色譜柱培訓(xùn)課件

1、色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)色譜柱培訓(xùn)課件前言o色譜柱是HPLC分離過程中的核心。一支穩(wěn)定、高效的色譜柱對建立普適性強、重現(xiàn)性好的方法是必不可少的。不同供應(yīng)商的色譜柱，甚至來源相同，認為完全一樣的色譜柱之間，可能存在很大的差異，尤其是不同色譜柱在塔板數(shù)、色譜峰的對稱性、保留值、峰間距及使用壽命會有所不同，而這些不同對建立理想的HPLC方法會產(chǎn)生很大的影響色譜柱培訓(xùn)課件培訓(xùn)內(nèi)容o介紹色譜柱擔體、固定相以及柱填料信息o討論色譜柱使用過程中的問題及適宜的解決方案o同時討論在常規(guī)HPLC分析中，為獲得最佳結(jié)果，一支“好”色譜柱的重要意義色譜柱培訓(xùn)課件o色譜柱的結(jié)構(gòu)色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱與柱填料的特性o柱填料

2、：大多數(shù)使用HPLC分離的色譜柱使用硅膠微粒作為擔體。少數(shù)為多孔聚合物擔體或者其他材料的擔體o硅膠擔體與鍵合的有機表層應(yīng)用范圍廣，重點討論o常見的幾種柱填料微粒：實心微球、全多孔微球、灌注微粒色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件o實心微球型特點：實心核、起作用的是表面很薄的外殼、微粒的大小通常為1.52.5um，快速傳質(zhì)的動力學(xué)，對大分子有突出的分離效能；表面積較小，樣品容量有限，僅適用于分析型HPLC；峰型尖銳，要求HPLC儀器的柱外峰展因素極小，避免峰展寬色譜柱培訓(xùn)課件o灌注色譜柱填料：包含孔徑達40008000的貫穿孔，貫穿孔中有較小的內(nèi)聯(lián)孔（如3001000）；高流速時，對流與擴

3、散作用共同作用，進入并離開孔結(jié)構(gòu)，減小了峰展寬，柱效與小微粒相當，但壓力降卻小許多。o使用范圍：大分子如蛋白質(zhì)的制備分離，小分子較少色譜柱培訓(xùn)課件o插入色譜柱的參數(shù)意義：ID&4.6mmo顆粒（粒度）的大小在HPLC中極為重要。約5um的微粒直徑很好的兼顧了分析柱的柱效、反壓和壽命。更小的多孔微粒（如3um）對快速分離很有效。o較窄的粒度分布（50%均值）能保證填充柱的穩(wěn)定、高效和壓力降最小色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件硅膠填充微粒o物理特性：機械強度很高，可保證填充柱長時間在很高的操作壓力下工作，柱效穩(wěn)定；使柱的反壓較低，壽命較長。o制作工藝：良好的控制制作工藝，能夠得到

4、平均孔徑變化范圍寬（如8、30、100um）、孔徑分布范圍較窄和粒度選擇較大（如10、5、3um）的填料。能滿足大、小分子的分析和制備色譜柱培訓(xùn)課件o硅膠擔體的表面性質(zhì)極為理想，其表面可以通過化學(xué)改性引入種類繁多、具有不同官能團的鍵合相o硅膠基質(zhì)填料與水及所有有機溶劑兼容，更換溶劑時，填料大小不會變化（例如溶脹）。這種特性使填充床在用各種類型溶劑時以及使用梯度洗脫期間，仍保持穩(wěn)定色譜柱培訓(xùn)課件o硅膠擔體并非完美無缺：在pH8.0以上條件下，硅膠能溶解；硅膠表面顯酸性，不適宜于堿性物質(zhì)的分離o插入硅膠溶解曲線色譜柱培訓(xùn)課件o硅羥基一般存在三種類型色譜柱培訓(xùn)課件o自由或孤立（無氫鍵鍵合）的硅羥基一

5、般產(chǎn)生于低濃度中。含自由、酸性硅羥基濃度高的硅膠往往使堿性物質(zhì)的保留值增加，峰變寬、拖尾。o完全羥基化的硅膠基質(zhì)填料，具有高濃度成對的與締合的硅羥基，最有利于堿性物質(zhì)分離。（查成對硅羥基的酸性）色譜柱培訓(xùn)課件o硅膠擔體的純度對許多極性化合物的分離極為重要。某些硅膠被一定的金屬污染（Al、Fe、Zn、Ni等）o這些金屬雜質(zhì)能與螯合溶質(zhì)絡(luò)合，引起不對稱、拖尾色譜峰，甚至化合物被完全保留，不能洗出o硅膠晶格中的其他金屬（尤其是鋁）能使表面硅膠硅羥基活性增強，酸性增強o建議：采用色譜級試劑！色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件硅膠分類oA型硅膠：過去純度不高的硅膠，適用于分離中性和非電離的化合物oB型硅膠：新

6、型高純度的弱酸性硅膠，一般對離子或可電離的化合物，尤其是堿性物質(zhì)的分離較好oB型硅膠的意義：見FDA批準的化藥堿性藥物表色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件多孔聚合物填料o優(yōu)點：聚合物微粒有些是疏水性的，可直接用于反相，不需添加表面涂層；在pH113均可用；很強的疏水保留性（相對于硅膠基質(zhì)的C18柱）o缺點：柱效低，一般不到類似的硅膠基質(zhì)色譜柱的一半；在不同有機溶劑中溶脹程度不同。o使用范圍：非常適用于蛋白樣品的分離色譜柱培訓(xùn)課件其他無機填料o石墨碳o氧化鋁色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱的結(jié)構(gòu)o不銹鋼柱管：不銹鋼柱管：可用于所有的有機溶劑與大多數(shù)水性緩沖液，然而含氯的流動相會緩慢地“

7、鹵素腐蝕”不銹鋼柱管，尤其是低pH條件下o柱管不銹鋼成分（鐵、鎳、鉻）牢固絡(luò)合的樣品可能發(fā)生這類問題，但因為色譜柱內(nèi)壁的表面積很小，發(fā)生不良反應(yīng)的機會不大色譜柱培訓(xùn)課件o多孔燒結(jié)物（濾片）：多孔燒結(jié)物（濾片）：封閉色譜柱的兩端，固體色譜柱的填料o一般來說，5um與3um的微粒分別用2um與0.5um孔徑的不銹鋼濾片o發(fā)生不良反應(yīng)的可能比色譜柱內(nèi)壁大得多o峰型不好與樣品回收率低可能預(yù)示濾片出現(xiàn)問題色譜柱培訓(xùn)課件o壓帽：壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。o密封環(huán)：密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與

8、柱外壁的密封。色譜柱培訓(xùn)課件o接頭：接頭：柱兩端連接流動相與柱管的中空環(huán)套，由不銹鋼制成。用于柱管路聯(lián)通與柱端高壓固定。o封頭：封頭：柱兩端的密封螺絲，用于保存色譜柱時封頭。o柱填料柱填料色譜柱培訓(xùn)課件固定相o鍵合硅膠：在硅膠擔體表面上共價鍵有機硅烷或沉積聚合物有機涂層o使用最廣泛的有機硅烷鍵填料的表面反應(yīng)式見下圖：色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件結(jié)論o多官能團鍵合相與單官能團的鍵合相相比：多官能團鍵合相在低pH條件下，它更穩(wěn)定；但多官能團鍵合相的保留值與選擇性卻更不穩(wěn)定o單官能團硅烷反應(yīng)的優(yōu)點：重現(xiàn)性好，一個硅羥基與一個硅烷分子反應(yīng)，產(chǎn)生可預(yù)測的結(jié)構(gòu)，柱效最高色譜柱培訓(xùn)課件o鍵合相

9、配體的空間位阻效應(yīng)，表面的硅羥基不能完全參與反應(yīng)o隨鏈長或者硅烷體積的增大，參與反應(yīng)的硅羥基比例相應(yīng)的減少o即使最小的硅烷（三甲基或C1），其表面上也有近50%的硅羥基未被反應(yīng)色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件o封尾：指鍵合填料與小硅烷進行后續(xù)反應(yīng)，如三甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷等。反應(yīng)掉殘余的硅羥基，增加擔體覆蓋率，盡量減少與溶質(zhì)發(fā)生不良反應(yīng)。o缺點：在低pH（pH3）反相分離中，極易從填料上水解色譜柱培訓(xùn)課件RPC中鍵合相的保留行為o鍵合相填料的有機物含量（如百分含碳量）大致能說明一特定色譜柱的保留能力o鍵合相擔體的表面積是一主要因素：表面積越大，保留值k越大o樣品保留值一般隨鍵合碳鏈長度而增加

10、（C18C8C3C1），但長鏈之間的差別并不大（即C8C18）o鍵合相可將樣品的保留值控制在一定范圍內(nèi)，但隨著填料的表面積與所用硅膠擔體類型的改變而變化（柱間差異）色譜柱培訓(xùn)課件鍵合相色譜柱的穩(wěn)定性o相同情況下，長鏈的烷基鍵合相填料（如C8、C18）一般比短鏈的鍵合相更穩(wěn)定色譜柱培訓(xùn)課件實例色譜柱培訓(xùn)課件結(jié)論o試驗證明：長鏈的C18與C8配體明顯更穩(wěn)定（鍵合相流失引起的保留值變化不大）o隨著鏈長度的減小，固定相的穩(wěn)定性也降低o這是許多用戶喜歡用他們的原因之一色譜柱培訓(xùn)課件o硅膠基質(zhì)鍵合相的穩(wěn)定性（壽命）與硅膠擔體和鍵合相的類型有直接的關(guān)系o色譜柱穩(wěn)定性也很大程度上取決于流動相的pH，所用緩沖液

11、與有機溶劑的種類o硅烷鍵合相的損失歸咎于將硅烷鍵合于擔體上的Si-O-Si鍵的水解，高溫、低pH及水比例高的流動相中，離解加劇，而這些又是對許多樣品分離較好的條件。色譜柱培訓(xùn)課件o改善硅烷固定相在低pH條件下穩(wěn)定性的另一個方法：使用空間保護官能團。色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件o有空間保護的硅膠基質(zhì)固定相的穩(wěn)定性很高o實例o色譜條件：色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件o盡管大多數(shù)分離在低pH條件下進行最好（pH3），但有些分離須在高pH條件下進行o原因：o有關(guān)化合物在低pH條件下不穩(wěn)定o在低pH條件下，達不到所需選擇性o質(zhì)子化的（親水的）堿性化合物子低pH條件下保留太小色譜柱培訓(xùn)課件o柱

12、填料封尾可以減少硅膠基質(zhì)色譜柱在在中等與高pH條件下，硅膠擔體溶解o實例o色譜條件：色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件結(jié)論o小分子封尾硅烷在硅羥基加成反應(yīng)產(chǎn)生了疏水層，有效延緩硅膠擔體的溶解色譜柱培訓(xùn)課件建立pH7.0以上的普適性方法的策略色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件o保留值與選擇性變化的原因：o硅膠擔體不同o硅烷的選擇性：單官能團或多官能團o鍵合的徹底性：部分反應(yīng)或完全反應(yīng)o是否封尾o鍵合化學(xué)o擔體表面積色譜柱培訓(xùn)課件o任何情況下，在規(guī)定的色譜柱上建立的方法，都應(yīng)該用至少兩個其他批次柱進行證實后，才可采用！o不同廠家的同種色譜柱很少得到相同的分離?。ǖ像R、菲羅門、安捷倫）色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課

13、件色譜柱的性能指標o色譜柱的有關(guān)要求：o某指定k值的塔板數(shù)o峰不對稱因子As（或者拖尾因子）o兩種不同溶質(zhì)的選擇性o色譜柱的反壓o保留值k的重現(xiàn)性o鍵合濃度o色譜柱的穩(wěn)定性色譜柱培訓(xùn)課件o塔板數(shù)N：產(chǎn)生尖銳、窄譜峰，以及小值時色譜峰達到良好分離度的能力色譜柱培訓(xùn)課件峰不對稱與拖尾o峰不對稱與拖尾能導(dǎo)致：o塔板數(shù)與分離度測定不準o定量不準o分離度降低與峰尾中的小峰檢不出o保留值的重現(xiàn)性不好o理想柱的色譜峰As值為0.921.1（絕對對稱峰的As值為1.0）色譜柱培訓(xùn)課件o峰不對稱性與拖尾因子的計算色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件o色譜柱失效：色譜柱的壽命應(yīng)有多長？o如果塔板數(shù)下降50%或分離度約降至

14、四分之三，則可能需要更換色譜柱。o建議：建立色譜柱信息臺賬，對色譜柱的塔板數(shù)、拖尾因子、分離度、柱壓、保留值、進樣時間進行登記。發(fā)現(xiàn)色譜柱可能失效，提前申報采購。（記錄最后一針的色譜信息即可）色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱問題與解決方案o保留值與分離度重現(xiàn)性不好的可能原因：色譜柱培訓(xùn)課件o解決有關(guān)重現(xiàn)性不好問題，通常有以下幾點：o在整個應(yīng)用中都采用同一固定相、粒度和柱尺寸o選擇良好的流動相，盡量減小硅羥基效應(yīng)o確保流動相充分平衡色譜柱色譜柱培訓(xùn)課件譜峰拖尾o當出現(xiàn)拖尾峰時，估算柱塔板數(shù)與分離度是將偏高o對于不對稱因子為1.2的峰（峰拖尾因子約為1.5），用半高峰寬方法計算使塔板數(shù)偏高30%，計算分離度的

15、誤差高達15%！o如果用中性化合物測試新柱，如顯示峰嚴重不對稱，不可用于方法建立！色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱培訓(xùn)課件o拖尾峰常見于使用過度的色譜柱柱口贓物或塌陷，部分堵塞進口濾板o填補柱塌陷對價值較高的色譜柱最實用（手性柱、制備柱）o在建立常規(guī)分析方法時，用保護柱可以減小強保留樣品組分積聚可能性的有效方法o注入的樣品溶劑強度大于流動相時，往往會造成早流的色譜峰變形和拖尾色譜柱培訓(xùn)課件實例色譜柱培訓(xùn)課件o并非適用于所有的情況，例如阿奇霉素腸溶干混o對于難溶性的物質(zhì)，可以先用強溶劑溶解后，再同流動相稀釋色譜柱培訓(xùn)課件o與HPLC設(shè)備有關(guān)的柱外效應(yīng)可以引起峰拖尾與色譜峰變寬：o進樣體積過大o進樣閥、色譜柱

16、及檢測器之間的管線體積過大o檢測器流動池體積過大色譜柱培訓(xùn)課件實例色譜柱培訓(xùn)課件o建議：o進樣體積要?。ㄒ话?5uL）o進樣閥與色譜柱，色譜柱與檢測器之間用細內(nèi)徑的短連接管線（例如，20cm,內(nèi)徑為0.07cm）o確保所有管線用匹配的接頭正確連接o使用易清洗、體積小的檢測器流通池（8uL）色譜柱培訓(xùn)課件色譜柱壽命o色譜柱失效的原因：o進口濾片或柱床部分堵塞o吸附有贓物o柱填充不良o機械及熱沖擊造成空洞o擔體或固定相遭化學(xué)侵蝕色譜柱培訓(xùn)課件o色譜柱將失效的一些癥狀：o柱壓增高o色譜峰拖尾o塔板數(shù)下降o選擇性下降o保留值減?。▔A性化合物的保留值增大）色譜柱培訓(xùn)課件o色譜柱濾板問題：o往往是部分堵塞濾片或色譜柱進口處的凹陷o密封墊與轉(zhuǎn)子磨損造成的微粒是堵塞濾片的主要來源；定期更換泵密封墊與進樣閥轉(zhuǎn)子一般能減少濾片的堵塞色譜柱培