引物設(shè)計(jì)及測序結(jié)果分析

1、（primer design） 3.1 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì) 引物的定義引物的定義引物（引物（primer）是一段短的單鏈?zhǔn)且欢味痰膯捂淒NA或或RNA片段，可結(jié)合在片段，可結(jié)合在DNA模板鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，作為模板鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)。復(fù)制的起始點(diǎn)。體外人工設(shè)計(jì)的引物被廣泛用于體外人工設(shè)計(jì)的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR )、測序和探針合成等。、測序和探針合成等。引物設(shè)計(jì)是引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，其優(yōu)劣直接關(guān)系到技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，其優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性和實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒?。的特異性和?shí)

2、驗(yàn)?zāi)芊癯晒Α?DNA模板模板95（解鏈解鏈）60（退火）與引物結(jié)合退火）與引物結(jié)合72（延伸）延伸）DNA單鏈單鏈Taq酶，酶，dNTPs, Mg2+Forward primerReverse primerPCR的基本原理的基本原理三步循環(huán)：三步循環(huán)：變性、退變性、退火、延伸火、延伸1.變性：變性：雙鏈雙鏈DNA解解鏈成為單鏈鏈成為單鏈DNA2.退火：退火：部分引物與部分引物與模板的單鏈模板的單鏈DNA的特的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合結(jié)合3.延伸延伸：以目的基因：以目的基因?yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的為模板，合成互補(bǔ)的新新DNA鏈鏈 GTGATGTTCCTGACGGTACTCTAAAGT

3、CACCGTGGACGGACC 5 3 5 CACTACAAGGACTGCCATGAGTAAAGTCACCGTGGACGGACC 5 Reverse primer/anti-sense primer : 5 CCAGGCAGGTGCCACTGAAAT Forward primer/sense primer: 5 CACTACAAGGACTGCCATGAGCACTACAAGGACTGCCATGAGATTTCAGTGGCACCTGCCTGG 5 3 PCR RrimersM500bp700bp900bp1200bp61 63 65NC100bp300bp瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測PCRP

4、CR產(chǎn)物（產(chǎn)物（1 1） 5GCAGTACATGTC 33 c g t c a t g t a c a g 5編碼鏈編碼鏈(CDS)模板鏈模板鏈mRNA5GCAGUACAUGUC 3轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄NAla Val His Val C蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯DNA模板鏈、編碼鏈與轉(zhuǎn)錄及翻譯的關(guān)系模板鏈、編碼鏈與轉(zhuǎn)錄及翻譯的關(guān)系反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄CDS（coding sequence）是編碼一段蛋白產(chǎn)物的是編碼一段蛋白產(chǎn)物的DNA序序列。一般以列。一般以ATG開始，以開始，以TAA、TAG、TGA結(jié)尾。結(jié)尾。cDNA （complementary DNA）是與是與RNA鏈堿基互補(bǔ)的鏈堿基互補(bǔ)的單鏈單鏈DNA，或此

5、，或此DNA鏈與其堿基互補(bǔ)的鏈與其堿基互補(bǔ)的DNA鏈所形鏈所形成的成的DNA雙鏈。雙鏈。PCR 模板模板:cDNA一、引物設(shè)計(jì)流程一、引物設(shè)計(jì)流程序列查找和下載序列查找和下載序列同源性比較序列同源性比較引物設(shè)計(jì)與篩選引物設(shè)計(jì)與篩選引物的評(píng)價(jià)分析引物的評(píng)價(jià)分析引物的二次篩選引物的二次篩選引物的最終評(píng)估引物的最終評(píng)估引物加工與修飾引物加工與修飾二、引物設(shè)計(jì)原則二、引物設(shè)計(jì)原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體(dimer)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)引物不能在模板的非目的位

6、點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反聚合反應(yīng)應(yīng)(即錯(cuò)配即錯(cuò)配) （一）基本原則（一）基本原則1 1、引物的長度、引物的長度 一般一般151530bp30bp，常用，常用181824 bp24 bp。引物過短容易引起錯(cuò)配現(xiàn)象，引物過長會(huì)導(dǎo)致引物過短容易引起錯(cuò)配現(xiàn)象，引物過長會(huì)導(dǎo)致PCRPCR延伸溫度大于延伸溫度大于7474，不適于，不適于TaqTaq DNA DNA聚合酶。聚合酶。 （二）一般原則（二）一般原則2、引物擴(kuò)增跨度引物擴(kuò)增跨度即產(chǎn)物長度，以即產(chǎn)物長度，以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至至10kb的片段。的片段。3、引物的特異性引物的特異性在模板在模板cDNA的保守

7、區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)引物。的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)引物。引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。ATGC最好隨機(jī)分布，避免最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。酸的成串排列。引物引物3端的堿基分布端的堿基分布引物引物3端最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)端最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)引物引物3端最好以端最好以C或或G結(jié)尾，避免使用結(jié)尾，避免使用A引物引物3端避免出現(xiàn)端避免出現(xiàn)3 個(gè)以上連續(xù)的個(gè)以上連續(xù)的C或或G,如如GGG 或或CCC引物引物3端端5個(gè)堿基個(gè)堿基G+C不宜超過不宜超過3個(gè)個(gè)4、引物的堿基分布引物的堿

8、基分布G G 值是指值是指DNADNA雙鏈形成所需的自由能，反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基雙鏈形成所需的自由能，反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。 3 端端G G 值值應(yīng)較低，否則易引起錯(cuò)配。應(yīng)較低，否則易引起錯(cuò)配。5、引物的引物的GG值值 hairpin6、引物的互補(bǔ)情況引物的互補(bǔ)情況引物自身及引物之間不宜存在互補(bǔ)序列。如果引物自身折疊成引物自身及引物之間不宜存在互補(bǔ)序列。如果引物自身折疊成發(fā)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（夾結(jié)構(gòu)（HairpinHairpin），），會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的結(jié)合。會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的結(jié)合。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過

9、高（超過4.5Kcal/mol4.5Kcal/mol）, ,易導(dǎo)致易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度, ,使使PCRPCR反應(yīng)不能正常反應(yīng)不能正常進(jìn)行。進(jìn)行。Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC 3 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA 5 Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC 3 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA 5 引物自身形成二聚體引物自身形成二聚體（self-dimer）上下游引物之間二聚體（上下游引物之間二聚體（cross

10、 dimercross dimer）Reverse primer : 5 CTGTGCTCTCTCATCATCATATTCForward primer: 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAAGillM 57 59 61 63 65Kindey 57 59 61 63 65NC900bp700bpTarget segment: 813 bp瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測PCRPCR產(chǎn)物（產(chǎn)物（2 2） dimer7 7、引物的、引物的GCGC含量含量 G+C含量以含量以40-60%為宜。為宜。 G+C太少，太少，PCR擴(kuò)增效擴(kuò)增效果不佳；果不佳；G+C過多，易出現(xiàn)非特異條帶。過

11、多，易出現(xiàn)非特異條帶。 8 8、引物的、引物的TmTm合理的退火溫度為合理的退火溫度為5570兩引物的兩引物的Tm 值相差不應(yīng)大于值相差不應(yīng)大于5 Tm值值(解鏈溫度解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 退火溫度退火溫度=Tm值值-59、引物的修飾情況引物的修飾情況 引物的引物的5端可以修飾，而端可以修飾，而3端不可修飾端不可修飾。 引物引物5 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光端修飾包括：加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序

12、列等。在計(jì)算在計(jì)算Tm值時(shí)不必考慮附加序列，但在檢測互補(bǔ)及二級(jí)結(jié)值時(shí)不必考慮附加序列，但在檢測互補(bǔ)及二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)要加上它們。構(gòu)時(shí)要加上它們。 常用引物設(shè)計(jì)軟件：常用引物設(shè)計(jì)軟件：lPrimer Premier 5.0Primer Premier 5.0lPrimer 3Primer 3lDNAmanDNAmanlOligo 6Oligo 6（引物評(píng)估軟件）（引物評(píng)估軟件）三、引物設(shè)計(jì)軟件三、引物設(shè)計(jì)軟件（一）序列查找和下載（一）序列查找和下載 //nuccore/NC_003495.1http

13、://nuccore/19881396?from=455&to=3511/nuccore/19881396?report=fasta&from=455&to=3511將查找到的將查找到的CDS序列以序列以.txt文件保存文件保存將查找到的將查找到的CDS序列以序列以.seq文件保存文件保存將查找到的將查找到的CDS序列以序列以.seq文件保存文件保存（二）序列同源性比較（二）序列同源性比較1 1、利用在線的、利用在線的NCBINCBI中的中的BLASTBLAST工具進(jìn)行比較工具進(jìn)

14、行比較2 2、利用、利用DNAmanDNAman等軟件進(jìn)行多序列比較等軟件進(jìn)行多序列比較序列比對(duì)序列比對(duì)參數(shù)一般默認(rèn)參數(shù)一般默認(rèn)序列比對(duì)結(jié)果序列比對(duì)結(jié)果（三）引物設(shè)計(jì)與篩選（三）引物設(shè)計(jì)與篩選Load sequence1 1、利用、利用Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增BPMV BPMV CPCP基基因片段。因片段。 Primer Premier Primer Premier 啟動(dòng)界面啟動(dòng)界面Press OK導(dǎo)入已知的導(dǎo)入已知的BPMV BPMV CPCP基因的基因的CDS(coding sequence)CDS(c

15、oding sequence)序列序列note：存儲(chǔ)的文件存儲(chǔ)的文件路徑及名稱不能含路徑及名稱不能含有中文。有中文。序列導(dǎo)入結(jié)果顯示窗口序列導(dǎo)入結(jié)果顯示窗口在目的序列的在目的序列的第一個(gè)第一個(gè)堿基堿基處雙擊處雙擊GenbankGenbank窗口窗口點(diǎn)擊點(diǎn)擊“primer”primer”按鈕按鈕點(diǎn)擊點(diǎn)擊“search”“search”按鈕按鈕引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物搜索選項(xiàng)設(shè)定Press “OK”搜索結(jié)果搜索結(jié)果Press “OK”點(diǎn)擊選中一對(duì)引物點(diǎn)擊選中一對(duì)引物搜索結(jié)果窗口搜索結(jié)果窗口引物設(shè)計(jì)窗口引物設(shè)計(jì)窗口挪開挪開“Search Results”窗口窗口引物數(shù)據(jù)的保存引物數(shù)據(jù)的保存引物數(shù)據(jù)庫窗口

16、引物數(shù)據(jù)庫窗口1.按按“Ctrl”，選擇引物，選擇引物2.點(diǎn)擊點(diǎn)擊“Export”3.引物已輸入到引物已輸入到數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)庫中引物合成訂單引物合成訂單選擇引物，點(diǎn)擊菜單欄選擇引物，點(diǎn)擊菜單欄“Function”Function” “order form” order form” “new form” ,new form” ,彈出彈出 “Synthesis order form”Synthesis order form”窗口窗口考核操作題（一）考核操作題（一）自行在自行在NCBINCBI核酸數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索一個(gè)基因核酸數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索一個(gè)基因CDSCDS序列序列( (長度長度大于大于500bp)500bp)，完成下列操作（，完成下列操作（1