[精品]基因組DNA甲基化的液相色譜質(zhì)譜分析6-26

1、組織中全基因組dna甲基化的液相色譜串級質(zhì)譜分析*張俊杰，張立堅，劉春安，張良滔，蔡春*(廣東醫(yī)學院,湛江，524023)摘要：建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定組織屮全基因組dna甲基化水平的方法。采用苯酚氯 仿提取組織dna,提取的dna用88%甲酸在140°c裂解，dna裂解液加入同位素胞喀噪 作內(nèi)標，經(jīng)n2吹干后，用甲醇溶解，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測胞噸噪和5甲基胞喘口定含 量，并計算全基因組中dna甲基化的水平。結(jié)果表明，胞u密噪的線性范圍為 l-100ng/ml,相關(guān)系數(shù)為0.9974,相對標準偏差為0.704.09%； 5甲基胞"密碇的線性范圍 為150ng/ml,相關(guān)系

2、數(shù)為0.9948,相對標準偏差為0.60%4.81%。胞喀呢和5甲基胞嗨 喘的檢出限為lpg,日內(nèi)相對標準偏差分別為1.864.67%,日間相對標準偏差為3.72 4.68%,胞喀噪和5甲基胞喘噪的加樣回收率為86.52%105.14%。本文建立的方法檢測組 織中dna甲基化程度，具有專一性強，操作簡便的優(yōu)點，能較好地滿足全基因組dna甲 基化檢測的要求。關(guān)鍵詞：dna甲基化；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；胞喀臨5甲基胞喀旋analysis of global dna methylation in tissue by liquidchromatography tandem mass spectrumzha

3、ng jun-jie, zhang li-jian, liu chun-an, zhang liang-tao cai chun*(guangdong medical college, zhanjiang ,524023 )abstract： wc developed and validate a rapid, sensitive and specific lc/ms/ms method for determination of global dna methylation in tissue. dna was extracted by phcnol-chlorof()rm, hydrolyz

4、ed using 88% formic acid at 140°c, spiked with cytosine-2, 43c2?5n2 as internal standard, reconstituted in methanol and analyzed by lc/ms/ms with multiple reaction monitoring mode, to reflect the global dna methylation level of the tissue. results show that the limit of quantification was ing/m

5、l for both cytosine (cyt) and 5-methylcytosine (5mcyt), and the linear range of calibration curve was 1 50 ng/ml and 1 10ong/ml for 5mcyt and cyt respectively, with correlation coefficient higher than 0.99. the relative standard deviation (rsd) was 0.70-4.09% and 0.60%4.81% for cyt and 5mcyt respect

6、ively. the intra-day precision expressed as rsd ranged from 1.86% to 4.67%, while the inter-day values from 3.72% to 4.68% .the recovery ratio of method varied from 86.52% to 105.14%. this yielded a simple and reliable lc/ms/ms assay for detection of cyt and 5mcyt, thus enabling the evaluation of gl

7、obal dna methylation.key word: dna methylation, liquid chromatography-mass spectrum, cytosine, 5-methyl-cytosine收稿曰期：修回h期：第一作者：張俊杰(1985),男,在讀研究生,藥物分析與儀器分析。e-mail: zhjunjie357753 通訊作者：蔡春e-mail: caichundna甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，它是有核細胞特有的復制和轉(zhuǎn)錄后修飾， 能夠在不改變基因組中堿基排序的情況下影響基因轉(zhuǎn)錄和表達，它涉及到個體發(fā)育，細胞 增殖、分化、基因印跡、x染色體失活，基因表

8、達調(diào)控和堿基突變等多方面的生物學功能 m,特別對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的生物學意義。腫瘤中dna甲基化模式發(fā)生改 變，表現(xiàn)為全基因組低甲基化和某些基因啟動子cpg島區(qū)的高甲基化。這種甲基化模式的 改變與腫瘤變化的關(guān)系，己經(jīng)成為腫瘤研究的一個熱點。dna甲基化的準確檢測對于研究dna甲基化變化情況與疾病的關(guān)系極為重要。最近 有文獻報道，dna經(jīng)酶解后運用lc/ms/ms技術(shù)檢測咗嚨核昔的含量，從而計算dna 甲基化程度的報道®»此外，也有文獻報道dna通過化學方法裂解后，采用gc/ms方 法進行喀卩定含量的檢測。本文建立了化學方法將dna裂解后，運用lc/ms/ms測定咗

9、噪堿基含量的方法，評價dna的甲基化程度，并用建立的方法分析了六例結(jié)腸癌病人腫 瘤組織和正常結(jié)腸組織中全基因組dna甲基化的變化。1實驗部分1.1儀器與試劑試劑：氯仿，異戊醇，十二烷基磺酸鈉（sds）,無水乙醇,甲酸，乙二胺四乙酸二鈉 （edta）和乙月青（分析純級）；甲酸胺，甲酸（色譜純級）；實驗用水為milli-q超純 水；三輕甲基膠基甲烷（tris）和tris飽和酚為生化試劑標準品：胞卩密旋（cytosine, cyt）和5-甲基胞卩密睫（5methylcytosine,5mcyt ）購于sigma公 司，同位素胞卩密i庭（cytosine-i?c,i5n2）購于 toronto res

10、earch chemicals inc.。儀器：sigma臺式高速冷凍離心機3k15 （德國sigma公司），uv-2100型紫外可見分 光光度計（上海元析儀器有限公司），液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（aglicntl2006430a,美國安捷 倫公司）1.2儲備液和工作液配制121儲備液配制準確稱取2mg cyt和5mcyt用甲醇溶解定容50ml,得濃度為40|ig/ml cyt和5mcyt 標準儲備液；取2mg內(nèi)標物cyt,3c,5n用甲醇溶解后，置于50ml容量瓶中定容到刻度， 得濃度為40pg/ml cyt13c15n標準儲備液。所有儲備液在20°c冰箱保存待用。1.2.2工作液配制臨用

11、時取cyt儲備液加甲醇稀釋成濃度為100、75、50、40、25、10、7.5、5、2.5和 ing/ml；儲備液加甲醇稀釋成濃度為50、40、25、10、7.5、5、4、2.5、1和05ng/ml工 作液；臨用時取40mg/ml cyt,3c,5n標準儲備液加甲醇稀釋成濃度為40ng/ml的cyt,3c,5n 內(nèi)標工作液。1.3樣品處理結(jié)腸癌病人手術(shù)后取少量腫瘤組織和腫瘤旁正常結(jié)腸粘膜組織置7(rc冰箱保存。1.3.1 dna 提取取0.05mg組織加入0.12ml蛋白酶k、4ml te緩沖液和0.48ml 10%sds,在45°c水 浴過夜，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇(25:2

12、4:1)進行提取，搖勻6000rpm離心5min, 取上清，重復提取一次；再加入等體積氯仿：異戊醇(24:1),搖勻6000rpm離心5min； 取上清加入1/10倍體積的3mol/l醋酸鈉和2.5倍無水乙醇，12000rpm離心5min,倒去溶 液，加入iml te緩沖液溶解。用紫外可見分光光度計檢測dna純度，當 a260nm/a280nm=1.71.9視為純dna。若有rna污染加入rnase a,然后重復以上步驟。1.3.2 dna 裂解取約2.5昭dna放入反應(yīng)瓶中，用n?吹干，然后加入0.2ml 88%甲酸在140°c反應(yīng) 90min待其冷卻到室溫后，用n2吹干，加入40

13、0pl甲醇溶解，15000mi，離心4min取 上清，待lc/ms分析。1.4儀器條件141液相色譜條件:aglient 1200型液相色譜儀,beh hilic色譜柱(1.7pmx2.lx 100mm, waters公司)；流動相：a為0.1%甲酸鞍，b為乙膳。流速：0.4ml/min；柱溫為20°c, 進樣量為5pl；洗脫程序：0lmin a為10%； 12min a從10%變?yōu)?0%； 22.5min a 為 50%； 2.58min a 從 50%變?yōu)?10%1.4.2質(zhì)譜條件：電噴霧正離子電離模式，離子源溫度為300°c；噴霧電壓為3.5kv,噴霧 氣流量9l/m

14、in,入口電壓為cyt和 為114v, cyt13c15n為115v。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式檢 測，碰撞能量：cyt和為20v, cyt叱&n為16v。cyt定量離子m/z 112>95,輔助定量離 子69, 5mcyt定量離子m/z 126>109,輔助定量離子83, cyt13c,5n定量離子m/z 115>97, 輔助定量離子70。1.5數(shù)據(jù)處理本實驗采用內(nèi)標法定量，以w (5mcyt) / w (5mcyt) + w (cyt) x 100%的方式來 表示dna甲基化程度。采用excell進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果2.1和cyt質(zhì)譜圖分別用 lyg/ml cyt、40n

15、g/ml cytl,cl5n2 和 lpg/ml 5mcyt 標準溶液，進 5pl 經(jīng) ms/ms 分析，其質(zhì)譜圖如圖 1,圖>1' m/z 112 (m+h+) , m/z 115 (m+h+)和 m/z 126 <m+h+)分別為cyt、cyt,3c,5n和5mcyt分子離子峰；另外從圖中可以看汕，m/z 112>95和m/z 126>109分別為cyt和主要的碎片離子，因此選用m/z 112>95和126>109作為cyt和的泄量檢測。courts (%)vs. mass-tocharge (rr/z)acourts fx>) vs. m

16、asstcxchavge (n/z)c圖 1 cyt> cyt13c15n2 和 5mcyt 子離子圖fig. 1 product ion scan of cyt (a), cyt1 ci5n(b) and 5mcyt(c)2.3線性范圍及精密度實驗混合標準液包括5mcyt和cyt,其中質(zhì)量濃度系列為0.5、1、2.5、4、5、7.5、10、25、40 和 50ng/ml, cyt 質(zhì)量濃度系列為 1、2.5、4、5、7.5、10、25、40、50、75 和 100ng/ml,加入40ng/mlcyt13c,5n2作內(nèi)標，分別進樣5次。分別以cyt和5mcyt質(zhì)量濃 度為橫坐標，色譜峰面

17、積為縱坐標，繪制標準曲線，并以信噪比為3確定樣品的最低檢測 限。結(jié)果表明，cyt和5mcyt的檢出限為lpg, cyt的線性范圍為1100ng/ml,標準曲線 為y=1.2580x-0.6255,相關(guān)系數(shù)/為0.9974,相對標準偏差rsd為0.704.09%；的線性 范圍為150ng/ml,標準曲線為y=1216.6212x-593.6998,相關(guān)系數(shù)2為0.9948,相對標準 偏差 rsd 為 0.604.81%。2.4重現(xiàn)性實驗取同一樣品按1.3方法制備3份進行測定cyt和5mcyt兩個色譜峰的相對豐度rsd見 表1-表1結(jié)腸癌組織中cyt和5mcyt重現(xiàn)性tab 1 reproduci

18、bility of cyt and 5mcyt in colon cancercyt (ng/ml)(ng/ml)131.47981.5149231.86591.5256332.28361.4912rsd%1.26111.16542.5穩(wěn)定性實驗取同一 dna樣品試液，在20°c保存分別2, 4, 6, 8, 10h測定cyt和5mcyt。以上 質(zhì)譜峰相對豐度的rsd分別為1.86%和4.67%取同一 dna樣品試液，在20°c保存分別于1, 2, 3, 4, 5d測定cyt和5mcyto以上 質(zhì)譜峰相対豐度的rsd分別為3.72%和4.68%o2.6回收率實驗取dna裂解

19、液分別加入cyt（50、10和ing/ml）和（50、10和ing/ml） 400gl加標定 fi, n?吹干，加入400|il甲醇溶解，15000mi離心5min,取上清液用于lc/ms分析， 測定cyt回收率分別為87.38%、105.14%和96.18%； 5mcyt回收率分別為89.58% 86.52%和 94.52%02.7結(jié)腸癌組織樣品分析利用上述分析方法對6例結(jié)腸癌病人的結(jié)腸癌組織中dna甲基化水平進行了檢測。 圖2為標準品和cyt的mrm圖，表2是結(jié)腸癌患者正常組織和腫瘤組織甲基化分析結(jié) 果。實驗結(jié)果表明癌組織的甲基化水平低于相應(yīng)的正常組織，這與文獻報道一致，說明 本方法可以有

20、效地用于全基因組dna甲基化水平的檢測。圖2標準品cyt, cyt13c15n2和 的mrm圖fig.2 mrm of cyt,cytl'c15n2 and in standard resolution表2結(jié)腸癌和正常組織樣品甲基化分析結(jié)果tab 2 results of contents in colon cancer tissues and normal tissues正常組織腫瘤組織cyt(ng/ml)29.8001 32.283629.852631.1053(ng/ml)1.52901.87971.02971.4547/(cyt+)%4.88% 5.50%3.33% 4.46%

21、3討論現(xiàn)在檢測基因組dna甲基化主要有sssl甲基轉(zhuǎn)移酶法和測序法，英屮sssl甲基轉(zhuǎn)移 酶法由于sam和sssl甲基轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)不穩(wěn)定，易造成重復操作的同一實驗結(jié)杲誤差比較 大，必須設(shè)立自身對照來標化實驗數(shù)據(jù)；測序法需要大量的克隆測序，較為繁瑣，昂貴 1101 o最近報道lc/ms/ms測定喀噪核苛，此方法需要核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和堿性磷酸 酶等酶水解dna,由于酶活性的影響可能存在由于酶解不完全帶來的誤差liri3o另外有 報道將dna利用化學方法裂解為u密呢后，通過衍生用gc/ms測定喀呢衍生物的含量，該 方法中口密碇的衍生增加了操作的難度。本方法通過化學裂解dna既排除酶解法可能帶來

22、的誤差，又不需要衍生，大大簡化了操作。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)胞卩密睫和5甲基胞卩密呢在c18柱沒有保留，通過改變洗脫溶劑仍未 能解決，釆用適合堿性化合物的hilic柱后，胞喀噪和5甲基喀噪實現(xiàn)了分離，并發(fā)現(xiàn) hilic柱比c18柱的靈敏度高，這可能與hilic柱使用髙比例有機相有關(guān)。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸作為流動相時，胞喀唳和5甲基胞喀噪在柱上保留時間 基本一致，當流動相為ph=6或4.5的乙酸乙酸錢緩沖液時，色譜峰發(fā)生分岔的現(xiàn)象，而 ph=3.6的乙酸乙酸鍍緩沖液作為流動相時，色譜峰沒有分岔但是重現(xiàn)性不好，提示ph值 和緩沖體系對胞喀嚨和5甲基胞陀嚨的分析影響比較大，當加入0.1%甲酸讓水溶

23、液時, 胞喀唏和5甲基胞喀噪基木分離j1重現(xiàn)性較好。4參考文獻1j boumil rm, lee jt. forty years of decoding the silence in x-chromosome inactivation. i ium mol genet. 2001. 10(20): 2225-32.2 lim i in, van oa. a multistep epigenetic switch enables the stable inheritance of dna methylation states. nat genet. 2007. 39(2): 269-75.3 f

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