一種基于激光全息共聚焦掃描顯微鏡測量透明液體三維溫度的應(yīng)用

1、一種基于激光全息共聚焦掃描顯微鏡測量透明液體三維溫度的應(yīng)用Peter B. Jacquemin*，Rodney A. Herring1(University of Victoria, Department of Mechanical Engineering, 3800 Finnerty Road, BC, Canada V8P 5C2）摘要：激光全息共聚焦掃描（CSLH）顯微鏡是利用一束聚焦激光束測量流體溫度在三維空間的分布情況。激光束通過樣品并被參考光束干涉形成全息圖。折射率的變化將引起全息圖邊緣移位。邊緣移位取決于材料的溫度、壓力或者成分。層析重建算法是為了顯微鏡而派生出的基于光束的數(shù)值孔

2、徑的算法。窄視角掃描受限于激光探測樣品的數(shù)值孔徑和錐角大小，這些因素會增加樣品三維數(shù)據(jù)的誤差。顯微鏡的全息術(shù)攝影保留了全息圖中基于ak/10波邊緣的0.1C敏感溫度下對象的相位。通過實驗數(shù)據(jù)得到在三維重建中的溫度分辨率在1C。激光全息概念和層析重建全息圖數(shù)據(jù)的方法可以被應(yīng)用于測量精密的位移、溫度、壓力以及構(gòu)成激光波長附近位置的分辨率。微流體和其他領(lǐng)域的研究和應(yīng)用技術(shù)將會考慮到激光全息共聚焦掃描的這種獨特的測量特點。關(guān)鍵詞：共聚焦；顯微鏡；全息圖；激光；三維重構(gòu)1.介紹赫林1在1997年首次公開發(fā)布了結(jié)合共聚焦顯微鏡和全息術(shù)概念得到的一個3D顯微鏡圖像。相比只對振幅和光強度敏感的光學(xué)顯微鏡而言，

3、全息顯微鏡可以記錄下研究對象的振幅和相位甚至于光線的全部信息。標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡下的樣本會吸收光譜能量，這會忽視相位性能和對折射率的敏感程度。激光全息共聚焦掃描顯微鏡的全息圖是利用激光傳輸通過標(biāo)本產(chǎn)生的折射率累積效應(yīng)的測量方式。相移是全息圖邊緣移位表現(xiàn)出的，全息圖的邊緣移位是由于折射率的改變的。折射率是由介質(zhì)或者樣本中的光波長以及透過樣本的廣成長度決定的。激光全息共聚焦掃描顯微鏡的公交特點降低了圖像的像差，同時利用迪克遜2等人研發(fā)的特殊光學(xué)幾何結(jié)構(gòu)提高三維掃描圖像的分辨率。激光全息共聚焦掃描顯微鏡的全息技術(shù)提供了一種利用相位測量樣品折射率的方法。樣品的相位通過折射率值的推算就可以推導(dǎo)出基于光學(xué)特性

4、的流體的溫度。激光焦點在樣品中的點擴散函數(shù)為170lm，這是通過Zemax光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計軟件和實驗測量出的。當(dāng)掃描的計算網(wǎng)格增加625lm/步，在三維環(huán)境下（立體像素大小），每625lm的計算網(wǎng)格內(nèi)都能產(chǎn)生獨立的分辨率。然后再結(jié)合多組掃描全息圖就可以重建樣品的三維折射率。利用激光與樣品相互作用的測量結(jié)果表現(xiàn)為傳感器或全息圖中的厚度累積效應(yīng)。通過樣本長度的累計折射率通常被稱為層析重建中的氡線積分。侯賽因和沙克赫爾3在這個試驗中已經(jīng)利用激光掃描到了樣本中的三維圖形。侯賽因和沙克赫爾3解釋了相位解纏但只能得到透過樣本厚度的平均溫度。Tieng和Chen4應(yīng)用了一種改進后的聯(lián)立代數(shù)方程重建技術(shù)對空氣流

5、動進行三維重建，但是基于幾何構(gòu)型的敏感性存在誤差。激光全息共聚焦掃描顯微鏡限制了激光探針探測樣本時的掃描角度的數(shù)值孔徑，這樣會導(dǎo)致重建矩陣和矩陣的奇異性出現(xiàn)差錯。激光全息共聚焦掃描顯微鏡的挑戰(zhàn)在于在一個受限制的掃描視角中產(chǎn)生較低的重建誤差。高分辨率的全息圖是利用8184像素的CCD線掃描相機記錄下的。激光全息共聚焦掃描顯微鏡的一個獨特的特性是樣品的完整3D折射率可以從沒有任何旋轉(zhuǎn)掃描的單一視角或者觀測窗口中得到。掃描光束穿過樣品只采用探針重建的數(shù)值孔徑。3D成像的兩個要求即是激光全息共聚焦掃描顯微鏡成像的需求。樣品相對于射線必須是透明的，同時掃描探針必須是一個匯聚光束而不是一個平面光。不同之處

6、在于匯聚光束透過樣品作為焦點的是掃描沿著光束的傳播軸，而平面光不能區(qū)分透過樣品路徑的任何焦點。每一次掃描都會給出全息圖測量的累計厚度折射率。這需要一個由雅克曼和赫林5,6提出的名為“威利”的獨特的重構(gòu)方法，從而將厚度掃描全息圖轉(zhuǎn)化為3D模式。3D模式指出了樣品某一點的相位和強度?！巴彼惴ɡ盟械南辔粶y量和已知的邊界條件計算樣品每一點的折射率。另一種基于斷層掃描三維重建的方法也是為激光全息共聚焦掃描顯微鏡而開發(fā)，這種方法是為了顯示樣品的幾何信息從而被萊7等人提出。“威利”算法的優(yōu)點在于不需要提前驗證樣品信息。共聚焦光學(xué)掃描全息術(shù)的更詳盡的研究由雅克曼8,9等人實施。一種簡單的生成全息圖的方

7、法如圖1所示，將物體光束和參考光束并排連接，構(gòu)成的夾角使得重疊的部分和其他部分在相機中生成全息圖。這種光學(xué)布局需要在掃描時移動樣品，同時激光全息共聚焦掃描顯微鏡利用電流計光束控制反射鏡從外側(cè)轉(zhuǎn)化為樣品的激光探針焦點。圖1參考光束與物光束在圖像平面疊加形成全息圖1.1.與其他全息顯微鏡的相似和異同激光全息共聚焦掃描顯微鏡是類似于相位成像顯微鏡，它對透明樣本的相移很敏感，這通常是由于溫度梯度變化或者是成分變化引起的。一種特殊的區(qū)別是溫度的測量是通過光線傳播的軸向還是樣本的深度。對于層析重建，通過限制視角改變數(shù)值孔徑或者光纖錐角將產(chǎn)生奇異矩陣或者過度重建誤差，這是由于重建矩陣的缺陷引起的。共聚焦顯微

8、鏡通常采用針孔透過一個狹窄的熒光樣品的光譜帶。散焦射線受阻將減弱聚焦深度。共聚焦顯微鏡逐點掃描樣品，并且通過樣品深度的多平面疊加重構(gòu)一個圖形。多平面疊加后的合成圖像接近無限的景深。區(qū)別在于激光全息共聚焦掃描顯微鏡使用共焦光學(xué)減少了對全息圖的光學(xué)畸變以及掃描鏡傾斜式與參考光束產(chǎn)生的偏離軸線誤差。錐角三維重建方法需要至少160°的掃描角度，激光全息共聚焦掃描的錐角掃描時使用二十八條探測光束。充電誤差是通過包括沿著側(cè)壁的邊界溫度條件建立，這種方法用于顯微鏡的特點。描繪幾何體，利用在整個樣本上分布的邊緣射線束以及邊界條件的稀疏成都來進行重建矩陣的反演和三維重建。1.2.限制和性能激光全息共聚

9、焦掃描顯微鏡可以通過阻斷參考光束從而很容易地被成像顯微鏡控制，這對于檢測不透明生物樣本很有好處，同時可以提供全息模式中透明區(qū)域結(jié)構(gòu)的敏感性。激光全息共聚焦掃描顯微鏡類似于數(shù)字全息顯微鏡或者相位成像顯微鏡，但是它不能生成一個圖像，而是將全息圖轉(zhuǎn)換為溫度或者是溫度的組合圖。探針光束的數(shù)值孔徑可以相對地提高重建的精確度，這將在樣本上產(chǎn)生更大尺寸的焦斑同時減少光學(xué)分辨率。一種折衷于高光學(xué)分辨率和低重建誤差的設(shè)計達到了0.32的數(shù)值孔徑以及一個模糊光斑直徑為220lm的探測光束。位置分辨率采用光束控制鏡是0.1mat和625lm的掃描步距。一個k/20波的可溶解的邊緣變化可以引起的溫度誤差是0.02&#

10、176;C，這代表了樣品試管5毫米深度時的平均溫度變化。溫度穩(wěn)定性由電池中的加熱器的功率、三重絕緣熱電偶的冷節(jié)點決定，全息圖的穩(wěn)定性由高壓電流阻尼的光學(xué)儀器的主動隔振控制。相移的限制在相位掃描中不能超過一個波長，否則波長或者周期的數(shù)值是不確定的，相位解纏也是不能實現(xiàn)的。這限制了槽內(nèi)溫度6度以內(nèi)的變化。添加一個不同波長的激光可以將溫度區(qū)間擴大到50攝氏度，同時由于相位解纏能力會保持穩(wěn)定的溫度分辨率。2.激光全息共聚焦掃描顯微鏡的設(shè)計和實驗步驟激光全息共聚焦掃描顯微鏡采用光束轉(zhuǎn)向鏡和轉(zhuǎn)化模塊掃描一個如圖2所示的固定液態(tài)樣品。激光全息共聚焦掃描光學(xué)設(shè)計的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)是在掃描時，針孔光闌在共焦光學(xué)截面

11、要保持靜止。共焦光學(xué)減少了光學(xué)像差，比如彗形象差和虛擬光圈，這在樣品中都是重要的光學(xué)共軛焦點。在掃描期間，全息圖的光學(xué)畸變減少是因為只有樣本射線透過焦點和針孔光闌才能產(chǎn)生全息圖。激光全息共聚焦掃描顯微鏡的光學(xué)設(shè)計如圖2所示，示意圖展示了一束直徑可從35nm擴展到456nm的藍色激光，然后波陣面被分為兩個間距為6mm的D形波束。光線進入到光束轉(zhuǎn)向鏡(BSM)部分，得到了樣本中由間隙提供的±2.5mm的x軸和y軸掃描結(jié)果。光線從BSM部分傳出進入到一個光學(xué)循環(huán)，它在樣本放置處包含一個遠心鏡頭。一個在光學(xué)循環(huán)中繼透鏡中的潛望鏡改變了光線的傳播方向，并且在立方分束器上建立了一個光平面。圖2

12、CLSH顯微鏡的光學(xué)設(shè)計通過待測樣本的光束為物光束，繞過待測樣本的光束是參考光束。參考光束透過液體樣本，恒定的折射率產(chǎn)生了相同的焦點，物體光束也將再準(zhǔn)直。全息圖將顯示每一個掃描位置，除了激光全息共聚焦掃描顯微鏡產(chǎn)生的光學(xué)相移沒有光路穿過的位置。這些光學(xué)畸變對測量產(chǎn)生的影響，將會記錄在全息圖的每一個掃描位置上。然后采用流體樣本測量來消去光學(xué)影響。圖3 CSLH顯微鏡的內(nèi)部結(jié)構(gòu)遠心鏡頭系統(tǒng)安裝在傳輸軌道上，并且沿著光學(xué)傳播軸向即Z軸掃描方向。這個裝置為掃描提供了一個固定的樣本，這樣可以明顯的減輕震動。降低樣本的震動干擾對于敏感性的科學(xué)研究是非常重要的，比如這些干擾會產(chǎn)生微重力的影響。液態(tài)樣本中的聚

13、焦光束被設(shè)定為f/4焦比或者28度的收斂角，這樣可以降低重建誤差（見第4節(jié)）。光線在同一立方分光鏡出離開光學(xué)回路，它們進入并方向傳播到BSM部分。隨后光線被分離到共聚焦光學(xué)部分，它們通過一個共焦雙針孔焦點到達液體樣品的物體光束位置。雙針孔孔徑定義了一個共軛光學(xué)配置樣本內(nèi)的焦點，消除了過度的球面像差以及光束擴展器、BSM部分、光學(xué)循環(huán)不憤和潛望鏡頭產(chǎn)生的彗形像差。然后光線通過另一個遠心鏡頭進行二次瞄準(zhǔn)，然后射入到雙光楔或菲涅耳雙棱鏡。被光楔或雙棱鏡偏轉(zhuǎn)后的光束干涉到CCD相機。通過BSM部分的你想光束傳播提供了樣品光束的固定焦點，同時參考光束在掃描時進入到雙針孔孔徑中。進一步的細節(jié)雅克曼5在其他

14、光學(xué)研究中提出。圖3顯示了一個安裝在光學(xué)平臺上的激光全息共聚焦掃描顯微鏡。圖示免回的是一個用于這些實驗的457nm的藍色激光，一個658nm的紅色激光（沒有在這些實驗中用到）以及一些光學(xué)組件如反射鏡、鏡頭。光學(xué)棱鏡和千分尺。這種顯微鏡包含一個新港XPS-C8運動控制器、新港氣動隔震以及劍橋工藝的BSMs電流計。傳輸段有一個0.1lm的位置分辨率，并且被一個虛擬儀器程序控制。圖4中顯示的是一個包含均BK7玻璃溶液的試管在底部3毫米以上的部位加熱。試管底部的加熱器給液體樣品提供了一種基于徑向擴散的溫度梯度。用一根熱電偶探針測量邊緣溫度和內(nèi)部溫度實現(xiàn)整個計算網(wǎng)格的重建方法。圖4 熱電偶與底部加熱器拋

15、光石英玻璃是一個內(nèi)部規(guī)格為5×5×45立方毫米的透明容器。它被裝滿了Carg實驗室與BK7液體電池相匹配的硅油。硅油的折射率是一個和波長與溫度相關(guān)的函數(shù)，它的折射率在波長為457nm以及溫度為25攝氏度的條件下為1.4670。和波長相關(guān)的折射率是由柯西方程得到，并由Cargille實驗室BK7規(guī)格的匹配液提供。折射率(n)轉(zhuǎn)換為溫度(T)是基于折射率硅油的特性，有以下方程給出： (1)溫度的范圍在15到35攝氏度。溫度范圍被控制在小于7攝氏度是為了在測量液體樣本點時避免相移大于單個邊緣的間距。溫度范圍大于7攝氏度時需要進行相位解纏。高濃度的硅油減小了對流電流并且提供了加熱時

16、所需的導(dǎo)熱方式。穩(wěn)態(tài)熱傳導(dǎo)條件提供了光柵掃描測量顯微鏡的特點。探針的大小和熱電偶可以降低任何對流電流和低溫散熱器的影響。圖 5掃描和重建時的坐標(biāo)系和計算平面如圖5所示，沿Y軸的垂直切片提供了三維重建的第三條軸。第一條軸沿著激光傳播濾鏡或Z軸進入到液體電池中，第二條軸在水平面沿著X軸在也電池的邊界極點處傳播。垂直切片或水平面沿著Z軸被掃描，如圖6所示。光束的掃描焦點在8個恒定的x(i-1)較低的位置，其他的8個焦點在恒定的x(i+1)的較高的位置。通過錐面光束的邊緣光線產(chǎn)生的干涉條紋圖樣被用于重建算法中。這兩束邊緣光線與掃描位置結(jié)合在水平面或者垂直面產(chǎn)生了2(8+8)=32的相移。邊界溫度條件是

17、沿著液體電池側(cè)壁所得到的X軸的最大值和最小值。加熱器的垂直距離是與高度坐標(biāo)系相關(guān)，如表1表示在恒定的垂直面上有一個0.6mm的距離。折射率分布圖轉(zhuǎn)換到溫度分布，是由四個垂直平面決定的。在垂直平面為0.5、1.1、1.7和2.8mm處增加加熱器?；跓犭娕紲y量的折射率與全息圖重建得到的折射率進行的比較。表2顯示了全部在有加熱器的垂直平面上的的重建折射率誤差和溫度誤差，這些誤差是通過每一個豎直平面上超過12組測量值求平均值得到的。更詳細的誤差分析在在雅克曼5中提出。圖6在CCD攝像機中物體光束與參考光束在干涉后完全重疊。完全重合的光束與兩束邊緣光束排列，從而將重建誤差最小化。邊際射線位于28錐束的

18、邊緣。Zemax仿真全息圖產(chǎn)生的照相機中的平面圖形如圖7所示，邊際射線實在極端的頂部或者底部。錐角定義了射線邊緣鍍金的邊際射線束，比起中央的射線束，這里有更多的網(wǎng)格單元被攔截。邊際射線束停工了更多的重建信息，這可以減少沿深度或者z軸的重建誤差。中央射線束產(chǎn)生相同的相移信息，其對象是不希望得到的光線沿軸深度傳播產(chǎn)生的重建。圖7中的水平邊緣間距是基于波束收斂角和激光的波長得到的。條紋間距產(chǎn)生的請問變化率曲線代表了透鏡的球面像差以及偏離軸線光線重疊而產(chǎn)生的彗形像差。一臺像素為18192，像素分辨率為7lm/像素的線掃描CCD相機Dalsa Piranha被用于此實驗。高分辨率線掃描相機能夠檢測到邊緣

19、光線的條紋。如圖8所示，從相機測量到的邊緣數(shù)據(jù)在全息圖中的一條邊緣光線中顯示，這里相移至關(guān)重要的作用是減少重建誤差。峰值振幅的變化主要是由于微觀光學(xué)表面的灰塵引起的。圖 73.重建和性能重建32折射率值在電光源的單一水平面上是基于16測量邊界條件和超過16掃描位置的32測量邊界條件。一共有48個測量值，這需要重建一個單獨的折射率分布圖。折射率誤差之間的區(qū)別是來自于熱電偶測量全息圖的溫度重建。重建的溫度誤差(1-RMS)超過了32折射率值的公式如下： (2)激光全息共聚焦掃描顯微鏡的性能評估是通過比較重建溫度后探針熱電偶的溫度來實現(xiàn)。熱電偶的溫度分辨率在±0.05°C，激光全

20、息共聚焦掃描顯微鏡的溫度分辨率的單一度量值為±0.07°C RMS。一個包含32個溫度采樣點的水平面的重建誤差為1.3°C RMS。熱電偶被用來測量邊界條件和重建零位誤差。主要的誤差來源是在仿真建模研究中忽略了側(cè)吸重建算法的誤差。圖 8圖 94.結(jié)論和討論相移靈敏度到溫度的改變?nèi)鐖D9所示，溫度為0.6攝氏度的改變可以引起0.8個波長的相移。激光全息共聚焦掃描顯微鏡的相移靈敏度與溫度的斜率圖如圖7所示，利用雖小而懲罰即可算出立體升溫率為1.4波長/攝氏度。根據(jù)測量數(shù)據(jù)可以求出相移均方差誤差為0.010個波長。 (3)在全息圖中基于可溶解相移的單一相移測量溫度為0.0

21、07°C，這主要是溫度的敏感性對折射率的影響而產(chǎn)生的。掃描全息圖實際上就是三維折射率的相移重建測量。圖 10熱電偶是一種銅-康銅的MT-2/5的有29種規(guī)格(0.33mm)的直徑和50mm的長度的皮下注射器。它有一個25.94攝氏度/10mV的靈敏度和10ms的熱響應(yīng)時常。一個低噪聲高增益的放大器可以提供±0.05攝氏度的靈敏度。熱電偶時連接在低噪聲放大器的三階低通濾波器。低通濾波器輸出到一個數(shù)據(jù)采集板上。虛擬儀器數(shù)據(jù)處理模塊提供了五分鐘內(nèi)每秒更新一次的穩(wěn)定采樣時常和采樣頻率。熱電偶冷段三重絕緣，加熱后在20攝氏度的高溫環(huán)境中的輸出在五分鐘內(nèi)沒有發(fā)生改變。熱電偶的校準(zhǔn)是使用

22、冷水和熱水，利用水銀溫度計作為參考而不是通過T型熱電偶查找敏感度表。探針熱電偶提供了在加熱液體中的溫度測量方式，如圖10所示。圖 11溫度曲線是在加熱器0.5mm以上恒定的沿著x、y軸恒定水平面，或者y=1.8mm的高度。當(dāng)熱電偶測量完后被撤掉，然后激光通過液體電池時液體溫度梯度穩(wěn)定在2分鐘。用激光測量的時間比10秒還少，這要歸功于X軸上的機械掃描電流計和Z軸上的傳輸部分。溫度曲線轉(zhuǎn)化為折射率曲線采用的是Cargille實驗室的折射率匹配液，如圖11所示。圖 12圖 13折射率的重建曲線如圖12，穩(wěn)定在海拔1.8mm或者加熱器以上0.5mm的間隙。測量高斯曲線要通過測量流體的熱傳遞得到。增加加

23、熱器的鏡像距離可以減少溫度的峰值和曲線的平緩度。折射率的重建曲線如圖13，在海拔0mm處或者加熱器以上2.3mm處是恒定的。測量誤差的主要誤差源是由邊界條件引入的，誤差可以作為層析重建算法減少到可以忽略的標(biāo)準(zhǔn)。這是我們所知的第一次通過單一視圖端口的觀測串口利用相移全息圖產(chǎn)生的折射率和內(nèi)部溫度的三維圖像。重建的三維溫度由穿過液體樣本四條軸線的溫度曲線表示。沿著Z軸的重建誤差最大，這是由于掃描角限制引起的。測量的溫度隨探測距離的增加而降低，高斯曲線如預(yù)期的效果隨溫度的變化徑向展開。激光全息共聚焦掃描顯微鏡安裝了一個非入侵測量的單一角度觀測窗口。4.1.應(yīng)用激光全息共聚焦掃描顯微鏡有許多應(yīng)用，如測量

24、馬朗格尼流體對流和熱傳導(dǎo)的影響在空間微重力環(huán)境中的運動和激光振動。激光全息共聚焦掃描顯微鏡設(shè)計的優(yōu)點是液態(tài)電池被嚴(yán)格地固定在光學(xué)掃描中的xyz軸上。其他應(yīng)用在生物樣本中的微流體和透明區(qū)域的相位成像，這種方法可以利用獨特的派生出的“威利”重建算法。精確的三維重建給定了一個有限的視角和不準(zhǔn)確的重建矩陣，但可以從一個觀測點或固定的觀察窗進行觀測。激光全息共聚焦掃描光學(xué)顯微鏡可以很容易通過改變一些光學(xué)組件實現(xiàn)從傳播模式轉(zhuǎn)換到反射模式的操作。例如，基于激光全息共聚焦掃描“威利”算法的重建原則應(yīng)該應(yīng)用于超聲醫(yī)學(xué)影像的成像中，這一應(yīng)用是由赫林10和費來爾11等人提出。5.概要和總結(jié)激光全息共聚焦掃描顯微鏡是

25、一項獨特的設(shè)計，結(jié)合了公交顯微鏡與全息術(shù)的特點。激光全息共聚焦掃描顯微鏡已經(jīng)驗證通過了測量硅油的三維折射率到溫度三維圖的轉(zhuǎn)化。激光全息共聚焦掃描顯微鏡用匯聚激光探針測得每一個掃描點的全息圖。樣品的三維溫度圖第一次從單一的視角窗口得到。熱電偶的測量敏感度和誤差是基于高于光源加熱器的四個恒定海拔平面上的三維溫度重建。顯微鏡可以用于測量一個透明固體、液體或者立體提如火焰的溫度。激光全息共聚焦掃描顯微鏡從掃描全息圖到階梯溫度的轉(zhuǎn)化可以得到一個三維數(shù)組。三維重建主要是利用掃描探測光束的聚焦點、邊界條件以及“威利”矩陣重建算法。重建不需要旋轉(zhuǎn)掃描機制就可以完成。用于重建的一個單獨的觀測窗口可以由一個聚焦探

26、針的錐角表現(xiàn)。為激光全息共聚焦掃描顯微鏡派生的的重建方法為有限制的觀測角度有所幫助。致謝感謝加拿大金融創(chuàng)新基金會(CFI), 加拿大自然科學(xué)與工程研究委員會 (NSERC)和維多利亞大學(xué)。參考文獻1 R.A. Herring, Confocal Scanning Laser Holography and an associated microscope: a proposal, Optik 105 (2) (1997) 6568.2 A.E. Dixon, S. Damaskinos, M.R. Atkinson, A scanning confocal microscope for tran

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