儀器分析第五章 毛管電泳

1、第五章第五章第五章第五章第五章第五章 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳主要內(nèi)容主要內(nèi)容主要內(nèi)容主要內(nèi)容主要內(nèi)容主要內(nèi)容high performance capillary electrophoresis,hpce5.1 毛細(xì)管電泳的基本原理毛細(xì)管電泳的基本原理5.2 毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳儀5.3 毛細(xì)管電泳的分離模式毛細(xì)管電泳的分離模式5.4 影響分辨率的因素及操作條件選擇影響分辨率的因素及操作條件選擇5.5 毛細(xì)管電泳的應(yīng)用毛細(xì)管電泳的應(yīng)用5.1 5.1 5.1 5.1 5.1 5.1 毛細(xì)管電泳的基本原理毛細(xì)管電泳的基本原理毛細(xì)管電泳的基本原理毛細(xì)管電泳的基本

2、原理毛細(xì)管電泳的基本原理毛細(xì)管電泳的基本原理 在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。 1937年，tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白； 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次第一次的的自由溶液電泳；自由溶液電泳；第一臺(tái)電泳儀第一臺(tái)電泳儀； 1948年，年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；5.1

3、.1 概 述經(jīng)典電泳分析經(jīng)典電泳分析經(jīng)典電泳分析經(jīng)典電泳分析經(jīng)典電泳分析經(jīng)典電泳分析 利用利用電泳電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：u型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無(wú)法與其他分析相比。 1981年，jorgenson和luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬(wàn)/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與gc、hplc相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)高

4、效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳。高效毛細(xì)管電泳分析高效毛細(xì)管電泳分析高效毛細(xì)管電泳分析高效毛細(xì)管電泳分析高效毛細(xì)管電泳分析高效毛細(xì)管電泳分析 high performance capillary electrophoresishigh performance capillary electrophoresishigh performance capillary electrophoresis高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)： 一是采用了一是采用了0.050.05mmmm內(nèi)徑的毛細(xì)管內(nèi)徑的毛細(xì)管, ,； 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。二是采用了高達(dá)數(shù)千

5、伏的電壓。 毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高。 電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長(zhǎng)增加， 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬(wàn)塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。 電壓：030kv； 分離柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；（可檢測(cè)到：10-1910-21 mol/l）高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)（書高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)（書高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)（書高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)（書高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)（書高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)（書p144p144p144有有有有有有6 6 6點(diǎn)）點(diǎn)）點(diǎn)）點(diǎn)）點(diǎn)）點(diǎn)）1.儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化儀

6、器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化 電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無(wú)機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽(yáng)離子；分離柱效：105107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少，成本低操作方便、消耗少，成本低 進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.應(yīng)用范圍極廣應(yīng)用范圍極廣 有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等； 5、高靈敏度。、高靈敏度。6、進(jìn)樣量少。、進(jìn)樣量少。 5.1.2 5.1.2 5.1.2 高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳( ( (hpce)hpce)hpce)基本原理

7、基本原理基本原理 電泳是指帶電離子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng)，不同離子具有電泳是指帶電離子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng)，不同離子具有不同的遷移速度，不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？遷移速度與哪些因素有關(guān)？ 當(dāng)帶電離子以速度當(dāng)帶電離子以速度 在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。電場(chǎng)力：電場(chǎng)力：fe = qe 阻阻 力：力：f = f故：故： qe = fq離子所帶的有效電荷；e 電場(chǎng)強(qiáng)度；離子在電場(chǎng)中的遷移速度；f 平動(dòng)摩擦系數(shù) ( 對(duì)于球形離子： f =6； 離子的表觀液態(tài)動(dòng)力學(xué)半徑； 介質(zhì)的粘度

8、； )所以，遷移速度：所以，遷移速度：eqfqe 6 （球形離子） 物質(zhì)離子在電場(chǎng)中物質(zhì)離子在電場(chǎng)中差速遷移差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。是電泳分離的基礎(chǔ)。淌度淌度 ：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。 6qe 電滲現(xiàn)象與電滲流電滲現(xiàn)象與電滲流電滲現(xiàn)象與電滲流1.1.電滲流現(xiàn)象電滲流現(xiàn)象 當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層雙電層，二者之間存在電位差（zetazeta電位電位）。 當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)

9、于固體的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象電滲現(xiàn)象。 電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫液體叫電滲流電滲流（electroosmotic flow ，簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱eof）。）。 2.2.2.hpcehpcehpce中的電滲現(xiàn)象與電滲流中的電滲現(xiàn)象與電滲流中的電滲現(xiàn)象與電滲流 石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液ph3時(shí)，表面電離成時(shí)，表面電離成-sio-,管內(nèi)壁管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。帶負(fù)電荷，形成雙電層。 在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化

10、的，故將引起柱中的移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度電滲流電滲流。3.3.3.hpcehpcehpce中電滲流的大小與方向中電滲流的大小與方向中電滲流的大小與方向 電滲流的大小用電滲流速度電滲流的大小用電滲流速度電滲流電滲流表示，取決于電滲淌表示，取決于電滲淌度度和電場(chǎng)強(qiáng)度和電場(chǎng)強(qiáng)度e e。即即 電滲流電滲流 = = e e電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的zetazeta電勢(shì)，即電勢(shì)，即 = = 0 00真空介電常數(shù)；介電常數(shù)；毛細(xì)管壁的zeta電勢(shì)。 電滲流電滲流 = = 0 0 e e實(shí)際電泳

11、分析，可在實(shí)驗(yàn)測(cè)定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測(cè)定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算 電滲流電滲流 = = l lefef/t/teoeolef 毛細(xì)管有效長(zhǎng)度； teo電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時(shí)間。hpcehpcehpce中電滲流的方向中電滲流的方向中電滲流的方向 電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)： 內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極；內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極； 石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；石英毛

12、細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：改變電滲流方向的方法： （1 1）毛細(xì)管改性）毛細(xì)管改性 表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)； （2 2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑）加電滲流反轉(zhuǎn)劑 內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽(yáng)極。4. 4. 4. hpcehpcehpce中電滲流的流形中電滲流的流形中電滲流的流形 電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)（譜帶展寬很?。?； 液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。5. 5. 5. hpcehpcehpce中電滲流的作用中電滲

13、流的作用中電滲流的作用 電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5 57 7倍；倍； 各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為： + + = =電滲流電滲流 + + +ef+ef 陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致一致； - - = =電滲流電滲流 - - -ef-ef 陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反相反； 0 0 = =電滲流電滲流 中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；（1 1）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；（2 2

14、）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變?nèi)缤淖僱clc中的流速；中的流速；（3 3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在在hpcehpce中，控制電滲流非常重要中，控制電滲流非常重要。hpcehpcehpce中影響電滲流的因素中影響電滲流的因素中影響電滲流的因素 factors influenced factors influenced factors influenced electroosmosiselectroosmosiselectroosmosis1.1.電場(chǎng)強(qiáng)度的影響電場(chǎng)強(qiáng)度的影響

15、 電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。2.2.毛細(xì)管材料的影響毛細(xì)管材料的影響 不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；3. 3. 3. 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1 1）溶液）溶液phph的影響的影響 對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液ph增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，ph=7，達(dá)到最大達(dá)到最大； ph 電泳電泳時(shí)時(shí), ,陰離子在陰離子在負(fù)極最后流出負(fù)極最后流出, ,在這種情況下在這種情況下, ,不但不但可以按類分離可以按類分離, ,同種類離子由于同種類離子由于差差速遷移速遷移被

16、相互分離。被相互分離。 最基本、應(yīng)用廣的分離模式；最基本、應(yīng)用廣的分離模式；二、毛細(xì)管凝膠電泳二、毛細(xì)管凝膠電泳二、毛細(xì)管凝膠電泳 capillary gel electrophoresis capillary gel electrophoresis capillary gel electrophoresis ，cgecgecge 將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖

17、銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)、dnadna等的電荷等的電荷/ /質(zhì)量比與分子大小無(wú)關(guān)，質(zhì)量比與分子大小無(wú)關(guān)，czecze模模式很難分離，采用式很難分離，采用cgecge能獲得良好分離。能獲得良好分離。 特點(diǎn)特點(diǎn)：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。 無(wú)膠篩分技術(shù)無(wú)膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。 1.1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。濃度，

18、形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。三、三、三、 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（mecc mecc mecc ，mekcmekcmekc）micellarmicellarmicellar electrokineticelectrokineticelectrokinetic capillary capillary capillary chromatographychromatographychromatography，mekcmekcmekc 在電場(chǎng)力的作在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中用下，膠束在柱中移動(dòng)。移動(dòng)。 2. 2. 電泳流和電滲流的方向相反，且電泳流和電滲流的方向

19、相反，且電滲流電滲流 電泳電泳 ，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)；負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)； 5.5.色譜與電泳分離模式色譜與電泳分離模式的結(jié)合。的結(jié)合。 3. 3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)；的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)； 4. 4.可用來(lái)分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用可用來(lái)分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍范圍； 1. 1. 根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)； 2. 2. 毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合

20、成的具有不同等電點(diǎn)范圍毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6 68 8v v）時(shí)，時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步升高的管內(nèi)將建立一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步升高的phph梯度；梯度； 3. 3. 氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液phph有關(guān)，在有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；性，淌度為零；四、毛細(xì)管等電聚焦四、毛細(xì)管等電聚焦四、毛細(xì)管等電聚焦 capill

21、ary capillary capillary isoelectricisoelectricisoelectric focusingfocusingfocusing，ciefciefcief 4. 聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)ph的位置時(shí)，呈電中性，停止的位置時(shí)，呈電中性，停止移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離； 5. 陽(yáng)極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀陽(yáng)極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀naoh溶液；溶液； 6. 加壓將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過(guò)檢測(cè)器檢測(cè)；加壓

22、將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過(guò)檢測(cè)器檢測(cè)； 7. 電滲流在電滲流在cief中不利，應(yīng)消除或減小。中不利，應(yīng)消除或減小。5.5 5.5 5.5 毛細(xì)管電泳的應(yīng)用毛細(xì)管電泳的應(yīng)用毛細(xì)管電泳的應(yīng)用陽(yáng)離子分析陽(yáng)離子分析 遷移方向和電滲流方向一致； 4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子； 陽(yáng)極進(jìn)樣，陰極檢測(cè)； 具有很高的靈敏度；陰離子分析陰離子分析陰離子分析 陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時(shí)間長(zhǎng)、效率低； 質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：so4-2、cl-、f-等，電泳速率大于電滲流，陽(yáng)極端流出，在陰極端無(wú)法檢測(cè)； 加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進(jìn)樣，陽(yáng)極檢測(cè)；離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析；藥物分析藥物分析藥物分析 analysis of pharmaceuticsanalysis of pharmaceuticsanalysis of pharmaceutics 檢測(cè)體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析； 尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段； 采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；采用mekc模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于hplg法手性化合物分析手性化合物分析手性化合物分析 合成獲得單一手性化合物相當(dāng)困難；528種手性合成藥物，61中以單