酶工程-第七-酶的非水相催化

1、2021/3/17非水酶學(xué)誕生的生產(chǎn)背景非水酶學(xué)誕生的生產(chǎn)背景80年代是油脂,香料行業(yè)迅猛發(fā)展時期,需要許多催化反應(yīng)生產(chǎn)酯類產(chǎn)物2021/3/17非水相酶學(xué)的誕生水是酶促反應(yīng)最常用的反應(yīng)介質(zhì)。水是酶促反應(yīng)最常用的反應(yīng)介質(zhì)。但對于大多數(shù)有機化合物來說但對于大多數(shù)有機化合物來說,水并不是一種適宜的溶劑。因為水并不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物許多有機化合物(底物底物)在水介質(zhì)中難溶或不溶。在水介質(zhì)中難溶或不溶。但對于大多數(shù)有機化合物來說但對于大多數(shù)有機化合物來說,水并不是一種適宜的溶劑。因為水并不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物許多有機化合物(底物底物)在水介質(zhì)中難溶或不溶。在水介質(zhì)中難

2、溶或不溶。由于水的存在由于水的存在,往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應(yīng)的發(fā)生應(yīng)的發(fā)生;同時水也使酯化反應(yīng)的反應(yīng)平衡不能指定移動。同時水也使酯化反應(yīng)的反應(yīng)平衡不能指定移動。但對于大多數(shù)有機化合物來說但對于大多數(shù)有機化合物來說,水并不是一種適宜的溶劑。因為水并不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物許多有機化合物(底物底物)在水介質(zhì)中難溶或不溶。在水介質(zhì)中難溶或不溶。2021/3/17是否存在非水介質(zhì)能保證酶催化是否存在非水介質(zhì)能保證酶催化?1984年年,克利巴諾夫（克利巴諾夫（Klibanov）等人在有機介質(zhì)中進行了）等人在有機介質(zhì)中進行了酶催化

3、反應(yīng)的研究酶催化反應(yīng)的研究,他們成功地在利用酶有機介質(zhì)中的催化他們成功地在利用酶有機介質(zhì)中的催化作用作用,獲得酯類、肽類、手性醇等多種有機化合物獲得酯類、肽類、手性醇等多種有機化合物,明確指出明確指出酶可以在水與有機溶劑的互溶體系中進行催化反應(yīng)酶可以在水與有機溶劑的互溶體系中進行催化反應(yīng)。早期實驗證明酶不能在丙酮乙醇等有機溶劑中催化早期實驗證明酶不能在丙酮乙醇等有機溶劑中催化2021/3/17非水相酶催化的優(yōu)點非水相酶催化的優(yōu)點脂溶性底物和產(chǎn)物在有機溶劑中的溶解性較高,有利于提高底物和產(chǎn)物濃度的水平; 在適當?shù)臈l件下,可以使酶促反應(yīng)的熱力學(xué)平衡向合成方向(而不是水解方向)移動;同時由于有機溶劑

4、的存在,含水量減少,大大降低了許多水參與的副反應(yīng);在非水相中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高。如豬胰脂肪酶在99 %的有機溶劑中100 C保溫數(shù)十個小時仍保持較高的酶活性。而在此溫度條件下,酶在水溶液中卻迅速失活;由于酶不溶于有機溶劑中,酶的重復(fù)利用更加方便;可以省略產(chǎn)物的萃取分離過程,提高了產(chǎn)物得率;在有機溶劑存在的條件下,一般不存在微生物對反應(yīng)體系的污染問題。2021/3/17非水相酶催化的缺點非水相酶催化的缺點- -酶催化活力下降酶催化活力下降 但與酶在水相中催化時的活性相比,酶在有機溶劑中催化時的活性大大降低。如下因素常被認為與酶在非水相中催化活性降低有關(guān)1）在制備酶干粉進行冷凍干燥時酶活性中心

5、構(gòu)象會發(fā)生變化或與有機溶劑直接接觸導(dǎo)致的酶活性構(gòu)象改變;2）pH變化,尤其對于交聯(lián)體晶體酶而言。同時在冷凍干燥過程中使用揮發(fā)性緩沖液也可能導(dǎo)致酶最適pH的改變。2021/3/173） 酶在有機溶劑中的構(gòu)象過于剛硬(rigid)導(dǎo)致活性降低;2021/3/174）由于酶在有機溶劑中不能溶解,可能存在底物和產(chǎn)物的擴散限制2021/3/175）底物在不同溶劑中去溶劑化能(desolvation energy)的差異;2021/3/17第一節(jié) 酶非水相催化的反應(yīng)介質(zhì) 有機介質(zhì)有機介質(zhì)氣相介質(zhì)氣相介質(zhì)超臨界介質(zhì)超臨界介質(zhì)離子液體離子液體氟溶劑氟溶劑2021/3/171酶非水相催化的反應(yīng)介質(zhì)有機溶劑是目前

6、研究最多的一種非水反應(yīng)介質(zhì)應(yīng)用較多的一種反應(yīng)介質(zhì)但也是最受詬病的一種反應(yīng)介質(zhì),其毒性,易燃,易爆,容易揮發(fā)（碳排放）都引發(fā)了其它非水相介質(zhì)的研究2021/3/172酶非水相催化的反應(yīng)介質(zhì)-氣相優(yōu)點:避免了有機溶劑的使用;酶的回收較為方便;氣相中底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)效果較好。 缺點:反應(yīng)器中的反應(yīng)物濃度受到底物蒸汽壓的影響 酸與醇的酯化反應(yīng)中酶還受到酸蒸汽的不可逆抑制失活作用 2021/3/173酶非水相催化的反應(yīng)介質(zhì)超臨界流體優(yōu)點:超臨界流體有極好的擴散性和很低的黏度,有利于底物向酶分子擴散。底物在超臨界中的溶解度還可通過調(diào)節(jié)超臨界流體的壓力和溫度來改變。 由于通常用于酶催化反應(yīng)的超臨界流體為二氧

7、化碳,它在常溫下是氣態(tài)不會與產(chǎn)物混合,所以可制得高純度的產(chǎn)物。 缺點:設(shè)備復(fù)雜,難于連續(xù)生產(chǎn)和進行工業(yè)放大。 反應(yīng)介質(zhì)還會降低酶表面的pH 值且還可能對酶表面進行化學(xué)修飾反應(yīng)結(jié)束后取出產(chǎn)物的減壓過程也容易造成酶的失活。 2021/3/174酶非水相催化的反應(yīng)介質(zhì)-氟溶劑 高氟代烴通常具有極大的惰性、非極性、熱力學(xué)穩(wěn)定、無毒,和一般的有機溶劑、水不能混溶。 具有高氟化基團的化合物會優(yōu)先溶解于含氟溶劑中 *如Goto 等人發(fā)現(xiàn)一些脂肪酶在全氟辛烷(perfluorooctane)中催化反應(yīng)的速率超出酶在異辛烷中催化反應(yīng)的速率10倍之多。 2021/3/175酶非水相催化的反應(yīng)介質(zhì)離子液體(一) 離

8、子液體的結(jié)構(gòu)及分類 離子液體是呈現(xiàn)為液態(tài)的鹽 離子液體是完全由陰陽離子組成且常溫下呈液態(tài)的離子化合物,這些離子化合物結(jié)構(gòu)上存在離子結(jié)構(gòu)對稱性低、分子間作用力弱等特點,導(dǎo)致了離子液體熔點接近室溫或低于室溫,使離子液體成為一種以液態(tài)方式存在的鹽。 2021/3/17( (二二) )離子液體的優(yōu)點離子液體的優(yōu)點 （1）離子液體具有熱穩(wěn)定性高、蒸汽壓低和對環(huán)境友好等特點而被研究者稱為“綠色”的溶劑 A 室溫離子液體沒有顯著的蒸汽壓。雖然在室溫離子液體中,陰陽離子間的庫侖力較弱,但和一般分子溶劑的分子間的作用力相比,離子液體顯然要大得多,因此即使在較高的溫度下,離子液體也不易揮發(fā),故離子液體可用于高真空

9、體系,而且對環(huán)境無污染,有望為綠色工業(yè)開辟新的道路。 B 離子液體有較好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性,可以不必考慮其它溶劑通常具有的易燃性,大大提高了實驗室和工業(yè)應(yīng)用中的安全性和可操作性。 2021/3/17（2）離子液體強極性的特點也拓寬了酶催化反應(yīng)介質(zhì)選擇的范圍,這是因為強極性底物一般用強極性溶劑來溶解,但強極性有機溶劑常常使酶失活,而在相同強極性的離子液體中,酶卻表現(xiàn)出較好的活性和穩(wěn)定性 * 離子液體強極性的特點使它對精細化工和醫(yī)用產(chǎn)品起始材料的“構(gòu)建單元”(如肽、糖、核酸等極性底物)具有的較強的溶解性,預(yù)示著離子液體可能在精細化工和醫(yī)用產(chǎn)品生產(chǎn)上扮演重要角色。 （3）同時還有很多研究者認為離

10、子液體是一種“可設(shè)計”的溶劑,可以通過合成手段合成一系列結(jié)構(gòu)和性質(zhì)迥異的離子液體來滿足各方面研究和應(yīng)用的需求。2021/3/17 從理論上來講,這種室溫呈溶解狀態(tài)的鹽(molten salt)按陰陽離子不同排列組合方式有1018 種之多,數(shù)量十分龐大,但根據(jù)陽離子母體的不同可將常見的離子液體大致歸納為四類:分別是咪唑鹽類(A);吡啶鹽類(B);季銨鹽類;(C)和季鏻鹽類;(D)其陽離子的結(jié)構(gòu): 可作為離子液體的陰離子有:BF4-、PF6-、TA- (CF3COO- )、HB - (C3F7COO- )、TfO- (CF3SO3- )、NfO-(C4F9SO3- )、Tf2N- ( (CF3SO

11、2) 2N- )、Beti - ( (C2F5SO2 -) 2N- )、Tf3C- ( (CF3SO2- ) 3C- )、SbF6-、AsF6-、NO2-等。2021/3/17( (三三) ) 離子液體缺點離子液體缺點離子液體也有一些缺點妨礙著它的應(yīng)用。n 已合成的離子液體大多黏度很高,這勢必給底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)帶來困難。Kragl等人發(fā)現(xiàn)盡管-糖苷酶在80C高溫下在離子液體1-甲基-3-甲基咪唑甲基璜酸鹽(1-methyl-3-methylimidazolium methanesulfonate,MMIMCH3SO3)中仍具有很高的穩(wěn)定性,但80C的高溫仍然沒有解決離子液體粘度較大帶來的傳質(zhì)困

12、難。n 盡管有些離子液體成本可達到70歐元/kg,但價格仍然是限制其應(yīng)用的重要因素。因此離子液體能否能完全回收利用是其能否工業(yè)化應(yīng)用的重要條件。 2021/3/17一一 單相反應(yīng)體系單相反應(yīng)體系1 微水反應(yīng)體系l 酶懸浮態(tài)存在（傳遞問題）l 一般為疏水有機溶劑,疏水底物溶解性強l 微量水分維持活性（5%)2 與水混溶有機溶劑反應(yīng)體系酶溶解性好（親水溶劑的毒害問題）溶解極性較高的底物,如糖水分含量大第二節(jié)第二節(jié) 反應(yīng)體系反應(yīng)體系.2021/3/17二 兩相體系1 常見的兩相體系有機溶劑水兩相體系 在有機溶劑水兩相體系中,多數(shù)酶分子處在水相中不與有機溶劑直接接觸不與有機溶劑直接接觸從而能保持較高活

13、性;而大部分底物則溶解在有機相中,在水相中底物或產(chǎn)物的濃度較低這樣可以避免底物或產(chǎn)物對酶產(chǎn)生的抑制作用避免底物或產(chǎn)物對酶產(chǎn)生的抑制作用。同時產(chǎn)物從酶分子表面脫落進入有機相中有利于反應(yīng)向生成產(chǎn)物方向進行。還可實現(xiàn)反應(yīng)和分離的耦合（同時進行）反應(yīng)和分離的耦合（同時進行）。存在著相界面,這樣會給反應(yīng)帶來傳質(zhì)和傳熱阻力。同時相界面的存在還導(dǎo)致了酶的界面失活。而且在有些情況下溶解于水相的少量有機溶劑還能對酶的活性產(chǎn)生影響。.2021/3/17構(gòu)建雙水相體系實現(xiàn)在線產(chǎn)物分離構(gòu)建雙水相體系實現(xiàn)在線產(chǎn)物分離Top phaseBottom phase Substrates Product Product Sid

14、e product Biocatalyst2021/3/172 反相膠束體系 在水有機溶劑兩相體系和微水有機溶劑體系中,僅有少數(shù)酶能夠保持催化活性,而能在反相膠束體系中催化的酶的種類更多(酶在膠束中水池中活力更大)。從一定意義上說,反相膠束體系也是一種兩相體系,但它用于傳質(zhì)的相面積更大。 酶的重復(fù)利用和產(chǎn)物同步分離上仍存在許多問題 2021/3/17 微團效應(yīng)使某些酶活性增加微團效應(yīng)使某些酶活性增加超活性:凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性稱為超活性（Super-activity）。認為:超活性是由圍繞在酶分子外面的表面活性劑這通過與酶相關(guān)基團作用改變酶構(gòu)象而影響酶活。2021/3/173 氟

15、溶劑的兩相體系 催化中均相反應(yīng)有利于底物傳質(zhì)催化中均相反應(yīng)有利于底物傳質(zhì),而兩相體系有利而兩相體系有利于分離于分離,氟溶劑這種可變?yōu)閱蜗囿w系的兩相體系同氟溶劑這種可變?yōu)閱蜗囿w系的兩相體系同時擁有兩種優(yōu)點時擁有兩種優(yōu)點2021/3/17優(yōu)點: 無溶劑反應(yīng)具有很高的底物濃度,在不存在底物抑制的情況下,有利于提高反應(yīng)速度并推動反應(yīng)向產(chǎn)物方向進行,從而得到高濃度的產(chǎn)物。 因為在反應(yīng)中沒有使用有機溶劑,也就避免了有機溶劑對酶活性的影響。同時有機溶劑用量減少也在一定程度上提高了產(chǎn)品的安全性,這對于食品和醫(yī)藥工業(yè)是非常重要的,這也符合環(huán)境保護的要求。 不使用溶劑就相應(yīng)減小了反應(yīng)器的體積,這對工業(yè)生產(chǎn)來說就是

16、大大降低了生產(chǎn)成本,有利于工藝的工業(yè)化。 反應(yīng)結(jié)束后無需考慮從反應(yīng)體系中分離出反應(yīng)溶劑,簡化了產(chǎn)物分離純化工藝。缺點: 但酶在無溶劑條件下進行催化也存在著許多困難和問題:高濃度的底物和反應(yīng)中形成的產(chǎn)物可能對酶起抑制作用,這會對酶的催化活性產(chǎn)生不利影響; 另外反應(yīng)底物本身的黏度可能很大,可能會使底物與酶難以充分混合,從而導(dǎo)致反應(yīng)速率過慢。其它體系其它體系1 1 無溶劑反應(yīng)體系無溶劑反應(yīng)體系2021/3/172 擬低共熔反應(yīng)體系 所謂低共熔混合物,是指兩種或兩種以上的組分,在一定組分比率下會表現(xiàn)出比純組分熔點低的低共熔點,并且多相共存。底物固、液相同時存在是低共熔混合物能被酶催化的原因。 擬低共熔

17、反應(yīng)體系中進行酶催化反應(yīng),具有產(chǎn)物濃度高、對環(huán)境友好等許多優(yōu)點,但也有研究者認為在該體系中調(diào)節(jié)酶的催化特性比較困難。2021/3/17第三節(jié)第三節(jié) 影響酶在非水反應(yīng)介質(zhì)中催化的因素影響酶在非水反應(yīng)介質(zhì)中催化的因素水對非水相酶催化的影響 凍干保護劑對酶構(gòu)象的影響反應(yīng)介質(zhì)對非水相酶催化的影響 載體對非水相酶催化的影響 2021/3/17: : （1） 與酶分子表面帶電基團結(jié)合達到0-0.07g/g（水/酶） （2） 與表面的極性基團結(jié)合(0.07-0.25g/g) （3） 凝聚到表面相互作用較弱的部位（0.250.38g/g） （4） 酶分子表面完全水化,被一層水分子覆蓋。一一 水對非水相酶催化的

18、影響水對非水相酶催化的影響干燥的酶水合過程干燥的酶水合過程2021/3/17 水參與了所有維持酶活性構(gòu)象的非共價結(jié)合力(靜電力、范德華力、疏水相互作用及氫鍵),因此水在酶催化中扮演著極其重要的角色。 Visser和Reinhoudt等人等用時間分辨熒光光譜(Time-Resolved Fluorescence)研究了酶懸浮于有機溶劑中的結(jié)構(gòu)構(gòu)象,發(fā)現(xiàn)隨著水化程度的提高,酶分子的柔性逐漸增加,酶活性也增加,這為水分子的潤滑劑作用提供了更直接試驗依據(jù)。這部分充當潤滑劑的水分子稱為”結(jié)構(gòu)水”。 極性有機溶劑可以奪取酶水化層的大部分水,甚至結(jié)構(gòu)水。而非極性溶劑奪取水的能力較弱,因此在極性有機溶劑中酶容

19、易喪失活性,而在非極性溶劑中,酶可以保持較高的催化活性和穩(wěn)定性。水的作用水的作用2021/3/17必需水必需水（essential water）:維持酶分子完整的空間構(gòu)象所維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量。必需的最低水量。例如：凝乳蛋白酶，只需分子的水。例如：凝乳蛋白酶，只需分子的水。多酚氧化酶，需個水分子。多酚氧化酶，需個水分子。2021/3/17過多水的危害過多水的危害過多的水分會進一步水化蛋白中極性低的基團使蛋白構(gòu)象更松散引起一些構(gòu)象微調(diào)來降低酶活性,尤其是酶的“熱失活” ;（物理）溫度升高時酶分子發(fā)生可逆折疊,然后進行下述一種或幾種反應(yīng):(1)形成不規(guī)則的結(jié)構(gòu);(2)通過消除反

20、應(yīng)使二硫鍵破壞;(3)天冬氨酸和谷氨酰氨殘基的脫酰氨;(4)天冬氨酸殘基的肽鍵水解。（化學(xué)）另外也有人認為太多的水會使酶積聚成團,導(dǎo)致疏水底物較難進入酶的活性部位,引起傳質(zhì)阻力。水分對不同形式酶的影響也不同,對于一些固定化酶來說,過多水分子在載體上的吸附有可能導(dǎo)致底物的傳質(zhì)限制;（傳遞）同時在有水生成的可逆反應(yīng)(如酯化、酯交換)中,水分的存在也對反應(yīng)的熱力學(xué)平衡不利。（化學(xué)平衡）2021/3/17酶最適含水量酶最適含水量 可以看出,在非水相酶反應(yīng)體系中存在一個“最佳含水量”。該最佳含水量不僅取決于酶種類的不同,也與所選用的有機溶劑有關(guān)。通常最佳含水量極低,并未達到水在有機溶劑中的飽和點。 早期

21、的研究試圖用向反應(yīng)體系中的加水量來表示“最佳水含量”,事實上這并不恰當。因為體系中的水會在溶劑、酶、載體、甚至底物之間進行分配。 Hailing提出用水的熱力學(xué)活度(water activity,aw)表示非水相體系中的水含量,水活度的大小直接反映出酶分子上水分的多少,與體系的其他因素?zé)o關(guān)。 2021/3/17水活度的調(diào)控水活度的調(diào)控 通常有兩種情況可改變體系的水活度: 反應(yīng)中產(chǎn)生或消耗水; 溶劑化作用或相行為水活度的調(diào)控,通常利用特定的水合鹽對,通過以下兩種操作方式獲得恒定的水活度: 將酶和含有底物的溶劑分別與鹽的飽和溶液平衡至相同的水活度,然后混合進行反應(yīng),如右圖所示; 向干燥的反應(yīng)器中直

22、接加入一種高水合鹽緩釋部分水到體系中,本身變位低水合鹽或無水鹽,如Na2HPO4、 Na2HPO4.2H2O、 Na2HPO4.7H2O、 Na2HPO4.12H2O 。有 機 相平 衡生 物 催 化 劑平 衡含 過 量 鹽 的飽 和 鹽 溶 液將 平 衡 的 兩 相混 合 攪 拌 反 應(yīng)2021/3/17二二 凍干保護劑對酶構(gòu)象的影響凍干保護劑對酶構(gòu)象的影響 冷凍干燥是制備非水相催化用酶的一個重要手段,但冷凍干燥過程可能引起酶分子脫去”結(jié)構(gòu)水”導(dǎo)致了酶構(gòu)象的一些改變而影響酶的活性。kibanov等人利用傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)研究了蛋白質(zhì)在冷凍干燥過程后構(gòu)象的變化,發(fā)現(xiàn)冷凍干燥過程會

23、誘導(dǎo)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的可逆性改變(重新加到緩沖液后蛋白構(gòu)象會恢復(fù)),冷凍干燥過程增加了蛋白質(zhì)中B-折疊結(jié)構(gòu)的含量而降低了a-螺旋結(jié)構(gòu)的含量。加入凍干保護劑以后蛋白的二級結(jié)構(gòu)與天然態(tài)蛋白(緩沖液中)的二級結(jié)構(gòu)更相似2021/3/17凍干保護劑有很多氫鍵,可在脫水過程中起著”氫鍵替代”作用,可彌補”結(jié)構(gòu)水脫去引起蛋白構(gòu)象變化;也有人認為凍干保護劑在凍干過程中包圍在蛋白周圍成玻璃態(tài),防止蛋白分子間不正常聚集。冷凍干燥作為酶的脫水過程對酶的活性中心和二級結(jié)構(gòu)都有一定損害作用,而凍干保護劑則可以一定程度上保護酶的活性中心和構(gòu)象,同時一定的凍干保護劑還可以降低底物傳質(zhì)障礙,這也可能是凍干保護劑影響酶在非水相

24、中催化活性的一個途徑。2021/3/17三三 反應(yīng)介質(zhì)對非水相酶催化的影響反應(yīng)介質(zhì)對非水相酶催化的影響一般認為有機溶劑可以從如下幾個方面影響酶的催化 :(1)溶解于酶周圍水分子層內(nèi)的有機溶劑分子可與酶活性中心直接結(jié)合,或通過干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象,導(dǎo)致酶受抑制或引起酶失活、催化選擇性的變化; （1）對酶分子表面結(jié)構(gòu)的影響;（2）對酶活性中心的影響。辣根過氧化物酶在甲醇中的催化時,發(fā)現(xiàn)甲醇可以進入到酶活性中心,與卟啉鐵配位 。4個乙睛分子可以進入到活性枯草桿菌蛋白酶活性中心,結(jié)合位點與抑制劑相似。2021/3/17Klibanov等人用圓二色譜和核磁共振的方法檢測了幾種有機溶劑中溶菌酶(

25、lysozyme)的構(gòu)象,發(fā)現(xiàn)與溶菌酶在水中的天然構(gòu)象相比,溶菌酶在乙二醇中為部分折疊狀態(tài),在甲醇中為“熔球” (moltenglobule)狀態(tài),而在甲酞胺、二甲基甲酞胺、二甲基亞礬 (DMSO)中則呈現(xiàn)去折疊 (unfold)狀態(tài)。他們解釋為甲酸胺等溶劑會破壞穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的酞胺基團之間的氫鍵作用,而醇類和酞胺基團的氫鍵則要弱許多,因此對蛋白構(gòu)象影響不同。2021/3/17(2)有機溶劑會奪去酶分子表面的必需水分(結(jié)構(gòu)水),導(dǎo)致酶活性下降;枯草桿菌蛋白酶晶體在乙腈溶劑中,原有的119個與酶分子結(jié)合的水分子中有20個水分子被脫去,12個乙腈分子結(jié)合到了上去,其中4個取代了原來水分子的位置。20

26、21/3/17(3) 由于酶一般不溶于有機溶劑而成聚集體,而造成底物傳質(zhì)困難;(4)有機溶劑與水之間的極性不同,在反應(yīng)過程中會影響底物和產(chǎn)物的從宏底物和產(chǎn)物的從宏觀溶液到酶表面水膜分觀溶液到酶表面水膜分配配,從而影響酶的催化反應(yīng)。(5) 控制底物的溶劑能或穩(wěn)定反應(yīng)的過渡態(tài),改變反應(yīng)能量。2021/3/17四四 載體對非水相酶催化的影響載體對非水相酶催化的影響 酶分散性 立體屏蔽是由于載體的空隙太小,或者由于固定化方式與位置不當,給酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心造成了空間障礙,因而底物與效應(yīng)物無法和酶接觸,從而影響酶活性的一種效應(yīng)。 對酶構(gòu)象的影響 酶構(gòu)象改變主要是酶和載體的相互作用引起了酶的活性中心或

27、調(diào)節(jié)中心的構(gòu)象發(fā)生了改變,從而導(dǎo)致酶活性的下降。 底物分配效應(yīng) 分配效應(yīng)是由于固定化載體的親水和疏水性質(zhì)使酶的底物、產(chǎn)物以及其它效應(yīng)物在微觀環(huán)境與宏觀體系間發(fā)生了不等分配,改變了酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成平衡,從而影響酶反應(yīng)速度的一種效應(yīng)。 水的分配及酶上結(jié)合水的影響 載體的親水性越強,爭奪水的能力就越強不利于維持酶的微水環(huán)境,使酶的活性構(gòu)象受到影響。而疏水性載體利于水結(jié)合到酶分子周圍,使酶保持高活性構(gòu)象。最終固定化還需要考慮的因素有載體的表面積、顆粒大小、內(nèi)部孔徑大小等。 2021/3/17五五 pHpH選擇和離子強度的影響選擇和離子強度的影響pH選擇: 在有機溶劑的環(huán)境中,不會發(fā)生質(zhì)子化及脫質(zhì)子化的

28、現(xiàn)象。酶在水相的pH值可在有機相中保持,(pH 記憶現(xiàn)象)同一種酶不同來源,對pH值敏感程度大不相同?？赏ㄟ^控制凍干前緩沖液pH值來達到控制pH的目的.2021/3/17 與“pH記憶”相似,蛋白質(zhì)還具有配體“記憶”能力。蛋白質(zhì)溶于高濃度配體溶液時,會形成大量弱結(jié)合復(fù)合物,凍干后用無水溶劑洗去配體,獲得的蛋白質(zhì)中會有許多由配體結(jié)合時留下的“印跡”,由于蛋白質(zhì)在分子在無水溶劑中具有剛性,這些印跡得以保持,由此得到的蛋白質(zhì)為“印跡蛋白質(zhì)分子”。 其在無水溶劑中表現(xiàn)出對原始配體的極大結(jié)合容量,這種選擇性結(jié)合,可用于專一性催化、分離純化、生物傳感器。2021/3/17第四節(jié) 非水相酶催化反應(yīng)中酶催化的

29、調(diào)控非水相酶催化反應(yīng)中酶催化的調(diào)控 通過酶工程方法調(diào)控1. 基因水平的改造2. 酶分子的化學(xué)修飾 3. 固定化酶4. 凍干酶 通過底物工程方法調(diào)控 通過介質(zhì)工程方法調(diào)控 1. 溶劑2. 水活 通過其它手段調(diào)控 添加劑 微波 超聲 2021/3/17一一 酶工程酶工程、凍干酶粉和結(jié)晶酶凍干酶粉和結(jié)晶酶目前最簡單的也是被大多數(shù)研究者所采用的非水催化的體系是將固態(tài)酶粉直接懸浮在有機溶劑中。、固定化酶固定化酶酶固定化后，增大了酶與底物接觸的表面，在一定程度上可以提高酶在有機溶劑中的擴散效果和熱力學(xué)穩(wěn)定性，有利于酶的回收和連續(xù)化生產(chǎn)。、化學(xué)修飾酶化學(xué)修飾酶雙親分子共價修飾或非共價修飾酶分子表面，可以增加

30、酶表面的疏水性，使酶均一地溶于有機溶劑。2021/3/17二二 底物工程底物工程酯交換反應(yīng)中其中一個底物和產(chǎn)物都為酞基供體和酶都有結(jié)合能力,因而酯交換反應(yīng)常常是可逆的,這將導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降。為此可采用過量的?；w,但這種方法代價昂貴而且給產(chǎn)物分離帶來困難。最好的辦法是選用或改造、使用特殊結(jié)構(gòu)的底物作酞基供體以產(chǎn)生一個不可逆反應(yīng)。2021/3/17烯醇酯烯醇酯以烯醇酯作為?；w時(如乙酸乙烯酯或異丙烯酯),反應(yīng)將釋放出不穩(wěn)定的烯醇產(chǎn)物,它將很快自發(fā)地轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的醛或酮,從而有利于反應(yīng)的進行。生成乙烯和丙酮任然對酶有毒性2021/3/17乙酸異丙酯乙酸乙烯醇酯 PSL 消旋化合物 RRSS+

31、RCOOCH3OAcRCOOCH3OHRCOOCH3OHRCOOCH3OAcRCOOCH3OH有機溶劑有機介質(zhì)中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于-羥基-,-不飽和酯的拆分?？梢员苊飧狈磻?yīng)的發(fā)生。2021/3/17三三 溶劑工程溶劑工程溶劑工程方法主要集中在兩個方面:依據(jù)一些參數(shù)選擇（如logP值）合適溶劑提高反應(yīng)速率及選擇性控制水活度2021/3/17溶劑的性質(zhì)與溶劑的性質(zhì)與lgPlgP最初,研究者認為溶劑的以下性質(zhì)與酶催化活性具有很大的相關(guān)性:Hildebrand(希爾德布蘭德)溶解度參數(shù);介電常數(shù);偶極矩;分配系數(shù)的對數(shù)lgP 。溶劑理化性質(zhì)相關(guān)系數(shù)gP (%)2lgP0.900.1Hild

32、ebrand溶解度參數(shù)0.721介電常數(shù)-0.6325lgP,為化合物在標準正辛烷-水兩相體系中的分配系數(shù)的對數(shù),嚴格意義上講,lgP代表溶劑的疏水性(Hydrophobicity),而非極性(Polarity),但兩者之間有密切的相關(guān)性。2021/3/17剝離結(jié)構(gòu)水溶解疏水底物不使其向酶表面水膜層擴散2021/3/17第五節(jié) 酶非水相催化的應(yīng)用 酶 催化反應(yīng) 應(yīng)用 脂肪酶脂肪酶 肽合成 青霉素G前體肽合成 酯合成 醇與有機酸合成酯類 轉(zhuǎn)酯 各種酯類生產(chǎn) 聚合 二酯的選擇性聚合 酰基化 甘醇的?；鞍酌?肽合成 合成多肽 酰基化 糖類?；u基化酶 氧化 甾體轉(zhuǎn)化過氧化物酶 聚合 酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶多酚氧化酶 氧化 芳香化合物的羥基化 膽固醇氧化酶 氧化 膽固醇測定醇脫氫酶 酯化 有機硅醇的酯化2021/3/17一一 手性藥物兩種對映體的藥理作手性藥物兩種對映體的藥理作用用 藥物名稱有效對映體的作用另一種對映體的作用普萘洛爾（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Peni