SDS_PAGE凝膠電泳操作

1、SDS-PAG凝膠電泳操作一、常規(guī)試劑的配制1. 30%聚丙烯酰胺貯液：丙烯酰胺150g，甲叉雙丙烯酰胺 4g，雙蒸水500ml，濾紙過濾后， 棕色瓶避光4 C保存；2. 1.5mol/L , pH 8.8 Tris-HCI 分離膠緩沖液:18.15g Tris，用 1mol/L HCl 定容至 100ml, 棕色瓶避光4 C保存；3. 1.0mol/L , pH 6.8 Tris-HCl分離膠緩沖液：12g Tris，用 1mol/L 調(diào) pH 至 100ml，棕色瓶避光4C保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室溫保存；5. 10% AP溶液：0.1g

2、 AP (過硫酸銨)加水定容至1ml，用前新鮮配制；6. 1X SDS-PAGE電泳緩沖液：25mMTris (3.0285g/L ) , 192mM甘氨酸(14.41g/L ) , 0.1%SDS (1g/L ), pH 8.30 ；7. 染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，過濾除去 雜質(zhì)；8. 脫色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2X SDS-PAGE上樣緩沖液:10% SDS 0.4ml , 0.375M Tris-HCl ( pH 6.8 ) 0.333ml，

3、甘 油0.2ml , 1%溴酚蘭10卩L,3 -疏基乙醇100卩L,加水定容至1ml，分裝后-20 C保存。二、樣品的處理1. 蛋白含量較低的酶制劑或原料樣品(1)粉劑(或顆粒)樣品稱取樣品1g,加入3-5ml蒸餾水進(jìn)行攪拌溶解1(攪拌時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行增減) ， 4000rpm離心10min ,取離心上清液等體積加入 20%的三氯乙酸聚沉 30min ,離心，棄去離心 上清液，用70%的丙酮溶液洗滌沉淀， 4000rpm離心10min,重復(fù)洗滌3-5次，將丙酮洗滌 液吹干，加入適量(1-3ml ) PBS溶解沉淀，溶解液即可用于電泳實(shí)驗(yàn)。(2 )液體樣品液體樣品經(jīng)離心后，取離心上清液等體

4、積加入20%的三氯乙酸聚沉 30min，離心，棄去離心上清液，用 70%勺丙酮溶液洗滌沉淀， 4000rpm離心10min，重復(fù)洗滌3-5次，將丙酮 洗滌液吹干，加入適量(1-3ml ) PBS溶解沉淀，溶解液即可用于電泳實(shí)驗(yàn)。2. 蛋白含量相對(duì)較高的酶制劑或原料樣品(1)粉劑(或顆粒)樣品稱取樣品1g,加入3-5ml蒸餾水進(jìn)行攪拌溶解1（攪拌時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行增減）4000rpm離心10min，取離心上清液用于電泳實(shí)驗(yàn)。（2 ）液體樣品液體樣品經(jīng)離心后，取離心上清液用于電泳實(shí)驗(yàn)。3. 未知樣品對(duì)未知樣品進(jìn)行歸類（是否為酶制劑，是哪一類酶），根據(jù)已知電泳圖譜確定該類物質(zhì)能跑出清晰電泳條帶的

5、蛋白濃度范圍，在對(duì)未知樣品進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)前，測(cè)定其蛋白含量，根據(jù)其結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)處理。三、凝膠的配制1. 設(shè)備檢漏將電泳玻璃板按順序裝好并固定，在電泳玻璃板間注滿蒸餾水，靜置15-20min，觀察是否有水浸出，若無則進(jìn)行下一步操作，反之，則拆除進(jìn)行重新安裝，并重復(fù)檢漏至無液體浸出。注：如樣品數(shù)量不多，一塊凝膠板就已足夠，則另一邊使用凝膠隔板，防止跑膠時(shí)短路。2. 分離膠的制備根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，不同濃度的SDS-PAGE分離膠的最佳分離范圍如下表蛋白質(zhì)分子量范圍（KD）適宜的凝膠濃度（%>100830-1001010-3012<1015將檢漏的蒸餾水倒出，按下表

6、進(jìn)行SDS-PAGE分離膠的配制（使用凝膠試劑盒）電泳凝膠濃度試劑8%10%12%15%HzO (ml)4.634.03.32.330%Acr-Bis (29:1 ) ( ml)2.673.34.05.01.5mol/L Tris.cl(pH 8.8 ) ( ml)2.52.52.52.510%SDS( ml)0.10.10.10.110%AP( ml)0.10.10.10.1TEME” l )4444總體積（ml）10注：如室溫高于 30 C，可適量減少 TEMED30-50%防止膠過快凝結(jié)；如室溫低于20C，可適量增加 TEMED30-50%防止膠過慢凝結(jié)。常用分離膠的濃度為 10%按上表

7、進(jìn)行配制，所有試劑加入燒杯中，充分混勻后，迅速為了使分離膠上延平直，并排除氣泡，且防止氧化），凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。3. 濃縮膠的制備分離膠制備完成后，靜置60-90min，確保分離膠凝結(jié)完全后，倒出水封液體并用濾紙把剩余的水分吸干，按下表進(jìn)行SDS-PAGE濃縮膠的配制。試劑濃度（5%HO ( ml)4230%Acr-Bis (29:1 ) ( ml)10.51.0mol/L Tris.cl(pH 8.8 )(ml)10.510%SD(卩 l )804010%AP(卩l(xiāng))6030TEME” l )84總體積（ml）63所有試劑加入燒杯中， 充分混勻后，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮

8、膠至離邊緣5mm處，迅速插入樣梳（樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平），靜置40-60min。4. 制樣吸取經(jīng)預(yù)處理后樣品 25 1與25 1上樣緩沖液混合均勻后，于沸水煮3-5min去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合，冷卻后 4000rpm離心4min。5. 上樣濃縮膠凝結(jié)后，向上槽內(nèi)倒入適量電泳緩沖液， 拔出樣梳（要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排 出，否則會(huì)影響加樣效果），向每孔內(nèi)加樣101 （加樣時(shí)移液槍要始終豎直， 且加樣迅速， 為避免邊緣效應(yīng)，最好選取中部孔注樣） 。6. 跑膠加樣完成后，在電泳槽內(nèi)加入適量電泳緩沖液，連接好冷凝水，接通電源，進(jìn)行電泳，穩(wěn)壓90V，電泳90min左右，進(jìn)入分離膠后，電壓改為120V,待溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。7. 凝膠板剝離與固定電泳結(jié)束后，取開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)（剝膠時(shí)要小心，將凝膠保持完好），用蒸餾水小心清洗 1-3次，加入固定液進(jìn)行固定 40-60min，倒出固定液，蒸 餾水清洗3-5次。8. 染色固定清