硅膠柱色譜層析楊列超

1、目錄柱層析原理柱層析原理柱層析裝柱方法柱層析裝柱方法柱層析上樣方法柱層析上樣方法注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 一、柱層析原理一、柱層析原理1、柱層析技術(shù)、柱層析技術(shù)(chromatography) 又稱柱色譜技術(shù)，又稱柱色譜技術(shù)，主要原理是根據(jù)樣品主要原理是根據(jù)樣品 混合物中各組分在固定相和混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分配將組分分流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分配將組分分離開來(lái)。離開來(lái)。 2、柱層析操作時(shí)，先在圓柱管中先填充不溶性基柱層析操作時(shí)，先在圓柱管中先填充不溶性基質(zhì)，形成一個(gè)固定相。將樣品加到柱子上，用特質(zhì)，形成一個(gè)固定相。將樣品加到柱子上，用特殊溶劑洗脫，溶劑組成流

2、動(dòng)相。在樣品從柱子上殊溶劑洗脫，溶劑組成流動(dòng)相。在樣品從柱子上洗脫下來(lái)的過程中，根據(jù)樣品混合物中各組分在洗脫下來(lái)的過程中，根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分配將組分分離。配將組分分離。 常用溶劑的極性常用溶劑的極性 常用溶劑的極性順序：石油醚環(huán)己烷常用溶劑的極性順序：石油醚環(huán)己烷/己烷苯己烷苯乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水甲醇水 極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng) 極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng) 極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)極性大

3、的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng) 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸二、二、柱層析裝柱方法柱層析裝柱方法 1、操作要點(diǎn)、操作要點(diǎn)：裝柱前柱底要墊一層脫脂棉以防裝柱前柱底要墊一層脫脂棉以防吸附劑外漏。吸附劑外漏。 裝柱子（添硅膠）時(shí)，有裝柱子（添硅膠）時(shí)，有兩種兩種方法：即方法：即濕法裝柱濕法裝柱和干法裝柱和干法裝柱，二者各有優(yōu)劣。，二者各有優(yōu)劣。不論干法還是濕法，不論干法還是濕法，硅膠（固定相）的上表面一定要硅膠（固定相）的上表面一定要平整，平整，并且硅膠并且硅膠（固定相）的高度一般為（固定相）的高度一般為15cm左右，太短了可能左右，太短了可能分離效果不好，太長(zhǎng)了也會(huì)由于

4、擴(kuò)散或拖尾導(dǎo)致分離效果不好，太長(zhǎng)了也會(huì)由于擴(kuò)散或拖尾導(dǎo)致分離效果不好。分離效果不好。 （1）濕法裝柱是先把硅膠用適當(dāng)?shù)娜軇┌鑴蚝螅穹ㄑb柱是先把硅膠用適當(dāng)?shù)娜軇┌鑴蚝螅偬钊胫又?，然后再加壓用淋洗劑再填入柱子中，然后再加壓用淋洗?“走柱子走柱子”，本法最大的本法最大的優(yōu)點(diǎn)是一般柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒有氣優(yōu)點(diǎn)是一般柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒有氣泡。泡。（2）干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后）干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)，至硅膠界面不再下降為止，再輕輕敲打柱子兩側(cè)，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，然后再填入硅膠至合適高度，最后再

5、用油泵直接抽，這樣就會(huì)使得柱子裝的很結(jié)實(shí)。接著是用淋洗劑這樣就會(huì)使得柱子裝的很結(jié)實(shí)。接著是用淋洗劑“走柱子走柱子”，一般淋洗劑是采用一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。 干法裝柱較方便干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于，但最大的缺陷在于“走柱子走柱子”時(shí)，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手時(shí)，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到），摸柱子明顯感覺到），容易產(chǎn)生氣泡容易產(chǎn)生氣泡，這一點(diǎn)在，這一點(diǎn)在使用低沸點(diǎn)的淋洗

6、劑時(shí)如乙醚，二氯甲烷更為明使用低沸點(diǎn)的淋洗劑時(shí)如乙醚，二氯甲烷更為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時(shí)候，氣泡就會(huì)釋放出來(lái)，嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)柱子的時(shí)候，氣泡就會(huì)釋放出來(lái)，嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)柱子變花，樣品不可能平整地通過，當(dāng)然也就談不上變花，樣品不可能平整地通過，當(dāng)然也就談不上分離了。分離了。 解決的辦法是：第一、硅膠一定要填結(jié)實(shí)；第二、解決的辦法是：第一、硅膠一定要填結(jié)實(shí)；第二、一定要用較多的溶劑一定要用較多的溶劑“走柱子走柱子”，一定要到柱子，一定要到柱子的下端不再

7、發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。的下端不再發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。也也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂，防止有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂，防止添加溶劑的時(shí)候，使得樣品層不再整齊。但我的添加溶劑的時(shí)候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個(gè)必感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個(gè)必要。要。 勻漿法：勻漿法： 攪成勻漿。攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油醚用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?乙酸乙乙酸乙酯酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體

8、系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無(wú)水硫不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無(wú)水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無(wú)水氯化鈣干燥，以除去酸鈉久置干燥。氯仿用無(wú)水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對(duì)酸敏感，不能用氯仿體系過的醇。如果樣品對(duì)酸敏感，不能用氯仿體系過柱。柱。 三、柱層析的上樣方法三、柱層析的上樣方法 將欲分離的樣品溶于少量裝柱時(shí)用的洗脫劑中，將欲分離的樣品溶于少量裝柱時(shí)用的洗脫劑中，制成體積小、濃度高的樣品溶液，加入層析柱中制成

9、體積小、濃度高的樣品溶液，加入層析柱中硅膠面上。如樣品不溶于裝柱時(shí)用的洗脫劑，則硅膠面上。如樣品不溶于裝柱時(shí)用的洗脫劑，則將樣品溶于易揮發(fā)的溶劑中，并加入適量硅膠將樣品溶于易揮發(fā)的溶劑中，并加入適量硅膠（不超過柱中硅膠全量的（不超過柱中硅膠全量的1/10）與其拌勻，除盡與其拌勻，除盡溶劑，將拌有樣品的硅膠均勻加到柱頂（始終保溶劑，將拌有樣品的硅膠均勻加到柱頂（始終保持洗脫劑有一定的液面），再覆蓋一層硅膠即可。持洗脫劑有一定的液面），再覆蓋一層硅膠即可。 上樣也有干法和濕法之分：干法就是把待分離的上樣也有干法和濕法之分：干法就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻樣品用少量溶劑溶

10、解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液，沿著層析柱內(nèi)壁均勻膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液，沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。然后用少量溶劑洗滌后，再加入。濕法較加入。然后用少量溶劑洗滌后，

11、再加入。濕法較方便，熟手一般采用此法。方便，熟手一般采用此法。 上樣完畢后，接著即上樣完畢后，接著即用淋洗劑淋洗。用淋洗劑淋洗。 淋洗劑一般采用淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開劑的比例再分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把TLC分析分析得到的展開劑用在柱層析時(shí)，也顯得極性偏大，得到的展開劑用在柱層析時(shí)，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴(kuò)散作用來(lái)分離，效果也不會(huì)好?？繑U(kuò)散作用來(lái)分離，效果

12、也不會(huì)好。 上樣時(shí)注意沿著柱內(nèi)壁慢慢加入，始終保持硅膠上樣時(shí)注意沿著柱內(nèi)壁慢慢加入，始終保持硅膠上端表面平整；上樣量為硅膠的上端表面平整；上樣量為硅膠的1/601/30。 洗脫洗脫 洗脫劑的選用可通過薄層色譜篩選，洗脫劑的選用可通過薄層色譜篩選，一般一般TLC展展開時(shí)開時(shí)Rf 值為值為0.20.3的溶劑系統(tǒng)是最佳的洗脫系的溶劑系統(tǒng)是最佳的洗脫系統(tǒng)，采用梯度洗脫法洗脫。統(tǒng)，采用梯度洗脫法洗脫。 先打開柱下端活塞，先打開柱下端活塞，保持洗脫劑流速保持洗脫劑流速12滴滴/秒。上端不斷添加洗脫劑秒。上端不斷添加洗脫劑（可用分液漏斗控制添加速度與下端流出速度相（可用分液漏斗控制添加速度與下端流出速度相近

13、）。如單一溶劑洗脫效果不好，可用混合溶劑近）。如單一溶劑洗脫效果不好，可用混合溶劑洗（一般不超過三種溶劑），通常采用梯度洗脫。洗（一般不超過三種溶劑），通常采用梯度洗脫。 洗脫劑的洗脫能力由弱到強(qiáng)逐步遞增。洗脫劑的洗脫能力由弱到強(qiáng)逐步遞增。 收集處理收集處理 等份收集洗脫液，每份收集量大概與所用硅膠的等份收集洗脫液，每份收集量大概與所用硅膠的量相當(dāng)。每份洗脫液采用薄層定性檢查，合并含量相當(dāng)。每份洗脫液采用薄層定性檢查，合并含相同成分的洗脫液。經(jīng)濃縮、重結(jié)晶處理往往可相同成分的洗脫液。經(jīng)濃縮、重結(jié)晶處理往往可得到某一單體成分。如仍為幾個(gè)單體成分的混合得到某一單體成分。如仍為幾個(gè)單體成分的混合物，不易析出單體成分的結(jié)