

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文檔簡介
1、Bit1基因在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達及對報告基因激活作用的檢測(1)作者:滑瑋,張偉,呂海鵬,辛?xí)匝唷娟P(guān)鍵詞】凋亡; Bit1 基因;酵母菌雙雜交;報告基因ExpressionofBit1geneinayeasttwohybridsystemandreportergeneactivationassay【 Abstract 】AIM:ToconstructabaitvectorwithBit1geneinyeasttwohybridsystemGAL4,andassaywhetherBit1geneexpressionproductaffectsthegrowthofhostyeastcells
2、andactivatesthereportergenesintheyeasttwohybridsystem.METHODS:TheBit1genefragmentswereamplifiedbyRTPCRfromovariancellCaov3,andclonedintopUC19forDNAsequencing.AfterverifiedbyDNAsequencing,theyweresubclonedintothebaitvectorpGBKT7ofyeasttwohybridsystemGAL4,andtherecombinantplasmidsweresubsequentlytrans
3、ferredintoyeastcellAH109,anditsexpressionproductwastestedwhetheritcouldactivatethereportergenesintheyeasttwohybridsystem.RESULTS:TheBit1genefragmentsweresuccessfullyamplified,andtheirexpressionproductshowedtobenontoxictoAH109cells,anddidnotactivatethereportergenesoftheGAL4system.CONCLUSION:Yeasttwoh
4、ybridGAL4systemcanbeutilizedtostudyBit1interactingprotein.【 Keywords 】apoptosis;Bit1;yeasttwohybridsystem;reportergenes【摘要】目的:用 Bit1 基因片段構(gòu)建酵母雙雜交 誘餌載體,并檢測其表達產(chǎn)物對酵母細胞有無毒性作用及對 報告基因有無激活作用.方法:運用 RTPCR 技術(shù)從卵巢癌細 胞系 Caov3 中擴增出Bitl 基因片段,克隆入 pUC19 質(zhì)粒, 經(jīng)測序正確后,再克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7 中,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌 AH109,檢測其表達產(chǎn)物在酵母細胞 中
5、對報告基因有無激活作用 . 結(jié)果 :成功獲得 Bit1 基因片段, Bitl 基因表達的蛋白對酵母菌AH109 無毒性,對報告基因亦無激活作用 . 結(jié)論:可以利用酵母雙雜交 Gal4 系統(tǒng)來研究與 Bit1 相互作用的蛋白 .【關(guān)鍵詞】凋亡; Bit1 基因;酵母菌雙雜交;報告基因 【中圖號】 R7370 引言酵母雙雜交系統(tǒng)是一種直接在真核細胞內(nèi)檢測蛋白相 互作用的方法,具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)點 . 自 1989 年 由 Fields 等1提出并初步建立以來,得到了不斷的完善 和改進,在細胞生物學(xué),腫瘤學(xué), 蛋白質(zhì)組學(xué)等諸多領(lǐng)域有 著廣泛的應(yīng)用 2-3 .Jan 等 4在研究 bcl2 轉(zhuǎn)
6、錄調(diào)控的實驗中,發(fā)現(xiàn)了一種可下調(diào) bcl2 表達的新基因,并因其功能而命名為 Bit1 ( bcl2inhibitoroftranscription1). 研究表明,胞漿內(nèi) Bit1 濃度的升高可以明顯促進凋亡的發(fā)生, 而其濃度的降低可以減少凋亡的發(fā)生 . 我們擬利用酵母雙雜 交 GAL4 系統(tǒng),構(gòu)建 Bitl 蛋白即誘餌蛋白,以期從人腦 cDNA 文庫中釣取可與之結(jié)合的蛋白基因,為研究細胞凋亡的發(fā)生 和調(diào)節(jié)提供新的思路和實驗依據(jù) .1 材料和方法材料卵巢癌細胞系 Caov3 購自中國醫(yī)科大學(xué)細胞生物研 究所,表達載體 pGBKT7 及酵母菌種 AH109 購自 Clontech 公 司. 質(zhì)
7、粒pUC19 由第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研 室張偉博士惠贈.逆轉(zhuǎn)錄酶購自 Promega 公司;PCR 試劑盒, DNA 重組所用的限制性內(nèi)切酶購自Takara 公司;T4DNA 連接酶購自 Gibco 公司;質(zhì)粒提取試劑盒,DNA 電泳膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程公司;酵母培養(yǎng)基購自Clontech公司 .方法擴增 Bit1 基因自行設(shè)計出克隆 Bit1 基因的引物 . 常規(guī) 培養(yǎng)Caov3 細胞,提取細胞總 RNA,加入下游引物和逆轉(zhuǎn)錄酶, 45C各作用 30min 進行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件為:70C10min,42C45min,95C5min.再取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入引物P1 和 P
8、2 擴增Bit1 基因 .PCR 反應(yīng)條件為: 94C30s,61C45s, 72C50s,共進行 38 個循環(huán) .產(chǎn)物克隆及鑒定純化的RTPCF 產(chǎn)物經(jīng) EcoRI 和 BamHt雙酶切,定向克隆入 pUC19 質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,進 行藍白篩選 . 酶切鑒定出含插入片段的陽性克隆,命名為 pUC19Bit1 ,然后進行序列分析 .構(gòu)建及鑒定誘餌載體用 EcoRI和 BamH酶切 pUC19- Bit1 和表達載體 pGBKT7 回收 Bit1 基因及 pGBKT7 載體片 段,載體片段與Bit1 基因連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a .經(jīng)限 制性內(nèi)切酶分析 , 含正確插入片段的克隆命名
9、為pGBKT7-Bit1.制備酵母感受態(tài)細胞隨機挑取幾個酵母菌 AH109 克隆, 接種于 50mLYPDA 液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至 A600=在室溫 下將培養(yǎng)液離心, 棄上清, 重懸沉淀, 洗滌酵母細胞 . 再離 心取沉淀, 用 mL1xTE/LiAc 溶液重懸,即為酵母感受態(tài)細 胞.轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞將構(gòu)建好的誘餌載體,鯡魚精 DNA 和酵母感受態(tài)細胞,混勻后加入 mLPEG/LiAc 溶液.在 30C振 蕩培養(yǎng),加入 DMSC 后混勻,在 42C水浴 15min,冰浴 2min,離 心,去上清,以mL1XTE 重懸細胞后,鋪于 SD/Trp 平板.于 30C培養(yǎng) 36h 左右,直至帶有
10、誘餌載體的酵母克隆長出和 LacZ 報告基因表達的檢測用無菌牙簽隨機挑取酵母 菌單個克隆,分別劃線于有 Trp , Ura, His , Leu 營養(yǎng)缺陷 的 SD 平板上,于 30C培養(yǎng) 36h,觀察酵母菌的生長情況.采 用B半乳糖苷酶印膜法檢測 lacZ報告基因的表達.用無菌牙 簽隨機挑取酵母單個克隆,點樣于硝酸纖維素濾膜上 . 將帶 有酵母克隆的濾膜在液氮中迅速冷凍 5s 后,置于室溫裂菌 . 將 點 有 菌 體 的 濾 膜 面 朝 上 ,放 在 另 一 張 同 樣 大 小 浸 有 Zbuffer/Xgal 的 Whatman#1濾紙上,去氣泡,于 30C孵育 30min8h,觀察顏色變化.2 結(jié)果 基因的擴增采用優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄方法對人卵巢癌細胞系Caov3 總 RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄,然后在 50 卩 L 反應(yīng)體系中繼續(xù)擴 增反應(yīng).取 RTPCRT 增產(chǎn)物 10 卩 L,在 10g/L 瓊脂糖凝膠中電 泳,可見與預(yù)期大小一致的600bp 左右的 DNA 片段(圖 1).重組質(zhì)粒 pUC19- Bit1 的酶切鑒定及測序用EcoRI 和BamH雙酶切pUC19質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物, 回收pUC19載體片段 及 Bit1蛋白基因片段, 連接后獲得的重組質(zhì)粒命名為 pUC19 Bit1.再用EcoRI和 BamH對 pUC19
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