy5 的酶活性開(kāi)始降低，在80 h左右完成脫硫。在以正十二烷、正十六烷、液體石 蠟、蔡和

2、柴油為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不旺盛，不能利用上述坯類作唯一碳源和能 源。說(shuō)明yy5在脫硫過(guò)程小不會(huì)明顯降低燃油的燃燒值。另外試驗(yàn)也表明，有 機(jī)氮對(duì)菌的脫硫活性有抑制作用。關(guān)鍵詞二苯并噬吩；微生物脫硫；篩選；紅球菌屬；脫硫率硫是地球上廣泛分布的元素2，約占地殼總質(zhì)量的0.052%o硫基本以化 合物的形式存在于各種礦物和化石燃料之屮，少量為單質(zhì)形式的硫磺?；剂?含硫量為0.1%6.0%o目前世界壞境問(wèn)題嚴(yán)重，各國(guó)都在著手研究環(huán)境問(wèn)題的解決方案。其中礦物 燃料燃燒生成硫化物，在大氣中形成酸用，污染土壤的同時(shí)，也破壞了陸地生物 圈的生態(tài)平衡。酸雨作為硫污染之一，對(duì)北歐地區(qū)的污染最為嚴(yán)重，導(dǎo)致湖泊屮 魚(yú)

3、類和浮游生物死亡，土壤表土營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)淋溶，生態(tài)受到嚴(yán)重?fù)p壞。2013年初 因?yàn)橹袊?guó)汽汕、柴汕質(zhì)量不合格，汽車尾氣排放污染空氣，導(dǎo)致北京，成都等交 通擁擠的城市形成經(jīng)久不散的大霧，不僅市民的生活出行受到影響，對(duì)身體健康 也有一定損害。此外，在石油的煉制過(guò)程小，輸送管線及相關(guān)設(shè)備都會(huì)受到原油 或憾分油屮硫的腐蝕1。加氫脫硫(hydrodesulfurization hds)法是目前常用的 化學(xué)脫硫法，其原理是通過(guò)催化過(guò)程將有機(jī)硫化物轉(zhuǎn)化成h2s氣體，該法的缺 點(diǎn)在丁反應(yīng)要求高(高溫高壓)、脫除不徹底、成本高，且難以達(dá)到現(xiàn)在嚴(yán)格的 污染排放標(biāo)準(zhǔn)。石油生物催化脫硫是利用微生物產(chǎn)生特定的酶選擇性地將油品屮

4、含硫化合 物轉(zhuǎn)化為水溶性硫化物，具有高度的選擇性，可以脫除hds技術(shù)難脫除的殘余 有機(jī)含硫化合物。而h不需催化劑，不會(huì)產(chǎn)生額外污染。低能耗，硫的回收率高。 目前生物脫硫研究技術(shù)的機(jī)理主要是以二苯并嗥吩(dbt,針狀結(jié)晶，熔點(diǎn) 99 °c,沸點(diǎn)332333 °c,聯(lián)苯及苯硫瞇結(jié)構(gòu))為模型化合物來(lái)表征的，在微 生物酶的作用下脫硫。生物催化dbt雜環(huán)類姪脫硫有2種氧化形式：c-c鍵斷裂氧化和c-s鍵斷裂 氧化。20世紀(jì)70年代初，kodama etc研究生物石油脫硫提!l! dbt生物降解的 “kodamf代謝途徑，雖然可從姪屮分離含硫化合物，但有機(jī)硫沒(méi)有從朵環(huán)類化 合物屮脫除，

5、反而降低了有價(jià)值桂的燃燒值。1989年kibne在研究igts細(xì)菌 脫除煤中有機(jī)硫時(shí)，從理論上提出了生物降解dbt的一種可能的“4s"代謝途徑: 二苯并嗥吩中的硫經(jīng)過(guò)4步氧化，反應(yīng)的硫中間體分別是dbt亞磯，dbt-w, dbt男基磺酸，最終生成2超基聯(lián)苯(2-hbp)o硫是以so2的形式從冇機(jī)物屮 除去的，對(duì)坯不發(fā)生降解。對(duì)不同的菌株，4s途徑并不完全相同，被認(rèn)為有2 種脫硫途徑，但共同的特點(diǎn)都是對(duì)cs鍵作用2。口前已經(jīng)有大量國(guó)內(nèi)外學(xué)者 投入研究35。據(jù)報(bào)道，采用bds可使油品硫含量最終指標(biāo)低于hds工藝10 倍，如從hds的0.1%降至bds的0.01%的硫含量。目而適合研究石油

6、脫硫的 菌株有：玫瑰紅球菌(rhodococcus rhodochrous )、紅串平紅球菌(rhodococcus.erythropolis)> 球形諾卡氏菌(nocardia globelula)、嗜熱芽他桿菌 (paenibacillus sp.)、谷氨酸棒桿菌(corynebacterium sp.)、戈登氏菌(gordona sp.)、 節(jié)桿菌(arthrobacter sp.)、球形芽抱桿菌(b.sphaericus)和枯草芽抱桿菌(bacillus subtilis)等。該文對(duì)加油站附近土壤中的脫硫微生物進(jìn)行篩選，并對(duì)其特性進(jìn)行 研究。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料1試驗(yàn)儀器。

7、紫外分光光度計(jì)、生物培養(yǎng)箱(lrh2252g)、微生物多用 培養(yǎng)箱(wdp)、超凈工作臺(tái)、無(wú)菌條件下g5漏斗真空抽濾。1.1.2試驗(yàn)樣品及培養(yǎng)基。樣品為采自泰安某加油站土壤2()份。富集培養(yǎng)基: nh4c1 (0.1 g/l), mgc12 (0.48 g/l), kh2po4 (0.32 g/l), cac12-2h2o (0.08 g/l), u油(5g/l),去離子水1 oooml, ph值7.072 滅菌后加無(wú)菌曝吩5 mlo分離培養(yǎng)基(g/l)：營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基。搖瓶基本培養(yǎng)基：廿油(10g/l), nh4c1 (5.0 g/l), kh2 po4 (6.3 g/l), k2hpo4

8、(810 g/l), mgc12-6h2o (12g/l),微量元素液 1 ml,維生素液 1 ml, 去離子水1 000 ml, ph值7.07.2,無(wú)菌嗥吩5 ml/l培養(yǎng)基(滅菌后分別加入), dbt2正十六烷液，500 mg/l dbt培養(yǎng)基(滅菌后分別加入)。微量元素液： fec13-4h2o (0.5 g/l), znc12 (0.5 g/l), mnc12-4h2o (0.5 g/l), namoo4-2h2o(0.1 g/l), cuc12 (0.05 g/l), coc12 (0.02 g/l), hc1 調(diào)節(jié) ph 值至 23。纟隹生素液:泛酸鈣(400 mg/l),肌醇(

9、200 mg/l),煙酸(400 mg/l),鹽 酸毗多辛(400 mg/l),復(fù)合維生素b (15 mg/l),去離子水1 000ml6o 1.2試 驗(yàn)方法1.2.1脫硫菌的富集和分離。從泰安煉油廠等地采集的土壤污染樣品，置于 dbt選擇培養(yǎng)基中(dbt濃度0.15 mmol/l),在恒溫27 °c條件下，100 r/min 振蕩富集培養(yǎng)3d。取培養(yǎng)物上清液在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)3d。取培養(yǎng)物高速離 心10 min,取上清液做gibb' s分析。取反應(yīng)呈陽(yáng)性的培養(yǎng)物接種于選擇培養(yǎng)基, 27 °c靜置培養(yǎng)3d。取生長(zhǎng)狀態(tài)好的單菌落培養(yǎng)物做gibb' s分析，有

10、藍(lán)色物質(zhì) 生成的即為口的菌株。1.2.2脫硫菌株的鑒定。形態(tài)特征：冇彎桿狀和桿狀2種形態(tài)，在牛肉膏 蛋白淼固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)中等，黃油狀黃色，菌落平坦，不透明，凸起，有光 澤，不產(chǎn)生水溶性色素，邊緣整齊。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基屮形成表面膜，培養(yǎng)液則 保持澄清。生理生化特征：按照常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)7進(jìn)行鑒定。1.2.3 16s rdna序列分析。以菌株基因組dna為模板，用16s rdna通用 引物擴(kuò)增得到近全長(zhǎng)的16s rdna.pcr產(chǎn)物測(cè)序后在national center for biotechnology information (ncbi)使用 clustal w version 118

11、 和 phyl ippackage programme進(jìn)行各序列間的同源性和進(jìn)化距離的分析與比較。1.2.4脫硫試驗(yàn)。準(zhǔn)備5個(gè)250 ml三角瓶，每個(gè)加入50 ml dbt濃度分別 為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/l 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,室溫 27 °c, 180 r/min 振蕩 培養(yǎng)。對(duì)照為不加dbt的yy-5菌株培養(yǎng)基，1 d后用正己烷萃取剩余的dbt。 4 °c, 8 000 r/min離心20 min,用氣相色譜分析dbt百分比。1.2.5菌株的脫硫特性研究。將培養(yǎng)液預(yù)處理后，用等體積二氯甲烷萃取， 30 min后8 000 r/min離心。在萃取

12、液中加入無(wú)水硫酸鈉脫水并干燥。用kd濃 縮器吹高純氮濃縮，50 °c水浴，gc-ms分析。dbt濃度對(duì)菌株yy5脫硫率 的影響。dbt脫硫試驗(yàn)步驟：取50 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基5個(gè)，加入dbt使?jié)舛确謩e 為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/l,室溫 27 °c。200 r/min 振蕩培養(yǎng)。菌株 yy5 的專一酶將dbt脫硫后，經(jīng)“4s”途徑的代謝終產(chǎn)物為2-hbp,與gibb' s試劑 反應(yīng)生成藍(lán)色靛酚衍主物，該衍主物在610 nm存在最大吸收峰。菌體離心后， 取上清液與gibb' s試劑反應(yīng)，再用722e分光光度計(jì)測(cè)定od610,通過(guò)吸光度

13、值與2-hbp的濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出培養(yǎng)液中2-hbp的濃度，以測(cè)算菌株的脫硫 能力。碳、氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)脫硫的影響。一是菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：取該菌株 培養(yǎng)物測(cè)出其最大吸光度。取生長(zhǎng)3 d后的菌株分別接種在10個(gè)三角瓶屮，室 溫?fù)u床培養(yǎng)。每隔5 h取一瓶稀釋10倍。測(cè)定最大吸光波長(zhǎng)的吸光度。畫(huà)出生 長(zhǎng)曲線，吋間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。二是在50 ml基木培養(yǎng)基屮，分別 加入1%的正十二烷、正十六烷、液體石蠟、蔡、柴油、甘油、葡萄糖、蔗糖、 可溶性淀粉、醋酸鈉為碳源，接種量2ml,室溫27 °c, 120 r/min搖床培養(yǎng)3 d 后，取樣分析。三是在搖瓶基本培養(yǎng)基中，分別加入牛肉膏、酵

14、母膏、蛋白豚、 氯化錢、硫酸鍍和磷酸二氫錢作氮源，接種量2ml, 30 °c, 120 r/min搖床培養(yǎng) 48 ho2結(jié)果與分析2生理生化特征對(duì)菌株yy5進(jìn)行生理生化鑒定，革蘭氏染色陽(yáng)性，水解淀粉酶陽(yáng)性，氧化 酶陰性，葡萄糖陽(yáng)性，亮氨酸陽(yáng)性，甘露糖陽(yáng)性，麥芽糖陽(yáng)性，谷氨酸陽(yáng)性，乙 醇陽(yáng)性。2.2 16s rdna 鑒定在 national center for biotechnology information (ncbi)使用 blastn 程序 比對(duì)，對(duì)給出的序列使用vector nti軟件制作進(jìn)化樹(shù)，yy5和紅球菌位于同一 個(gè)分支上，所以初步鑒定yy-5為紅球菌屬。2.3篩選

15、菌株的脫硫效杲觀察及產(chǎn)物分析在試驗(yàn)過(guò)程中觀察到，dbt在篩選到的脫硫菌作用下，逐漸變?yōu)榭扇苄晕?質(zhì)，后來(lái)部分形成了白色的沉淀。一般在80 h左右基木完成降解反應(yīng)。由gc-ms 分析得出3個(gè)保留時(shí)間分別為21.04、23.25、24.64 min。對(duì)應(yīng)的組分進(jìn)行離子掃 描分析,對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間為23.25、24.64、21.04 min。由此得出3個(gè)分子量170、 184、216o可以推定，分子量為184的化合物是dbt,分子量為170的是2-hbp, 分子量為216的是二苯并bwo將培養(yǎng)液離心后取上清液，加入二氯化鈔!，生成 了白色沉淀，再加稀硝酸，沉淀不溶解。說(shuō)明此降解反應(yīng)述牛成了硫酸根離子。 綜合產(chǎn)物說(shuō)明，此菌株脫硫過(guò)程完全符合“4s途徑二2.4 dbt濃度對(duì)脫硫率的影響從脫硫試驗(yàn)可以看出：dbt濃度過(guò)高反而抑制了菌株的生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制脫 硫率。如圖1所示，從脫硫率測(cè)定的試驗(yàn)中，吸光度即反映出菌株的生長(zhǎng)曲線。 dbt濃度反映菌株脫硫量。在菌株對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，對(duì)dbt的降解速度最快。 過(guò)了穩(wěn)定期后，dbt的降解越來(lái)越緩慢，在55 h后基本停止。2.5碳、氮源的影響按照慣例，液體石蠟代表有支鏈的飽和烷桂，止十二烷