基因操作的主要技術(shù)原理

1、第三章第三章 基因操作的主要技術(shù)原理基因操作的主要技術(shù)原理第一節(jié)第一節(jié) 核酸的分離與純化核酸的分離與純化n核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式存在的 n真核生物95%DNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，5%在細(xì)胞器 n75%的RNA存在于細(xì)胞質(zhì)，10%在核內(nèi)，15%在細(xì)胞器 nrRNA（8085%），tRNA及核內(nèi)小分子RNA（1015%），mRNA（15%）一、核酸分離提取的原則一、核酸分離提取的原則1. 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 2. 排除其它分子的污染排除其它分子的污染 n核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子n將其它生物大分

2、子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染降到最低 n排除其它核酸分子的污染 核酸提取的基本要求核酸提取的基本要求 n盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞 n減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解（過(guò)酸、過(guò)堿） n減少物理因素對(duì)核酸的降解（機(jī)械剪切力、高溫） n防止核酸的生物降解 提取核酸的一般程序提取核酸的一般程序: 破碎細(xì)胞 去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及多糖等 去除其它核酸分子 沉淀核酸，去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì) 純化核酸 核酸的質(zhì)量評(píng)估（電泳、D260/OD280，酶切） 二、質(zhì)粒二、質(zhì)粒載體的分離與純化載體的分離與純化 關(guān)鍵：關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體與宿主染色體DNA

3、分開分開 依據(jù)：依據(jù)：質(zhì)粒質(zhì)粒DNA比染色體比染色體DNA小得多，小得多，在在DNA提取過(guò)程中，染色體提取過(guò)程中，染色體DNA斷裂斷裂成片段成片段(線狀線狀)，而質(zhì)粒，而質(zhì)粒DNA仍保持超仍保持超螺旋構(gòu)型螺旋構(gòu)型 變性法提取質(zhì)粒變性法提取質(zhì)粒DNA的原理的原理 在變性條件（堿性或高溫)下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而cccDNA雖然互補(bǔ)鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。 當(dāng)變性條件恢復(fù)時(shí)，質(zhì)粒DNA迅速?gòu)?fù)性恢復(fù)天然構(gòu)型，染色體DNA難以復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過(guò)離心沉淀下來(lái)，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。堿變性法提取質(zhì)粒堿

4、變性法提取質(zhì)粒DNA的步驟的步驟收集細(xì)胞沉淀加入溶液I (50mM 葡萄糖, 25mMTris-HCl, 10mM EDTA, 45mg/mL 溶菌酶）加入溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS)加入溶液III (3M NaAc pH4.8)離心除去沉淀，得含質(zhì)粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白質(zhì)乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA在強(qiáng)堿性環(huán)境中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，cccDNA可發(fā)生不可逆變性關(guān)鍵：關(guān)鍵：盡可能地保持其高分子量盡可能地保持其高分子量細(xì)菌細(xì)菌 33004200kb 酵母酵母 15,000 kb果蠅果蠅 1.65x105 kb 人人 3x106 kb植物植物 2x1051x108 kb 天花病毒天

5、花病毒 288 kb痘病毒痘病毒 196 kb三、染色體三、染色體DNA的分離純化的分離純化CsCl密度梯度離心密度梯度離心原理：原理：nCsCl介質(zhì)密度為1.7g/cm3，超速離心后形成11.9052 g/cm3的密度梯度nEB（溴化乙錠）可嵌入DNA兩條鏈的堿基對(duì)之間，并因此導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋反應(yīng)n線性或開環(huán)DNA分子，因其具有游離的末端而易于解旋，故可結(jié)合相當(dāng)大量的EB直到達(dá)到飽和n具有ccc結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA由于負(fù)超螺旋的存在阻止DNA解鏈，因而只能結(jié)合很少的EBnDNA分子中結(jié)合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以區(qū)分 質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化氯化

6、銫密度梯度離心法：氯化銫密度梯度離心法： 用含有用含有EDTA的緩沖液的緩沖液懸浮菌體懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁壁 加加CsCl和溴乙錠和溴乙錠超速離心過(guò)超速離心過(guò)夜夜在紫外燈下吸取在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs 關(guān)鍵：關(guān)鍵： 防止內(nèi)外源防止內(nèi)外源RNase的作用的作用 四、四、RNA的分離與純化的分離與純化RNase的特點(diǎn)：n抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍n抗高溫嚴(yán)寒(065均具活性，100也不能使之完全失活）n抗變性劑（變性劑只能使之暫時(shí)失活，去除變性劑后又可恢復(fù)活性）n酶活性不需要輔助

7、因子n存在范圍廣 解決辦法：解決辦法：外源RNase：高溫（干熱180，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者帶手套 內(nèi)源RNase：高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等 五、五、核酸的濃縮與貯存核酸的濃縮與貯存 n沉淀沉淀是核酸濃縮最常用的方法，其最大的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)核酸沉淀來(lái)改變核酸的溶解緩沖液及重新調(diào)節(jié)核酸在溶液中的濃度，可去除溶液中某些可溶性的鹽離子與雜質(zhì)，在一定程度上純化核酸n沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10體積的3M NaAc（或KAc）和2倍體積的乙醇，放置1530min，離心收集DNA沉淀，倒去上清液

8、，加入70%的乙醇洗滌沉淀，去除殘余的鹽，再離心收集沉淀。 貯存貯存nDNA：溶于TE中，放置于4、-20、-70nRNA： 溶于0.3M NaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70 長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯存于乙醇中，-20 六、核酸的質(zhì)量評(píng)估方法六、核酸的質(zhì)量評(píng)估方法 n核酸濃度的測(cè)定核酸濃度的測(cè)定 ds-DNA：1 OD26050g/ml ss-DNA&RNA：1 OD26040g/ml 單鏈寡核苷酸：?jiǎn)捂湽押塑账幔? OD26020g/ml n核酸純度的測(cè)定核酸純度的測(cè)定 DNA：A260/A280=1.8 若1.8，說(shuō)明RNA未除盡 1.6，蛋白質(zhì)或酚未除盡RNA：A260/

9、A280=2.0 2.0，蛋白質(zhì)或酚未除盡 第二節(jié)第二節(jié) 凝膠電泳凝膠電泳一、核酸電泳的基本原理一、核酸電泳的基本原理 核酸分子中的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中將向正極移動(dòng)，通過(guò)凝膠的分子篩作用可以將不同大小和構(gòu)型的核酸分子分離，分子量小的DNA，具有較緊密的構(gòu)型，在凝膠中移動(dòng)快；反之，分子量大的DNA移動(dòng)慢 瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力片段的能力 凝膠類型及濃度凝膠類型及濃度 分辨分辨DNADNA片段的大小范圍（片段的大小范圍（bpbp） 0.3%瓊脂糖瓊脂糖 500001000 0.7%瓊脂糖瓊脂糖 200001000 1.4%瓊脂糖瓊脂糖 6000

10、300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1000 100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 500 25 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50 1 DNARNADNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核酸電泳的染色劑和指示劑核酸電泳的染色劑和指示劑 n指示劑指示劑 在電泳過(guò)程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過(guò)程 瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖凝膠濃度 0.6% 1% 1.4% 2%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb二甲苯青藍(lán)二甲苯青藍(lán) 2kb 1.6kb n染色劑染色劑 溴化乙錠（溴化乙錠（EB）：嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間，在紫外光下呈現(xiàn)橙色熒光 由于單鏈DNA、RNA中常存在自身配對(duì)的雙鏈

11、區(qū)，也可嵌入EB分子 EB是一種誘變劑，見(jiàn)光易分解n在常規(guī)電泳中，DNA移動(dòng)距離與分子量有關(guān)：分子量小的移動(dòng)快，反之則慢n大于20kb的DNA大分子，其移動(dòng)距離與分子量無(wú)關(guān)。因?yàn)檫@些DNA分子要通過(guò)膠孔時(shí)必須發(fā)生變形，并沿分子長(zhǎng)軸運(yùn)動(dòng)經(jīng)過(guò)膠孔，它們都以相同速度前進(jìn)，分辨率也就消失了。 三、脈沖場(chǎng)凝膠電泳三、脈沖場(chǎng)凝膠電泳n 在脈沖場(chǎng)凝膠電泳中，加在凝膠上至少有兩個(gè)電場(chǎng)方向，使得DNA分子要不斷地調(diào)整泳動(dòng)方向，不同分子量大小的DNA分子用于改變泳動(dòng)方向的時(shí)間不同，則可以得到分離脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈沖場(chǎng)凝膠電泳Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE PFGE工作原理

12、工作原理nDNA松弛時(shí)間：大分子DNA改變形狀和重新定向所需的時(shí)間。這個(gè)時(shí)間與DNA分子量呈正相關(guān)（Tr） nDNA移動(dòng)時(shí)間：DNA分子向前移動(dòng)的時(shí)間（Tm） n電場(chǎng)脈沖時(shí)間：其電場(chǎng)方向所持續(xù)的時(shí)間（Tp） n分子量大的DNA分子所需的松弛時(shí)間長(zhǎng)，分子量小的則短。n由于脈沖時(shí)間是一個(gè)人為的固定值，那么用于向前移動(dòng)的時(shí)間則隨分子量大小而變化。n分子量大的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間少，移動(dòng)距離就短，分子量小的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間多，移動(dòng)距離就長(zhǎng)。nTp小小 = Tm小小+ Tr小小 Tp大大 = Tm大大+ Tr大大 nTp小小 = Tp大大 nTr小小 Tm大大 ，所以，所以， S小小 S大大 n顯然，要

13、使一個(gè)顯然，要使一個(gè)DNA樣品中不同大小的樣品中不同大小的DNA分子分離，脈沖時(shí)間應(yīng)選在最大分子分離，脈沖時(shí)間應(yīng)選在最大DNA分子所需分子所需的上限。的上限。 第三節(jié)第三節(jié) DNA序列分析序列分析 1. 雙脫氧核苷酸鏈終止法雙脫氧核苷酸鏈終止法 Dideoxy-termination sequencing Sanger法基本原理：基本原理： 雙脫氧（雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因鏈中，但因3 端不具端不具OH基，基，DNA鏈合鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA

14、分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長(zhǎng)度的不同長(zhǎng)度的DNA片段測(cè)定出核苷酸序列片段測(cè)定出核苷酸序列過(guò)程過(guò)程：制備ss-DNA與引物退火分為4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)每個(gè)系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標(biāo)記）和一種雙脫氧核苷酸DNA聚合酶定序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳凝膠干燥放射自顯影 DNA Sequencing ReactionsThe DNA sequencing run is similar to the PCR run.The run mix includes the template DNA, Taq polymerase, dNTPs, ddNTPs, and

15、a primer: a small piece of single-stranded DNA 20-30 nt long that hybridizes to one strand of the template DNA.The run is intitiated by heating until the two strands of DNA separate, then the primers anneals to the complementary template strand, and DNA polymerase elongates the primer. 4 different D

16、NA synthesis reactions are run begin synthesis from specific priming point add components for DNA synthesis + specific ddNTP for each of the four reactionse.g. ddATPNo 3OH.ddCTPACCCTTGGMethod from Saenger Manual sequencing uses radiolabeled dATP (35-S or 33-P) to label the DNA. The sample is then sp

17、lit into four tubes each with an individual ddNTP present. The samples are then subjected to acrylamide gel electrophoresis followed by autoradiography.nDNA全自動(dòng)測(cè)序全自動(dòng)測(cè)序Putting It All TogetherUsing gel electrophoresis to separate each DNA fragment that differs by a single nucleotide will band each fluo

18、rescently tagged terminating ddNTP producing a sequencing read.The gel is read from the bottom up, from 5 to 3, from smallest to largest DNA fragment. 屏幕顯示的膠圖Raw Automated Sequencing DataA 5 lane example of raw automated sequencing data.Green:ddATPRed:ddTTPYellow: ddGTPBlue:ddCTPSanger：熒光檢測(cè) 377測(cè)序儀人類

19、基因組計(jì)劃測(cè)序的主力機(jī)型測(cè)序的主要設(shè)備上樣走電泳編寫樣品清單全自動(dòng)的測(cè)序儀器：MegaBace 華大基因研究中心華大基因研究中心(北京北京) 承擔(dān)了人類承擔(dān)了人類3號(hào)染色體短臂上的約號(hào)染色體短臂上的約3000萬(wàn)對(duì)堿基的萬(wàn)對(duì)堿基的測(cè)序任務(wù)，使中國(guó)成為繼美、英、日、德、法之后第六個(gè)測(cè)序任務(wù)，使中國(guó)成為繼美、英、日、德、法之后第六個(gè)加入加入國(guó)際測(cè)序俱樂(lè)部國(guó)際測(cè)序俱樂(lè)部的國(guó)家。的國(guó)家。中心已建成了基因組學(xué)、蛋中心已建成了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)研究及產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)，擁有白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)研究及產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)，擁有ABI 377-96 平平板測(cè)序儀板測(cè)序儀11臺(tái)，臺(tái)，MegaBACE1000 毛細(xì)管測(cè)

20、序儀毛細(xì)管測(cè)序儀70臺(tái)臺(tái) 。 TADA!2001 The HGP consortium publishes its working draft in Nature (15 February), and Celera publishes its draft in Science (16 February). 2. Maxam-Gilbert化學(xué)法 原理：原理：DNA鏈上的不同堿基可以和鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)，然后發(fā)生堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)，然后發(fā)生12個(gè)堿基的脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷個(gè)堿基的脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠分子經(jīng)凝膠電泳就可

21、確定其核苷酸序列電泳就可確定其核苷酸序列 4 4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異斷種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異斷裂裂DNADNA機(jī)制機(jī)制nG反應(yīng)：反應(yīng)：硫酸二甲脂使鳥嘌呤硫酸二甲脂使鳥嘌呤N7甲基化甲基化nAG反應(yīng)：反應(yīng)：甲酸使嘌呤環(huán)上的氮質(zhì)子化導(dǎo)致糖苷甲酸使嘌呤環(huán)上的氮質(zhì)子化導(dǎo)致糖苷鍵被削弱，使嘌呤環(huán)被吡啶取代鍵被削弱，使嘌呤環(huán)被吡啶取代nC+T反應(yīng)反應(yīng)：肼能裂解嘧啶環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致其脫落肼能裂解嘧啶環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致其脫落nC反應(yīng)：反應(yīng)：在一定濃度的在一定濃度的NaCl條件下，肼只對(duì)胞嘧條件下，肼只對(duì)胞嘧啶起作用啶起作用反反應(yīng)應(yīng) 斷斷裂裂位位置置 堿堿基基修修飾飾 修修飾飾堿堿基基 的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移 DNA鏈鏈

22、的的 斷斷裂裂 R1 G 硫硫酸酸二二甲甲酯酯 六六氫氫吡吡啶啶 六六氫氫吡吡啶啶 R2 G+A 酸酸 酸酸 六六氫氫吡吡啶啶 R3 C+T 肼肼 六六氫氫吡吡啶啶 六六氫氫吡吡啶啶 R4 C 肼肼+鹽鹽 六六氫氫吡吡啶啶 六六氫氫吡吡啶啶 n化學(xué)法測(cè)序的一大優(yōu)點(diǎn)是不需要模化學(xué)法測(cè)序的一大優(yōu)點(diǎn)是不需要模板，引物和板，引物和DNA聚合酶。待測(cè)聚合酶。待測(cè)DNA鏈的檢測(cè)用鏈的檢測(cè)用32P末端標(biāo)記末端標(biāo)記 作作 業(yè)業(yè) A solution contains double-stranded DNA fragments of size 3 kb,6 kb, 9 kb, and 12 kb. They a

23、re separated in an electrophoresis gel. In the diagram of the gel at the right, match the fragment sizes with the correct bands. A cloned fragment of DNA was sequenced by using the dideoxy method. A part of the autoradiogram of the sequencing gel is represented herenDeduce the nucleotide sequence of

24、 the DNA nucleotide chain synthesized from the primer. Label the 5 and 3 endsnDeduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain used as the template strand. Label the 5 and 3 endsnWrite the nucleotide sequence of the DNA double helix (label the 5 and 3 ends)第四節(jié)第四節(jié) 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)核酸雜交nSouthern

25、印跡雜交 （Southern blotting ）nNorthern 印跡雜交（Northern blotting ）nWestern 印跡雜交（Western blotting ） Southern雜交雜交 Southern雜交是指以雜交是指以Southern名字命名的名字命名的DNA轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)，用于特定轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)，用于特定DNA序列的檢測(cè)，包序列的檢測(cè)，包括基因組特定括基因組特定DNA序列的定位，相關(guān)片段的同源性測(cè)序列的定位，相關(guān)片段的同源性測(cè)定、從定、從cDNA庫(kù)、基因組文庫(kù)中篩選目的基因等。用庫(kù)、基因組文庫(kù)中篩選目的基因等。用一種或多種限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組一種或多種限制性內(nèi)切酶對(duì)基

26、因組DNA加以切割，通加以切割，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，隨后，使過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，隨后，使DNA在原在原位變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜，用已知核苷酸片段位變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜，用已知核苷酸片段加以標(biāo)記作為探針，通過(guò)分子雜交來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣品中加以標(biāo)記作為探針，通過(guò)分子雜交來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存在互補(bǔ)的核酸序列。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)是否存在互補(bǔ)的核酸序列。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)中一類重要的檢測(cè)手段。中一類重要的檢測(cè)手段。Southern 印跡雜交的用途n確定在克隆片段中基因編碼區(qū)的大小和位置n確定克隆片段在基因組中的拷貝數(shù)Southern blottingSouthern

27、blottingNorthern Blottingn相對(duì)相對(duì)Southern blotting命名的，與命名的，與Southern blotting不同的是，它檢不同的是，它檢測(cè)的對(duì)象是測(cè)的對(duì)象是RNA分子。分子。 Western Blottingn雜交的對(duì)象是蛋白質(zhì)，先將蛋白質(zhì)雜交的對(duì)象是蛋白質(zhì)，先將蛋白質(zhì)從從SDS-PAGE中轉(zhuǎn)移到一固相支持中轉(zhuǎn)移到一固相支持物上，通過(guò)與附著于固相支持物上物上，通過(guò)與附著于固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原抗體特異反的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原抗體特異反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)進(jìn)行檢測(cè) n主要用于基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的檢測(cè) 第五節(jié)第五節(jié) PCR技術(shù)技術(shù)一、一、PCR技術(shù)的基本原

28、理技術(shù)的基本原理 Polymerase chain reaction, PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) A method for amplifying specific DNA segments that exploits certain features of DNA replication.n一個(gè)一個(gè)DNA經(jīng)經(jīng)n次擴(kuò)增后次擴(kuò)增后, 一個(gè)一個(gè)DNA分子分子可變?yōu)榭勺優(yōu)?n 理論上經(jīng)過(guò)理論上經(jīng)過(guò)30次循環(huán)，靶次循環(huán)，靶DNA得到得到109倍的擴(kuò)增，實(shí)際是倍的擴(kuò)增，實(shí)際是1067倍的擴(kuò)增倍的擴(kuò)增nDNA擴(kuò)增需要對(duì)待擴(kuò)增的擴(kuò)增需要對(duì)待擴(kuò)增的DNA序列有序列有所了解，至少要對(duì)其兩側(cè)的核苷酸序所

29、了解，至少要對(duì)其兩側(cè)的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物列為已知，以便合成寡核苷酸引物 二、二、PCR反應(yīng)的各種組份及作用反應(yīng)的各種組份及作用 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系（反應(yīng)體系（50100 l） n 50 mmol/L KCln 10 mmol/L Tris-HCl（pH=8.4）n 1.5 mmol/L MgCl2n 100 g/ml 明膠或牛血清白蛋白（BSA）n 2個(gè)引物，各0.25 mol/Ln dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP） 各200mol/Ln 模板DNA（人基因組DNA） 0.11gn Taq DNA聚合酶 2 UnDenaturation 9

30、4 , 0.5minnPrimer annealing 55 , 1.5mionnExtension 72 , 1min 30 cycles 變性（模板）退火（引物與模板）延伸（新合成DNA鏈）1. 模板模板DNAn用于用于PCR擴(kuò)增的模板擴(kuò)增的模板DNA通常是從細(xì)胞中通常是從細(xì)胞中提取的染色體提取的染色體DNA，它們并不需要高度純，它們并不需要高度純化?；?。n待擴(kuò)增的靶待擴(kuò)增的靶DNA的長(zhǎng)度在的長(zhǎng)度在3kb以下是以下是PCR的有效擴(kuò)增范圍，的有效擴(kuò)增范圍，采用經(jīng)改造的采用經(jīng)改造的Taq DNA聚合酶可擴(kuò)增出聚合酶可擴(kuò)增出40 kb的的DNA 片段片段。 2. 引物引物nPCR引物是與待擴(kuò)增的

31、目的引物是與待擴(kuò)增的目的DNA兩端序列兩端序列互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸片段互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸片段n引物的長(zhǎng)度通常為引物的長(zhǎng)度通常為1730個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸 引物太短，可能同非靶DNA雜交，得出非預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物； 引物太長(zhǎng)，引物與模板的結(jié)合效率降低，影響擴(kuò)增效率。 v如8nt的引物，平均每48=65536 bp就會(huì)有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在全長(zhǎng)為3109 bp的人類基因組中，大約有43000個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)，不能得到單一的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。v如為17nt的引物，出現(xiàn)幾率為417=17,179,869,184 bp，長(zhǎng)度超過(guò)人類基因組長(zhǎng)度的5倍，故在人類基因組中只可能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。 v但引物不是越長(zhǎng)

32、越好，過(guò)長(zhǎng)的引物同模板DNA的雜交效率反而下降，從而降低PCR反應(yīng)的效率。 n簡(jiǎn)并引物簡(jiǎn)并引物 是一類由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間只有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的差異。如根據(jù)氨基酸序列推測(cè)出的核苷酸序列。 n引物與復(fù)性溫度引物與復(fù)性溫度 v引物與模板結(jié)合的特異性與復(fù)性溫度有密切引物與模板結(jié)合的特異性與復(fù)性溫度有密切關(guān)系關(guān)系 當(dāng)復(fù)性溫度偏低時(shí)，引物與模板配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)當(dāng)復(fù)性溫度偏低時(shí)，引物與模板配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)配堿基，導(dǎo)致一些不需要的配堿基，導(dǎo)致一些不需要的DNA片段被擴(kuò)增片段被擴(kuò)增 復(fù)性溫度過(guò)高，引物與模板不能配對(duì)復(fù)性溫度過(guò)高，引物與模板不能配對(duì)v復(fù)性溫度常與引物的長(zhǎng)度和堿基組成有直接復(fù)性溫度常與引物的長(zhǎng)

33、度和堿基組成有直接關(guān)系，引物越長(zhǎng)或關(guān)系，引物越長(zhǎng)或GC含量較高，退火的溫度含量較高，退火的溫度可以高些，反之則低些可以高些，反之則低些 Tm=4(GC)2(AT) 12 belown引物設(shè)計(jì)的一般原則引物設(shè)計(jì)的一般原則: Correspond with the sequences flanking the target region on the template molecule. v引物的長(zhǎng)度常為1730vGC含量為40%60%vTm值高于55 v兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)小于5個(gè)v引物自身配對(duì)(特別是在引物的3端)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu), 莖的堿基配對(duì)數(shù)不大于3 通常采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)通常采用計(jì)算機(jī)輔

34、助設(shè)計(jì)3. dNTP n濃度為20200mol/L，4種dNTP以等摩爾濃度配制 n濃度過(guò)高，加快反應(yīng)速度，但可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和成本 n濃度過(guò)低，反應(yīng)速度下降，提高實(shí)驗(yàn)的精確性 4. Taq DNA聚合酶聚合酶 基本特點(diǎn)基本特點(diǎn): Taq DNA聚合酶是從一種極度聚合酶是從一種極度嗜熱水生棲熱菌嗜熱水生棲熱菌YT-1中分離純化而得中分離純化而得n具有DNA聚合酶活性、53外切酶活性、逆轉(zhuǎn)錄酶活性n最適反應(yīng)溫度為80n最適pH8.0和最佳反緩沖液TrisHCl n最佳二價(jià)陽(yáng)離子Mg2+ （10 mM）n具良好的熱穩(wěn)定性：在90下連續(xù)反應(yīng)30分鐘仍有70%的酶活 擴(kuò)增產(chǎn)物的可靠性擴(kuò)增產(chǎn)物的可

35、靠性:v評(píng)估DNA聚合酶的一個(gè)重要指標(biāo)是它復(fù)制DNA的可靠性，即摻入錯(cuò)誤堿基的頻率v天然復(fù)制的DNA分子中錯(cuò)誤摻入率為10-9v在體外實(shí)驗(yàn)中，Klenow片段的錯(cuò)誤摻入率為10-4，Taq DNA聚合酶的錯(cuò)誤摻入率為510-3 ，而T4聚合酶的錯(cuò)誤摻入率為10-7v在克隆基因時(shí)，應(yīng)采用高保真的在克隆基因時(shí)，應(yīng)采用高保真的Taq DNA聚合酶（聚合酶（Pfu）（）（3-5 exonuclease) 5. PCR反應(yīng)的平臺(tái)期反應(yīng)的平臺(tái)期 反應(yīng)底物和產(chǎn)物在反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴(kuò)增中不斷發(fā)生變化，擴(kuò)增中不斷發(fā)生變化，最終將會(huì)導(dǎo)致聚合反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)最終將會(huì)導(dǎo)致聚合反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)期的

36、原因可能有：期的原因可能有：后期循環(huán)酶濃度或聚合時(shí)間不足；后期循環(huán)酶濃度或聚合時(shí)間不足；引物耗盡；引物耗盡；dNTP耗盡；耗盡；產(chǎn)物濃度過(guò)高，以致產(chǎn)物濃度過(guò)高，以致ds-DNA解鏈后又迅速退解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合?；?，不能與引物結(jié)合。三、PCR產(chǎn)物的鑒定nGel electrophoresis of PCR productsnCloning of PCR productsnSequencing of PCR productsCloning PCR productsnTaq DNA polymerase tends to add an additional nucleotide, us

37、ually A, to the end of each strand it synthesizes. nDesign primers that contain restriction sites第六節(jié)第六節(jié) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù)DNA芯片或微陣列技術(shù)(DNA chip or microarray)nDNA芯片（或基因芯片）芯片（或基因芯片）是將許多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段（稱為探針）固定在芯片的每個(gè)預(yù)先設(shè)置的區(qū)域內(nèi)，將待測(cè)樣本標(biāo)記后同芯片進(jìn)行雜交分析，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原理進(jìn)行雜交， 通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)并進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，從而檢測(cè)對(duì)應(yīng)片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因

38、組研究、疾病的臨床診斷和檢測(cè)等眾多方面基因芯片基因芯片是基因功能研究領(lǐng)域的一次革命基因芯片是基因功能研究領(lǐng)域的一次革命 n與其他的基因檢測(cè)技術(shù)相比，基因芯片技術(shù)最大的特征在于能同時(shí)定量或定性地檢測(cè)成千上萬(wàn)的基因信息n基因芯片技術(shù)具有微型化、自動(dòng)化和網(wǎng)絡(luò)化等特點(diǎn)，是典型的多學(xué)科高技術(shù)交叉的結(jié)晶19911991年世界第一塊原位合成寡核苷酸芯年世界第一塊原位合成寡核苷酸芯片在美國(guó)片在美國(guó)AffymetrixAffymetrix誕生誕生19951995年世界第一塊年世界第一塊cDNAcDNA芯片在斯坦福大芯片在斯坦福大學(xué)實(shí)驗(yàn)室誕生學(xué)實(shí)驗(yàn)室誕生 - Science. 1995,270: 467-470-

39、 Science. 1995,270: 467-470基因芯片的歷史基因芯片的歷史8080年代末期科學(xué)家提出雜交法測(cè)序的思年代末期科學(xué)家提出雜交法測(cè)序的思想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理基因芯片技術(shù)流程基因芯片技術(shù)流程 制備方法及點(diǎn)樣儀器制備方法及點(diǎn)樣儀器探針的制備：探針的制備：標(biāo)記標(biāo)記方法方法雜交：雜交：雜交液、雜交溫度、雜交液、雜交溫度、 洗滌條件的選擇洗滌條件的選擇掃描儀掃描儀:激光激光 CCD分析軟件的開發(fā)分析軟件的開發(fā)基因芯片的制備基因芯片的制備雜交雜交檢測(cè)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 基因芯片實(shí)驗(yàn)原理基因芯片實(shí)驗(yàn)原理一、基因芯片原理及制備方法n原位合成：寡核苷酸芯片n直接點(diǎn)樣：寡核苷酸芯片和cDNA芯片1. 原位合成法 n在固相介質(zhì)表面特定區(qū)域合成已知序列的寡核苷酸的一類技術(shù)的總稱n采用光導(dǎo)化學(xué)合成和照相平板印刷技術(shù)合成寡核苷酸芯片2.