基因工程總結(jié)

1、第一章緒論1基因工程的含義：按照人們的意愿，進行嚴密的設計， 通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)， 有目的 地改造生物種性，使現(xiàn)有的物種在較短時間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出更符合人們需求的新的生物類型。2、基因工程的優(yōu)點： 打破物種間基因交流的隔離界限；克服常規(guī)育種的周期長，效率低的缺點， 定向改造生物性狀；可按照人的意愿去改造物種。3、基因工程理論依據(jù)： 不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；基因是可分割的；基因是可以轉(zhuǎn)移的； 多肽與基因之間存在對應關(guān)系；遺傳密碼是通用的；基因可以通過復制傳遞給下一代。注：基因工程及其應用的圖解看看第二章DNA重組的相關(guān)技術(shù)及原理1、重組DNA技術(shù)的原理重組DNA技術(shù)是指將一種

2、生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然 后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物 或新性狀的DNA體外操作程序2、堿性SDS法提取質(zhì)粒 DNA原理：強堿使所有DNA變性沉淀，而pH為中性時，質(zhì)粒DNA復性快，形成閉合環(huán)狀從沉淀物中分離。3、提取DNA總的原則 保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度； 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 其他核酸分子，如 RNA也應盡量去除。4、核酸鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定5、 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能夠識別雙鏈 DNA分子中的某種特定

3、核苷酸序列(4-8bp)，并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷幵的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。6、限制性內(nèi)切酶的命名 用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌 (Escherichia coli )Eco流感嗜血菌(Haemophilus in flue nzae ) Hin 用一個右下標的大寫字母表示菌株或型。如Ecok, Ecor (現(xiàn)在都寫成平行，如EccR)。 如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制性內(nèi)切酶，用羅馬字母表示。如EcoRI，EccRV)屬名種名 株名Haemophilus influenzae D 嗜血流感桿菌 D株Hind IIIEcoRI Es

4、cherichia coliRIHindm Haemophilus influensae d 川Sad (II) Streptomyces achromagenes I ( n )7、限制性核酸內(nèi)切酶的作用機制以環(huán)狀和線形的雙鏈 DNA為底物，在適合的反應條件下，識別一定的核苷酸序列，使兩條核糖鏈上特定位置的磷酸二酯鍵斷幵，產(chǎn)生具有3'- 0H基團和5'- P基團的片段。8、同裂酶：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。如Hi nd m和Hsul。不完全同裂酶：識別位點相同，但切點不同。如Xma和Sma。9、 同尾酶:識別的序列不同，但能

5、切出相同的粘性末端。 如BarHI、Bgl n、BclI、Xhon 等10、酶活性單位(U):在最適反應條件下，一個 DNA分子上含有一個酶切位點，60 min內(nèi)切割1 :g入DNA所需的酶量稱為一個單位。11、星號(* )活性：如果改變反應條件就會影響酶的識別位點專一性和切割效率，稱為星號(* )活性。12、基因工程的其他酶(1) DNA連接酶:DNA連接酶能催化雙鏈 DNA切口處的5'-磷酸和3'-羥基生 成磷酸二酯鍵。；(2) DNA聚合酶 (Klenow fragment )性質(zhì) 5' ：3'聚合酶活性。3' ：5'外切酶活性。(失去了

6、5' ：3'外切酶活 性) 用途 3'端補平 DNA的3'末端標記，在3'隱蔽端加上標記的dNTPcDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定 DNA序列（3）核酸酶S1催化反應類型:ss-DNA； ss-RNA；雙螺旋變性區(qū)13、聚合酶鏈式反應 PCR : PCR技術(shù)就是在體外中通過酶促反應有選擇地大 量擴增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。加入4種物質(zhì)：（1）作為模板的DNA序列；（2） 與被分離的目的基因兩條鏈各自5'端序列相互補的DNA引物（ 20個左 右堿基的短DNA單鏈）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP （dATP, dTTP,

7、dGTP 和 dCTP。14、PCR技術(shù)的原理（1）DNA模板變性（2）DNA模板與引物復性（3）DNA鏈的延伸15、PCR的過程第一步 預變性（pre-denature ） 90-95 °C下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。第二步 變性（denature ）雙鏈完全變性成單鏈第三步 復性（anneal）37-60 °C下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復性。引物的濃度高引物的鏈短。第四步 延伸（extend）72 °C下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3 '端 上加上核苷酸。第五步變性進入循環(huán)重復94 °C下1分鐘，新合成的 DNA雙鏈又變性

8、成單鏈模板。16、PCR擴增特異性DNA片段的主要條件（1）TaqDNA聚合酶（2）引物（primer）（4）模板（template）（5）dNTPs（6）Mg 2+的濃度17、PCR的特點（1）特異性強（2）敏感性高（3）快速（4）簡便（5）可以擴增mRNA18、電泳的基本原理DNA在中性或偏堿性的緩沖液中帶負電，在電泳過程中處于凝膠靠負極端的DNA通過凝膠分子篩向正極端移動。19、電泳遷移率：與DNA分子的構(gòu)型和大小有關(guān)與DNA分子中的堿基組成和順序無關(guān)DNA分子的構(gòu)象（型）：1型：超螺旋環(huán)狀U型：帶切口環(huán)狀川型：線狀相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快；線性分子次之；伸展幵環(huán)狀

9、最慢20、影響連接反應的因素（1）插入片段與載體的濃度比例（1020倍 增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。）（2）反應溫度（一般1416C ）(3) 反應緩沖液第三章基因的克隆載體1、 載體：在基因工程操作中，攜帶目的基因、實現(xiàn)目的基因進入受體細胞，并在其中得以無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。2、按功能劃分： 克隆載體(cloning vector):使目的片段能在細菌細胞中復制的載體。 表達載體(expression vector):使目的基因能在細菌細胞中表達為RNA或蛋白質(zhì)的載體。3、基因克隆載體的必備條件： 多克隆位點；能自我復制，有一個復制起點

10、；選擇性標記；安全。4、 標記基因的作用：指示外源 DNA分子(載體或重組分子)是否進入宿主細胞；指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。這種指示也可以是選擇性的，也可以是非選擇性的，絕大多數(shù)為后者。5、 質(zhì)粒：獨立于染色體以外的能自主復制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。6、 質(zhì)粒的空間構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀DNA( cccDNA);幵環(huán)DNA(ocDNA):線形 DNA(IDNA)7、質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率:scDNA最快、L DNA次之、ocDNA最慢。8、質(zhì)粒的不親和性(不相容性)：任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中， 這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不親和性或不相容性，這兩

11、種質(zhì)粒稱為不親和性質(zhì)粒，組成不親和性群；而彼此能夠共存于一個細胞中稱為親和 性質(zhì)粒，親和質(zhì)粒則屬于不同的不親和群。9、天然質(zhì)粒的局限性: 分子量大，拷貝數(shù)低；篩選標記不理想；單一酶切位點少或無10、質(zhì)粒載體的構(gòu)建策略： 提高質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)；引入多克隆位點MCS;引入抗性標記基因；克隆載體DNA分子應盡可能小；在克隆載體中組裝“元件”。10、篩選重組子的示意圖重點11、：互補：藍白斑選擇原理： X-gal :：-半乳糖苷酶的顯色反應； lacZ的：互補。12、穿梭質(zhì)粒載體： 人工構(gòu)建的、具有兩種不同復制起點和選擇標記、可以在兩 種不同的寄主細胞中存活和復制的質(zhì)粒載體。13、Ti質(zhì)粒載體：存在于

12、能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導冠癭瘤 形成，又稱腫瘤誘導質(zhì)粒。14、Ti質(zhì)粒作為載體的可能性：能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上；能轉(zhuǎn)化多種植物；強啟動子一一T-DNA的opine合成酶基因上游有一個強啟動子，能啟動外源基因的表達。15、天然Ti質(zhì)粒作載體的缺點：分子量太大（200kb）;限制性酶切位點太多。被轉(zhuǎn)化的植物細胞成為腫瘤， 不能再分化。在大腸桿菌中不能復制。16、Ti質(zhì)粒的改造：保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能部分（vir基因，左右邊界）。減少限制性酶切位點， 引入單一插入位點。取消T-DNA的致瘤基因，使被轉(zhuǎn)化的植物細胞不再成為腫 瘤，能正常分化。冠癭堿合成對于植物無意義。應剔除掉

13、。加入大腸桿菌的ori和選擇標記。加上真核生物的轉(zhuǎn)錄信號和結(jié)束信號以及添加polyA的信號序列。17、Ti載體的類型：共整合載體一一需要同源重組才能插入外源基因；雙 元載體一既有大腸桿菌復制起點也有農(nóng)桿菌復制起點，是個穿梭載體。18、cos位點：DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點。19、天然：噬菌體作為載體的局限性： ：噬菌體的非必需區(qū)太長；非必需區(qū)段上常用的單一限制酶切點少；選擇 標記基因少；載體的安全性20、：噬菌體載體的構(gòu)建：構(gòu)建策略： 刪除：噬菌體的非必需區(qū)，在這個非必需區(qū)內(nèi)制造限制酶切點，刪除DNA必需區(qū)段上常用的限制酶切點；在非必需區(qū)引進選擇標記

14、基因。建 立DNA重組分子體外包裝系統(tǒng)21、 cosmid載體（粘粒）：一類由人工構(gòu)建的含有 入噬菌體 DNA的 cos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，cos site carry ing vectors。22、酵母人工染色體： YAC的特點：（1）只能在酵母細胞中擴增。（2）克隆容量大，為230kb-1700kb。（3）構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。 YAC的組成結(jié)構(gòu)：（1）著絲粒區(qū)（Cen）; （2）端粒（Tel ）； （3）復制起點（Ori ）；（4） 克隆位點；（5）在酵母中的標記基因；（6）在細菌中操作；第四章目的基因的制備1、基因組文庫：將某種生物整個基因組DNA切割成大小合適

15、的片段，并將所有這些片段都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和無性擴增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，也稱為基因文庫2、基因組文庫構(gòu)建的一般步驟： 基因組DNA片段的制備；載體的準備一一相應的酶切，脫磷酸化等處理阻止 載體自連；載體與基因組DNA片段的連接粘性末端直接連接；人工接頭法；同聚物加尾；轉(zhuǎn)化細胞和克隆選擇。3、cDNA文庫：利用某種生物的總 mRNA合成cDNA再將這些cDNA與載體連接， 轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱 cDNA文庫(cDNAibrary)，也稱基因文庫(gene library)。4、cDNA文庫的特點： 以mRNA為材料，是RNA病

16、毒進行基因克隆的唯一途徑。 不含內(nèi)含子序列，可以在細菌中直接表達。 克隆數(shù)比DNA文庫小的多，容易篩選。 常來自結(jié)構(gòu)基因，包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因，篩選的假陽性率低。 結(jié)構(gòu)基因的表達具有器官、代謝階段特異性，由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫也就不同。 在同一個cDNA文庫中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的， 表現(xiàn)不均 勻性。5、不對稱 PCR( asymmetric PCR)目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是 50:1或100:1,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。6、 差別雜交：需要兩種不同的細胞

17、群體 (目的基因正常表達、 目的基因不表達)， 分別制備兩種不同 mRNA提取物，以兩種總mRNA探針平行雜交，對有表達目的基 因的總mRNA反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建的cDNA文庫進行篩選。7、差別雜交的局限性： 雜交靈敏度低，對于低豐度的mRNAt為明顯；工作量大，需大量的雜交濾膜和鑒定大量的噬菌斑；重復性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導致雜交信號不一致。8、消減雜交：原理：通過DNA復性動力學原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建消減文庫的方式來分離目的基因。有 mRNA肖減雜交和基因組消減雜交。前者適合分析兩樣本中 差異表達的基因，后者適合克隆兩樣本特異性存在的基因。9、mRNAg異顯示 PCR

18、( DD RT-PCR:用3 '-端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA的第一鏈；用 3 '-端錨定引物和 5'-端10-mer隨機引物組成引物對，以反轉(zhuǎn) 錄第一鏈為模板進行PCR 擴增( mRNA differe ntial display RT-PCR,DDRT-PCR，在標準的序列膠中電泳23小時，可顯示出 50100條長度在1005000 bp之間的DNA條帶。10、染色體步移(chromosome walking )： 首先以已知基因或分子標記為探針從基因組文庫中篩選與其有共同序列的克隆，再以該克隆為探針從文庫中篩選與其有部分重疊序列而且更靠近目的基因的新克隆，同

19、理，再以新克隆為探針依次篩選新克隆，直至所需克隆的目的基因。11、基因芯片技術(shù)(gene chip)特點：高度并行性：提高實驗進程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀；多樣性：可進行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差；微型化：減少試劑用量和反應液體積，提高樣品濃度和反應速率；自動化：降低成本，保證質(zhì)量。第五章目的基因?qū)胧荏w細胞1、DNA體外連接應注意的事項： 插入片段與載體的酶切位點互補 DNA插入的方向正確 插入基因的幵放閱讀框（ORF正確（1）DNA定位插入載體 （2）起始密碼 防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量（2）用堿性磷酸酶處理載體2、大腸桿菌受體細胞的選擇 重組缺陷型：避

20、免與受體基因組進行同源重組，便于重組DNA獨立存在 限制缺陷型：避免修飾和降解，使重組 DNA穩(wěn)定存在易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導：提高細 胞的通透性，較高的轉(zhuǎn)化率 遺傳互補型：有明顯的選擇性差異，有利于重組體篩選具有較好的翻譯后加工，有利于真核基因表達 感染缺陷型：防止感染，安全性高，無致病基因3、感受態(tài)大腸桿菌的制備制備原理：當細菌處于0C、二價陽離子（如 CaT、Mg+等）低滲溶液中時，細 菌細胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；此時轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA形成抗DNA酶的羥基 -鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，重組 DNA在 42 C短時間熱沖擊后吸附在細胞表 面而利于進入，在豐富培養(yǎng)基中生長數(shù)小時后，球狀細胞恢復

21、原狀并繁殖。4、外源DNA導入細菌的幾種方法（1）轉(zhuǎn)化 （2）轉(zhuǎn)染（3）轉(zhuǎn)導5、重組質(zhì)粒導入受體的轉(zhuǎn)化方法（1）熱激法或熱休克轉(zhuǎn)化法（2）電轉(zhuǎn)化法（3）平板培養(yǎng)細菌6、重組DNA導入真核細胞（1） 酵母細胞利用原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化利用Li +鹽進行轉(zhuǎn)化（2） 植物細胞農(nóng)桿菌介導法電擊法 基因槍法（3） 哺乳動物細胞 磷酸鈣沉淀法脂質(zhì)體（lipofectin）載體法 顯微注射法 DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法7、重組體克隆的篩選和鑒定遺傳表型直接篩選法DNA電泳檢測法核酸雜交檢測法 免疫化學檢測法 轉(zhuǎn)譯篩選法真核生物常用的重組基因選擇方法DNA序列測疋8、根據(jù)載體的抗藥性標記進行篩選PBR322抗菌素標記選

22、擇（圖已省-打出來黑的） 四環(huán)素抗性基因 氨芐青霉素抗性基因 :-半乳糖苷酶顯色反應選擇法9、核酸雜交檢測法 Souther n hybridizatio n原理 根據(jù)毛細血管作用的原理，使在凝膠電泳中分離的 DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合到適當?shù)?濾膜上，然后通過同已標記的單鏈 DNA或 RNA探針進行雜交，以檢測被轉(zhuǎn)移 DNA片段，成為DNA印跡雜交技術(shù)。也稱 Southern雜交 Norther n hybridization原理指根據(jù)毛細管作用的原理，使在凝膠電泳中已分離的 RNA專移并結(jié)合到適當?shù)臑V 膜上，然后通過同已標記的單鏈 DNA或 RNA探針進行雜交，以檢測被轉(zhuǎn)移RNA片段，稱為 RN

23、A印跡雜交技術(shù)，也稱為 Northern雜交（Northern blot ） Dot blot hybridizati on 原理在雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的用于快速檢測特異核酸分子的雜交技術(shù)。將核酸樣品直接轉(zhuǎn)移到適當?shù)臑V膜上，然后進行雜交檢測。 Colony and plaque hybridizati on 原理將菌落或噬菌斑直接轉(zhuǎn)移到濾膜上，使溶菌班變性的DNA同濾膜原位結(jié)合，然后進行雜交測驗。雜交后根據(jù)雜交信號及其相對應的菌落或噬菌斑的位置，便可從大量菌落或噬菌斑中篩選出含有目標基因序列（與探針同源）的菌落或噬菌斑。所以，有時也稱菌落（噬菌斑）原位雜交。11、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

24、原理：一抗（primary antibody ）: 與目標分子的特異結(jié)合。二抗（sec on dary an tibody ）: 與一抗的特異性結(jié)合。酶聯(lián)（enzyme-link ）:二抗上攜帶一種酶能催化一種反應將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標分子的含量。12、一般克隆與篩選策略13、HAT法原理選擇培養(yǎng)基中有次黃嘌呤、 氨基喋啉和胸苷,培養(yǎng)基中的氨基喋啉阻斷細胞核苷酸的全程合成，但啟動以次黃嘌呤為底物進行核苷酸的補救合成途徑， 不受氨基 喋啉的抑制，另外培養(yǎng)基中的胸苷可通過胸苷激酶的作用合成核苷酸，tk+能合成核苷酸，而tk_不

25、能合成而死亡。14、二氫葉酸還原酶基因（DHFR （看圖背原理）（1）選擇原理 二氫葉酸還原酶的必要性：真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR田胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存，不需要補救！DHFR細胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。不能在無胸苷和 次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。當加入胸苷和次黃嘌呤，DHFR-細胞可通過補救合成途徑維持生長。需要補救！ 胸苷和次黃嘌呤補救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸苷和次黃嘌呤分別補救:（2）選擇過程 宿主細胞DHFI細胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生

26、長）。需要胸苷和次黃嘌呤補救！ 無核苷酸的培養(yǎng)基透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補救。 氨甲喋啉“加壓”添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性 DHFR的補救作用，可提高選擇 載體標記dhfR因。只有轉(zhuǎn)入 dhfI基因的細胞才能生存。15、報告基因：是種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其 表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。16、幾種常用的報告基因(1) 大腸桿菌的B -D-葡萄糖醛酸糖苷酶(B -D-glucuronidase , GU$;(2) 細菌和螢火蟲的熒光素酶(luciferase , luc )；(3) 水母綠色熒光蛋白(GFP 基因(Green Fluoresce nt Pro

27、tein )。17、DNA序列測定的方法(1) 化學降解法測序原理：一個末端標記的DNA片段在4組互相獨立的化學反應中分別得到部分降解，其中每一組反應特異的針對某一種或某一類堿基。 造成堿基的特異性切割，由此 產(chǎn)生的一系列具有不同長度的 DNA寡聚核苷酸鏈，經(jīng)凝膠電泳分離和檢測，讀出 核苷酸序列。(2) 雙脫氧鏈終止法測序原理：(1) DNA聚合酶在模板指導下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3' -OH末端，能利用單鏈的 DNA乍為模板合成出準確的 DNA互補鏈；(2)如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP),由于雙脫氧核糖的3'位置上缺少一 個羥基，故不能同后續(xù)的 dNTP形成

28、磷酸二酯鍵，從而終止 DNA鏈的延長。即形 成一種全部具有相同5'-引物端和以ddNMP殘基為3'端結(jié)尾的一系列長短不一 片段的混合物。聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DNA從而讀取DNA勺核苷酸序列。18、雙脫氧終止法測序反應體系包括 DNA聚合酶 單鏈DNA模板 引物，通常由20-23個堿基構(gòu)成，G+C=12 A+T=8到11，Tm=60-68C，避免形 成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)Mg2+ 4 種 dNTP(dATP,dGTP,dCTP和 dTTP) 4 種 ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCT啣 ddTTP)第六章 外源基因的表達1、外源基因的表達系

29、統(tǒng)：基因工程的主要目的之一，就是要制備大量有用的蛋白質(zhì)和多肽，尤其是人體蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正確的方向插入表達載體，連在啟動子的后面，導入相應的宿主細胞，即可進行表達。在不 同的表達系統(tǒng)中，其表達方式不盡相同。2、外源基因的有效表達關(guān)鍵：起始轉(zhuǎn)錄。3、mRNA勺延伸與穩(wěn)定性：外源基因的有效表達的關(guān)鍵：保持mRNA勺有效延伸、終止及穩(wěn)定存在。構(gòu)建載體需考慮因素：避免非特異性終止，加入抗終止序列；加入正常轉(zhuǎn)錄終止序列，減少DNA反向轉(zhuǎn)錄為反義mRNA勺機會；選擇受體菌Rnase缺失(原核)；加入poly(A) 的信號序列AAUAAA有利于mRNA勺正確加工(真核)。4、表達蛋白

30、在細胞中的穩(wěn)定性幾個方面考慮：融合蛋白，外源蛋白與受體蛋白有良好的雜合構(gòu)像；分泌蛋白，外源蛋白能分泌到細胞周質(zhì)腔或直接分泌到培養(yǎng)基；包涵體，外源蛋白 以包涵體的形式存在與于受體細胞；選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)5、融合蛋白的優(yōu)點：融合蛋白較穩(wěn)定，不易被細菌蛋白酶水解?？衫冕槍υ瞬糠值膯慰惯M行親和層析，便于純化。原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，釋放出天然的真核蛋白 質(zhì)。目的蛋白溶解性好，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多 具有水溶性。6、分泌蛋白的優(yōu)點：目的蛋白穩(wěn)定性高；目的蛋白易于分離；目的蛋白末端完整。7、包涵體形式的優(yōu)點：能簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作；能在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定8 啟動子：能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始 mRN/合成的DNA序列。9、啟動子的分離：隨機克隆法；聚合酶保護法；過濾膜結(jié)合法；PCR擴增法10、隨機克隆法：選用適當?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化切割的染色體DNA分子；接著將切割產(chǎn)生的 DNA限制