實(shí)驗(yàn)四-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-ELISA

1、實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（阻斷（阻斷ELISA)ELISA)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)1.1.定義：定義： 將抗原將抗原- -抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射放射性同位素、酶或熒光素性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原，通標(biāo)記的已知抗體或抗原，通過檢測(cè)標(biāo)記物，間接測(cè)定未知的抗原或抗體。過檢測(cè)標(biāo)記物，間接測(cè)定未知的抗原或抗體。2.2.分類：分類： 放射免疫測(cè)定法：放射免疫測(cè)定法：131131I I，3232P P 免疫熒光技術(shù)：免疫熒光技術(shù)：FITCFITC，PEPE 免疫酶測(cè)定法：免疫酶測(cè)定法：HRPHRP，APAP免疫酶測(cè)定法免疫酶

2、測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。中未知抗體或抗原的方法。（1 1）利用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物）利用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接。與酶連接。（2 2）通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定）通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。將已知抗原直接吸附于載體，加酶標(biāo)抗體將已知抗原直接吸附于載體，加酶標(biāo)抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)抗體將已知抗原吸附于固相載體，加酶標(biāo)記二抗將已知抗原吸附于固相載體，加酶標(biāo)記二抗檢測(cè)檢測(cè)液

3、相中未知抗體液相中未知抗體將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測(cè)液相中的檢測(cè)液相中的可溶性抗原可溶性抗原將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液相中的可溶性檢測(cè)液相中的可溶性抗原或抗體抗原或抗體將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記單克隆抗體將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記單克隆抗體檢測(cè)液相中的可溶性檢測(cè)液相中的可溶性抗體抗體 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（以（以ELISAELISA為例）為例）：酶標(biāo)單抗酶標(biāo)單抗酶標(biāo)單抗酶標(biāo)單抗實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料豬偽狂犬病毒（豬偽狂犬病毒（PRVPRV） 抗原抗原陰

4、性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照樣品樣品 待測(cè)豬血清待測(cè)豬血清HRPHRP標(biāo)記豬標(biāo)記豬PRVPRV單抗單抗 酶標(biāo)單抗酶標(biāo)單抗包被緩沖液：包被緩沖液：0.025M pH9.60.025M pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液洗滌液：含洗滌液：含0.05% Tween0.05% Tween 20 20的的0.01M pH7.4 PBS0.01M pH7.4 PBS底物緩沖液：底物緩沖液： pH5.0pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：底物溶液：TMBTMB（四甲基聯(lián)苯胺）（四甲基聯(lián)苯胺） ，底物緩沖液，底物緩沖液，30% H30% H2 2O O2 2，新鮮配制新鮮配制酶標(biāo)板，酶標(biāo)

5、儀酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀阻斷法測(cè)定豬偽狂犬病病毒阻斷法測(cè)定豬偽狂犬病病毒ELISAELISA抗體抗體 定性檢測(cè)定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1.1.抗原的處理：抗原的處理：2.2.包被抗原：包被抗原：取出包被好抗原的酶標(biāo)板（取出包被好抗原的酶標(biāo)板（4 4孔孔/ /組），甩干孔內(nèi)液體組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（以洗滌液（200L/200L/孔）洗滌孔）洗滌3 3次，次，3min/3min/次次3.3.加待測(cè)血清加待測(cè)血清標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100L/100L/孔孔1234陰陰性性空空白白陽(yáng)陽(yáng)性性待待測(cè)測(cè)4.4.加單抗：加單抗：3737，濕盒內(nèi)，濕盒內(nèi)，30min30min甩干孔內(nèi)液體甩

6、干孔內(nèi)液體以洗滌液（以洗滌液（200L/200L/孔）洗滌孔）洗滌3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶標(biāo)單抗各孔加入酶標(biāo)單抗100L/100L/孔孔3737，濕盒內(nèi)，濕盒內(nèi)，30min30min5.5.顯色：顯色：甩干孔內(nèi)液體甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（以洗滌液（200L/200L/孔）洗滌孔）洗滌3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液100L/100L/孔孔避光顯色，避光顯色，10min10min6.6.觀察結(jié)果觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1、取已包被豬偽狂犬病毒抗原的酶標(biāo)板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），用樣品稀釋液（、取已包被豬偽狂犬病毒抗原的酶標(biāo)板（根據(jù)樣品

7、多少，可拆開分次使用），用樣品稀釋液（PBS）將待）將待檢血清檢血清1 1稀釋后加入板孔中，每孔加稀釋后加入板孔中，每孔加100l。同樣。同樣1 1稀釋陰、陽(yáng)性對(duì)照血清，陰、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)稀釋陰、陽(yáng)性對(duì)照血清，陰、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)1孔，每孔孔，每孔100l。另設(shè)一空白對(duì)照孔，空白對(duì)照孔加。另設(shè)一空白對(duì)照孔，空白對(duì)照孔加100l稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37溫育溫育30分鐘。分鐘。2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200l，靜置，靜置3分鐘倒掉，再在吸水紙上拍干，重復(fù)分鐘倒掉，再在吸水紙上

8、拍干，重復(fù)3次。次。3、每孔加酶標(biāo)單抗、每孔加酶標(biāo)單抗100l，置，置37溫育溫育30分鐘。分鐘。4、洗板：洗滌、洗板：洗滌3次（方法同步驟次（方法同步驟2）。切記每次在干吸水紙上拍干。）。切記每次在干吸水紙上拍干。5、顯色與終止：每孔先加底物、顯色與終止：每孔先加底物A液、再液、再B液各液各1滴滴(50l)，混勻。室溫（，混勻。室溫（18-25 ）避光顯色）避光顯色10分鐘后。分鐘后。6、終止：每孔加終止液、終止：每孔加終止液1滴滴(50l) （0.25% 氫氟酸），終止反應(yīng)。氫氟酸），終止反應(yīng)。7、10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。采用波長(zhǎng)分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。采用波長(zhǎng)630nm的酶標(biāo)儀測(cè)定的酶標(biāo)儀測(cè)定OD值

9、。檢測(cè)樣本的值。檢測(cè)樣本的OD值值0.35為陽(yáng)性為陽(yáng)性8、結(jié)果判定：試驗(yàn)成立的條件是：陰性對(duì)照孔平均、結(jié)果判定：試驗(yàn)成立的條件是：陰性對(duì)照孔平均OD630值與陽(yáng)性對(duì)照孔平均值與陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD630值之差值之差0.40.4。S=樣品孔樣品孔OD630值，值，N=陰性對(duì)照孔陰性對(duì)照孔OD630值值如果如果S/N比值比值0.60.6，樣品判定為，樣品判定為PRVPRV抗體陽(yáng)性?？贵w陽(yáng)性。如果如果S/N比值比值0.70.7但但 0.6 0.6，樣品重測(cè)。，樣品重測(cè)。如果如果S/N比值比值 0.7 0.7，樣品判定為，樣品判定為PRVPRV抗體陰性抗體陰性具體操作步驟具體操作步驟 陰性：顯色為陰性：

10、顯色為藍(lán)色藍(lán)色 陽(yáng)性：無色陽(yáng)性：無色1 2 3 4陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性 陰性陰性陰性陰性常用酶及底物常用酶及底物常用酶底物加終止液前顏色加終止液后顏色辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）鄰苯二胺（OPD）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黃色藍(lán)色棕黃色藍(lán)色黃色注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1、ELISA實(shí)驗(yàn)前血清樣品盡量做到實(shí)驗(yàn)前血清樣品盡量做到37滅活滅活30分鐘。分鐘。2、在、在ELISA的整個(gè)操作過程中，洗滌是不可缺少的重要步驟，的整個(gè)操作過程中，洗滌是不可缺少的重要步驟，每加一層反應(yīng)結(jié)束后均要洗滌固相載體反應(yīng)板，目的在于防止每加一層反應(yīng)結(jié)束后均要洗滌固相載體反應(yīng)板，目的在于防止重疊引起非特異性吸附。洗滌過程