霉菌和毒素的檢測方法

1、食品中霉菌及毒素的檢測方法專 業(yè)：食品科學Number 1研究背景及意義研究背景及意義 Number 2霉菌的檢測方法霉菌的檢測方法 Number 3毒素的檢測方法毒素的檢測方法 Number 4參考文獻參考文獻目目 錄錄contents霉菌 霉菌廣泛分布于自然界中，由于其可形成各種微小的孢子， 因而很容易污染食品。霉菌毒素 霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的一種有毒的次生代謝產(chǎn)物，毒素污染會導致營養(yǎng)價值降低，引起動物疾病，并直接或間接危害人類健康。1 研究背景及意義 自從20 世紀 60 年代發(fā)現(xiàn)強致癌的黃曲霉毒素以來,霉菌與霉菌毒素對食品的污染日益引起重視。我國在2011 年頒布了國家標準 GB2761

2、-2011食品中真菌毒素限量,各級食品監(jiān)督檢測機構全面開展霉菌的檢測工作。方法01GB4789.15-2010 食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)。方法02食品中霉菌和酵母計數(shù) PetrifilmTM測試片法。2.1霉菌檢測方法03菌落計數(shù)結果和報告結果和報告0405鏡檢鏡檢培養(yǎng)培養(yǎng)0201樣品的稀釋樣品的稀釋2.1食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù) 2.1.1 樣品的稀釋 2.1.2 培養(yǎng) 肉眼觀察，必要時可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應的霉菌和酵母數(shù)。以菌落形成單位（colony forming units，CFU）表示。 選取菌落數(shù)在 10 CFU150 CFU的平

3、板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計數(shù)霉菌和酵母數(shù)霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。 2.1.3 菌落計數(shù) 2.1.4.1 結果 計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)計算。 若所有平板上菌落數(shù)均大于 150 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。 若所有平板上菌落數(shù)均小于 10 CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。 若所有稀釋度平板均無菌落生長，則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)計算；如為原液，則以小于 1計數(shù)。 2.1.4.2 報告 1)菌落數(shù)在 100 以內(nèi)時，按“四舍

4、五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報告。 2)菌落數(shù)大于或等于 100 時，前 3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前 2 位數(shù)字，后面用0 代替位數(shù)來表示結果；也可用 10 的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。 3)稱重取樣以 CFU/g 為單位報告，體積取樣以 CFU/mL 為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母數(shù)。 2.1.5 鏡檢B.1 檢樣的制備：取定量檢樣,加蒸餾水稀釋至折光指數(shù)為 1.34471.3460（即濃度為7.9%8.8%），備用。 B.2 顯微鏡標準視野的校正：將顯微鏡按放大率 90125 倍調(diào)節(jié)標準視野，使其直徑為 1.382 mm。

5、 B.3 涂片：洗凈郝氏計測玻片，將制好的標準液，用玻璃棒均勻的攤布于計測室，以備觀察。 B.4 觀測：將制好之載玻片放于顯微鏡標準視野下進行霉菌觀測，一般每一檢樣觀察 50 個視野，同一檢樣應由兩人進行觀察。 B.5 結果與計算：在標準視野下，發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲其長度超過標準視野（1.382mm)的1/6或三根菌絲總長度超過標準視野的1/6（即測微器的一格）時即為陽性（+），否則為陰性（-），按100個視野計，其中發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲體存在的視野數(shù)，即為霉菌的視野百分數(shù)。 2.1 食品中霉菌和酵母計數(shù) PetrifilmTM測試片法PetrifilmTM霉菌和酵母測試片： 1）測試片中添加抗生素，可抑

6、制細菌生長； 2）含有酵母菌指示劑，使酵母菌更易計數(shù)； 3）適用與菌落總數(shù)、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特氏菌。酶酶 聯(lián)聯(lián) 免免 疫疫 吸吸 附附 法法熒光檢測熒光檢測法法近紅外光近紅外光譜法譜法微柱法微柱法薄層色譜薄層色譜法法. . 氣相色譜氣相色譜和氣質(zhì)譜和氣質(zhì)譜聯(lián)用法聯(lián)用法高效液相高效液相色譜法和色譜法和液質(zhì)聯(lián)用液質(zhì)聯(lián)用2.2 霉菌毒素檢測方法 ELISA 是利用抗原抗體反應原理 ，已知抗原吸附在酶標板上 加入酶標記抗體和樣品提取液并混合均勻，充分反應后用去離子水洗去多余抗體，再加入酶的底物，產(chǎn)生有色物質(zhì)，最后加入終止液使反應終止。柳其芳 2006 ELISA法操作簡單、檢測速度快

7、、成本低，適用于大批量樣品的快速篩選。蔣建云 2006 等也用此法檢測飼料中黃曲霉毒素 B1 的含量，不但特異性強 提取純化步驟簡單，結果也易判讀 回收率在 90%左右。 2.2.1 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 法 2.2.2 熒光檢測法 熒光檢測法 FLD 常結合免疫親和柱使用，是美國 AOAC 的標準檢測方法，我國國標(GB/T 18979-2003)也采用此法檢測黃曲霉毒素的含量，檢測樣品經(jīng)甲醇/水提取后、過濾、稀釋。用含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和柱層析凈化，超純水洗去雜質(zhì)，甲醇洗脫，加入溴溶液衍生后用熒光光度計測定。趙東豪等 2009 此法也常用來檢測玉米赤霉烯酮等。熒光檢測法方便、快

8、捷、花費少、不需使用霉菌毒素的標準品，減少對人的傷害 也常作為快速篩選方法使用。 2.2.3近紅外光譜法 近紅外光譜法（NIR）是近年來發(fā)展得比較快的光譜分析技術。 NIR 可以用來檢測小麥中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等霉菌毒素。使用 NIR 分析，樣品不需預處理，多種組分可以同時測定，分析速度快，重現(xiàn)性好，但是此方法必須先建立準確的校正模型， 適用于經(jīng)常性質(zhì)量控制分析。 2.2.4 微柱法 微柱法：將樣品提取液通過氧化鋁-硅鎂型吸附劑填充的微柱，樣品中的雜質(zhì)被氧化鋁吸附，霉菌毒素則被硅鎂型吸附劑吸附，在紫外分析燈下觀察熒光環(huán)與標準比較定量 本法簡便快速、靈敏度高。主要用于飼料中黃曲霉毒素的篩選。微

9、柱凝膠免疫監(jiān)測儀 2.2.5 薄層色譜法 薄層色譜法：將樣品提取液在薄層板上點樣， 展開后，用吸收法或熒光法對被測樣品與標準品掃描測定。對于黃曲霉毒素B1的檢測，我國國標采用(TLC)法，該方法更適于確認黃曲霉毒素 存在與否。氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法2.2.5 氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法 氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法20世紀70年代，氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法開始用于霉菌毒素的檢測毒素等單端孢霉烯族毒素。常采用氣相色譜法檢測，食品中毒素的檢測，由于未知成分較多，一般采用與質(zhì)譜聯(lián)用，靈敏度也有較大的提高，檢測限更低。 高效液相色譜法較早用于霉菌毒素的檢測 常用的檢測器有熒光、紫外、二極管陣列、蒸發(fā)光散射等檢測器，目前使用最廣泛的檢測霉菌毒素的方法 涉及到畜牧化工和食品等各行業(yè)。2.5.6. 高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用液相色譜HPLC-MS具有靈敏度高、特異性強、精確度和選擇性好等特點，能夠對霉菌毒素進行準確的定性分析，不但檢測霉菌毒素還可以檢測結構類似的其他物質(zhì) ,但是儀器設備比較昂貴 檢測成本高 操作步驟復雜 因此目前國內(nèi)的普及率不高。2.5.6 高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用4 參考文獻1 龔阿瓊，胡駿鵬.常見霉菌毒素的危害及檢測方法J,2014;2 施震地.食品中霉菌檢測方法探究J，2012；3 GB4789.15-2010 食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)；4