熒光原位雜交技術(shù)

1、碩 士 學(xué) 位 論 文熒光原位雜交技術(shù)及其在環(huán)境領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用Fluorescence in situ hybridization technology and its application in the field of environment作 者 姓 名： * 學(xué)科、 專業(yè)： 環(huán)境科學(xué)與工程 學(xué) 號： * 指 導(dǎo) 教 師： * 完 成 日 期： 2014/3/26 大連理工大學(xué)Dalian University of Technology大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘 要熒光原位雜交（FISH）是現(xiàn)代分子生物學(xué)及基因工程中廣泛應(yīng)用的新技術(shù)，本文概述了FISH實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程以及技術(shù)問題等。

2、總結(jié)了一些實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵步驟的操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)，并對熒光原位雜交技術(shù)在環(huán)境微生物監(jiān)測方面的應(yīng)用做了綜述。利用FISH技術(shù)在環(huán)境樣品上直接原位雜交，不僅可以測定不可培養(yǎng)微生物的形態(tài)特征及豐度，而且可原位分析它們的空間及數(shù)量分布。并且展望了FISH技術(shù)的未來。關(guān)鍵詞：熒光原位雜交技術(shù)；探針；環(huán)境微生物；監(jiān)測- I -AbstractFluorescence in situ hybridization （FISH） is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. T

3、his article summarizes the experimental principle, process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples,

4、 can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH.Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring- III -目 錄摘 要IAb

5、stractII1 熒光原位雜交技術(shù)簡介41.1 FISH發(fā)展歷史41.2 FISH原理51.3 FISH基本過程51.3.1 探針制備61.3.2 探針的標(biāo)記71.3.3雜交前處理71.3.4 雜交81.3.5熒光檢測與結(jié)果分析91.4 FISH技術(shù)特點(diǎn)91.5 常見的技術(shù)問題及解決措施91.5.1 FISH檢測的假陽性91.5.2 FISH檢測的假陰性102 FISH技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用102.1 對硝化細(xì)菌的監(jiān)測102.2 對除磷細(xì)菌的監(jiān)測112.3 FISH技術(shù)在絲狀微生物研究中的應(yīng)用112.4 對厭氧顆粒污泥中微生物的監(jiān)測122.5 對自然環(huán)境中微生物多樣性的監(jiān)測123 未來展望13

6、參 考 文 獻(xiàn)14大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文1 熒光原位雜交技術(shù)簡介熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子結(jié)合，雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料。FISH技術(shù)是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量

7、分析。具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)在熒光原位雜交基礎(chǔ)上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術(shù)和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù)。1.1 FISH發(fā)展歷史1986年人們用異硫氰酸鹽熒光素來標(biāo)記探針，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行分析，從而建立了熒光原位雜交技術(shù)。1988年，Giovannoni等1首次將原位雜交技術(shù)引入細(xì)菌學(xué)研究中，使用放射性標(biāo)記rRNA 寡核苷酸探針檢測微生物。然而由于放射性物質(zhì)對人體有害，加上實(shí)驗(yàn)周期長，操作比較繁雜，人們開始研究使用非放射性物質(zhì)取代同位素來標(biāo)記探針，如使用生物素和地高辛標(biāo)記探針，由此建立了非放射性原位雜交技術(shù)。1989年，Delong2首

8、次使用熒光標(biāo)記寡核苷酸探針檢測單個(gè)微生物細(xì)胞。從此，人們越來越多地使用熒光原位雜交技術(shù)來檢測環(huán)境中的微生物樣品。進(jìn)入20世紀(jì)90年代以后,FISH技術(shù)在方法上逐步形成了從單色向多色- FISH的發(fā)展趨勢，靈敏度和分辨率也有了大幅度的提高。多色熒光原位雜交（M- FISH）的最大特點(diǎn)是可將多次繁瑣的FISH實(shí)驗(yàn)和多種不同基因的定位在一次FISH實(shí)驗(yàn)中完成。Cremer等3用生物素和汞或氨基乙酰熒光素標(biāo)記探針建立了雙色FISH技術(shù)。 最近，多種標(biāo)記的探針和熒光染料可以同時(shí)測多個(gè)靶序列，最新的多色FISH可同時(shí)用7種顏色進(jìn)行檢測。熒光染料具有不同的激發(fā)和散射波可以同時(shí)檢測一個(gè)或更多微生物。FISH技

9、術(shù)由于靈敏度高，具有較好的分辨力，實(shí)驗(yàn)周期短，操作安全，特別是可以同時(shí)分析一種以上的探針，它將成為微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)、微生物診斷學(xué)和環(huán)境微生物學(xué)研究的有力工具，同時(shí)FISH技術(shù)本身也得到快速發(fā)展。1.2 FISH原理熒光原位雜交是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針按照堿基互補(bǔ)的原則，與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA 區(qū)域或RNA 分子在染色體或其它細(xì)胞器中的定位，圖1.1顯示的是熒光原位雜交原理。圖1.1熒光原位雜交原

10、理圖FISH技術(shù)的目標(biāo)分子通常是16S rRNA，因?yàn)樗谖⑸矬w內(nèi)具有較高的拷貝數(shù)，分布廣泛、功能穩(wěn)定，而且在系統(tǒng)發(fā)育上具有適當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。根?jù)待測微生物體內(nèi)16S rRNA中某段特異性序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的寡核苷酸探針，就可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)微生物的原位檢測，而選取在分子遺傳性質(zhì)上保守性不同的特異序列，就可在不同水平（如屬、種等） 上進(jìn)行檢測。目前，公共和商業(yè)數(shù)據(jù)庫中已發(fā)布的16S rRNA序列逐漸增多，因此，基于16S rRNA的FISH技術(shù)的應(yīng)用也越來越廣泛，對環(huán)境樣品中微生物的原位研究也越來越方便和準(zhǔn)確。除16S rRNA 外，還可以23S rRNA 或mRNA 等作為研究的目標(biāo)分子。1.3 FIS

11、H基本過程熒光原位雜交技術(shù)基本過程如圖所示，主要包括探針制備、探針標(biāo)記、雜交、熒光檢測與結(jié)果分析。圖1.2所示的是熒光原位雜交方法標(biāo)記細(xì)胞的基本流程： 圖1.2熒光原位雜交方法標(biāo)記細(xì)胞的基本流程1.3.1 探針制備進(jìn)行熒光原位雜交試驗(yàn)首先需要有熒光探針。它是一段帶有熒光色素的核酸序列。探針有很多種，包括：DNA探針，RNA探針，寡核苷酸探針等。每種探針的特點(diǎn)如表所示。表1.1各種探針優(yōu)缺點(diǎn)4探針類型優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)DNA探針制備簡單，放射比活性好，信號特異性強(qiáng)，雜交體穩(wěn)定變性后才能使用，要基因克隆，穿透性差，易于退火RNA探針信號特異性強(qiáng)，不需變性，信噪比高，雜交體非常穩(wěn)定易被降解，易吸附于器皿上，穿

12、透性差，要做亞克隆寡核苷酸探針易制備，使用方便，穿透力強(qiáng) ，不用克隆，不會退火需核酸合成儀，需明確mRNA序列，雜交體不穩(wěn)定，信噪比低寡核苷酸探針是一種人工合成的、根據(jù)探針靶序列的堿基順序用化學(xué)方法合成的單鏈DNA，其長度為15-50個(gè)核苷酸。由于分子小，因此更容易滲透到細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域，但也正由于分子小，限制了其所能攜帶的熒光基團(tuán)或報(bào)告分子的數(shù)目，并最終導(dǎo)致雜交后熒光信號較弱。1.3.2 探針的標(biāo)記對探針的標(biāo)記是通過把熒光素標(biāo)記的核苷酸引入探針序列來實(shí)現(xiàn)的，根據(jù)引入的過程不同，標(biāo)記方法可分為缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR法等；缺口平移法：基本方法是通過酶的作用在5-3核酸鏈上產(chǎn)生隨機(jī)缺口，再通

13、過酶將核苷酸添加到缺口的3端，從而把帶有熒光色素的核苷酸引入核酸鏈。隨機(jī)引物法是以變性后的探針DNA鏈為模板，在隨機(jī)引物的引導(dǎo)下，利用酶活性把標(biāo)記核苷酸引入DNA鏈。PCR法是把熒光色素標(biāo)記的核苷酸引入DNA鏈中。FISH 技術(shù)的目標(biāo)分子通常是 16S rRNA，因?yàn)樗谖⑸矬w內(nèi)具有較高的拷貝數(shù)，分布廣泛、功能穩(wěn)定，而且在系統(tǒng)發(fā)育上具有適當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。根?jù)待測微生物體內(nèi) 16S rRNA中某段特異性序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的寡核苷酸探針，就可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)微生物的原位檢測，而選取在分子遺傳性質(zhì)上保守性不同的特異序列，就可在不同水平（如屬、種等） 上進(jìn)行檢測。1.3.3雜交前處理（1） 增強(qiáng)細(xì)胞通透性熒光原位

14、雜交實(shí)驗(yàn)的程序中，如何增強(qiáng)細(xì)胞通透性，保證核酸探針能與目標(biāo)核苷酸結(jié)合是一個(gè)重要的問題。該步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類，雜交樣品的種類和核酸探針的長度來決定。某些固定劑能影響細(xì)胞的通透性，因此需要利用一些試劑如稀釋后的酸、乙醇等進(jìn)行處理。另外，使用表面活性劑對樣品處理能夠較好地增加細(xì)胞的通透性。（2）降低背景熒光原位雜交中背景的染色是由多種因素造成的，雜交后的洗滌能夠降低背景染色。預(yù)雜交也是降低背景染色的一種有效手段，預(yù)雜交液與雜交液的不同是在于前者不含有探針。將玻片浸入到預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉特異性雜交點(diǎn)的目的，從而降低背景染色。（3）變性單鏈的DNA/RNA探針不需要變性。雙鏈DNA探針雜交前需要

15、變性為單鏈，一種方式是樣本與探針分別變性，其中雙鏈DNA變性是在70-80條件下變性10分鐘左右，然后立刻轉(zhuǎn)移到冰浴中。而樣本是放置在70-80的變性液中5-10分鐘，用70%，85%，100%的系列乙醇脫水，吹干。另一種方式是共同變性：樣本經(jīng)過70%，85%，100%系列乙醇脫水快速吹干后，將探針溶液加至玻片上，蓋上蓋玻片，封片液封固邊緣，放置在70-78的加熱板上10分鐘左右，然后立即轉(zhuǎn)入37的濕盒中。1.3.4 雜交雜交前的一切準(zhǔn)備工作都是為了能讓熒光探針在雜交這一步驟中能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，與目標(biāo)核苷酸結(jié)合。雜交能否實(shí)現(xiàn)決定了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗，因此，雜交是熒光原位雜交中最重要也是最關(guān)鍵的一步

16、。在已經(jīng)預(yù)處理好的樣品上滴加雜交液，加蓋蓋玻片就可以完成雜交。在雜交區(qū)域，探針與目標(biāo)核苷酸復(fù)性，形成DNA-RNA的合體。蓋玻片的作用是防止在雜交過程中的高溫情況致使雜交液和探針的揮發(fā)。同時(shí)，整個(gè)雜交環(huán)境應(yīng)當(dāng)保持黑暗、潮濕，可在暗盒內(nèi)灑一定量的雜交液，同時(shí)暗盒也必須耐高溫不會影響雜交的順利進(jìn)行。蓋玻片必須清潔無雜質(zhì)，同時(shí)也要光滑不會產(chǎn)生氣泡，還必須不會影響樣品細(xì)胞與雜交液的接觸。在實(shí)驗(yàn)中還必須注意以下環(huán)節(jié)。（1）探針的濃度及長度探針的濃度必須給于該實(shí)驗(yàn)最大的信噪比，探針濃度過高會造成背景染色過高，探針濃度過低會導(dǎo)致熒光信號的不足。因此，最低的探針濃度應(yīng)達(dá)到與靶核酸最大飽和結(jié)合度的程度。根據(jù)國內(nèi)

17、外多數(shù)專家學(xué)者的經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為保存濃度為5ng/L為最佳濃度。另外，雜交過程中加雜交液的量也不能太多，雜交液過多易導(dǎo)致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交的結(jié)果。探針的長度對雜交結(jié)果也有很大的關(guān)系。探針短則易進(jìn)入細(xì)胞，雜交效率高，雜交時(shí)間短，但是信號不是很強(qiáng)烈。探針長則信號好，易觀察，但是不易進(jìn)入細(xì)胞，雜交時(shí)間廠，而且配錯(cuò)對的幾率也會增加。（2）雜交溫度和時(shí)間雜交溫度是雜交能否成功的一個(gè)關(guān)鍵因素。DNA探針需要變性解鏈后才能進(jìn)行雜交。雙鏈DNA變性一半所需要的溫度稱為DNA的溶解溫度（Tm），大多數(shù)的DNA探針需要的Tm是90，這種高溫對保存細(xì)胞完整和保持樣品黏附在載玻片上是很困難的。而使用寡核苷酸探針不需要

18、經(jīng)過這一步驟，但是雜交也需要在60左右才能進(jìn)行，這么高的溫度對樣品也是很不利的。因此在雜交過程中需加入一定量的甲酰胺反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺，Tm值就可降低0.72?？梢哉{(diào)節(jié)甲酰胺的含量來適當(dāng)降低雜交的溫度。雜交的溫度隨著探針的種類不同而不同，雜交的時(shí)間也對雜交有較大的影響。雜交時(shí)間過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性雜交。大部分的DNA探針雜交時(shí)間為2-4小時(shí)，但是為了穩(wěn)妥起見，人們將反應(yīng)時(shí)間定地較長，為16-20小時(shí)。而使用寡核苷酸探針是不需要這么長的時(shí)間的。雜交反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)當(dāng)與探針的長度和細(xì)菌細(xì)胞通透性有關(guān)，在充分進(jìn)行細(xì)胞通透性的處理之后，核酸長度很短的寡核苷酸探針只需要2-6

19、小時(shí)便可完成雜交。雜交時(shí)間因探針的種類不同而不同。1.3.5熒光檢測與結(jié)果分析熒光原位雜交的結(jié)果觀察需要使用熒光顯微鏡或者激光掃描共聚焦顯微鏡。熒光顯微鏡的特點(diǎn)為：（1）數(shù)值孔徑大于普通顯微鏡，熒光較弱。（2）光源由汞燈提供全波段的激發(fā)光，通過物鏡投射于樣品上。（3）有兩個(gè)特殊濾光片，分別濾除可見光和紫外線。觀察不同熒光標(biāo)記的探針需要調(diào)節(jié)不同的濾光片以選定適合波長的激發(fā)光1.4 FISH技術(shù)特點(diǎn)原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時(shí)間加強(qiáng)信號強(qiáng)度，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時(shí)間長、放射線的散射使

20、得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，有以下特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；5、多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。1.5 常見的技術(shù)問題及解決措

21、施1.5.1 FISH檢測的假陽性在FISH檢測中，寡核苷酸探針的特異性決定了檢測結(jié)果的可靠性和精確性，所以通常希望設(shè)計(jì)得到的寡核苷酸最好與數(shù)據(jù)庫中的寡核苷酸一樣的精確?，F(xiàn)存數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)大和所報(bào)道序列的非精確性，探針序列的檢測最好用最常規(guī)、最新版本的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行校對。而對于一些培養(yǎng)條件苛刻的和暫時(shí)無法培養(yǎng)的微生物，應(yīng)該用點(diǎn)雜交的方法分析探針的特異性，來確定探針設(shè)計(jì)的合理性。此外，一些微生物本身具有熒光性，會對FISH檢測產(chǎn)生干擾。雖然自身熒光性有利于復(fù)染，但經(jīng)常降低信噪比，同時(shí)掩蓋特異的熒光信號。所以在處理一些混合菌群時(shí)要防止自身背景熒光的處理。使用狹窄波段的濾鏡和放大系統(tǒng)以及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理

22、，可以降低背景熒光5。Lin等發(fā)現(xiàn)用H2O2預(yù)處理可以有效的減少假陽性6。Taguchi 等在使用FISH之前，用HCl 預(yù)處理可以減少來自熒光標(biāo)記寡核苷酸探針非特異性吸收的背景熒光以及減少大量的雜質(zhì)7。Hahn等發(fā)現(xiàn)用地高辛標(biāo)記探針原位觀察Frankia strains與用熒光標(biāo)記探針相比，不產(chǎn)生自身熒光問題8。1.5.2 FISH檢測的假陰性雖然大多數(shù)細(xì)菌含有高的rRNA豐度，但rRNA豐度變異不僅僅發(fā)生在種屬間，亦發(fā)生在同一菌不同生長階段，生長率慢的細(xì)菌含有低的rRNA豐度9;有些微生物細(xì)胞壁滲透性差，使探針不能充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與rRNA分子雜交，這些都將導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，優(yōu)化滲透性、

23、用高亮度的熒光染料Cy3或Cy5和多重探針標(biāo)記，應(yīng)用信號放大系統(tǒng)或多核苷酸探針和CARD-FISH均可以增加雜交信號。Watt。 等用FISH技術(shù)分析生長小麥根系的土著細(xì)菌、假單胞菌、絲狀菌的量以及分布情況時(shí)發(fā)現(xiàn)使用Cy5或Cy5。 5熒光染料可以避免在觀察時(shí)看到自身熒光10。一些研究發(fā)現(xiàn)用多核苷酸熒光雜交技術(shù)和CARD-FISH均可以發(fā)現(xiàn)在水體中豐富的古生菌，而寡核苷酸熒光雜交技術(shù)無法發(fā)現(xiàn)11，表明寡核苷酸熒光探針的雜交信號較弱，通過其方法的改進(jìn)，可以消除實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性。2 FISH技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用2.1 對硝化細(xì)菌的監(jiān)測硝化細(xì)菌是一類生理上非常特殊的化能自養(yǎng)菌，傳統(tǒng)的研究方法要經(jīng)過富

24、集、分離、分類和鑒定等步驟，耗時(shí)長（48w） ，而且因?yàn)樗玫呐囵B(yǎng)基有選擇性，使得某些易于培養(yǎng)的菌株如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterwinogradskyi 等超過了其他硝化細(xì)菌，在培養(yǎng)基中處于競爭優(yōu)勢，因此得到的優(yōu)勢類群與樣品中的真實(shí)情況有差異。此外，傳統(tǒng)的方法對培養(yǎng)困難的硝化細(xì)菌無法進(jìn)行研究。FISH技術(shù)的引入解決了上述困難。隨著人工設(shè)計(jì)合成的硝化細(xì)菌及氨氧化菌探針的不斷推出，F(xiàn)ISH技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于活性污泥系統(tǒng)、硝化流化床反應(yīng)器和膜生物反應(yīng)器等污水處理系統(tǒng)中。JuretschkoSL和SchrammA等12曾對硝化流化床、普通活性污泥等工藝的活性污泥中

25、硝化細(xì)菌的多樣性采用FISH法進(jìn)行了跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)Nitrosospira、Nitrospira為優(yōu)勢菌種，而并未探測到Ni2trosomonas和Nitrobacter。Kazuaki H等13EUB338、NSO190、NIT3和NSR1156等探針研究了同時(shí)硝化反硝化好氧膜生物反應(yīng)器中生物膜上的菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明氨氧化菌是生物膜中的優(yōu)勢菌群，而亞硝酸鹽氧化菌則未被檢出。HanWoongLeeL等14用EUB338作為一級探針，ALF1b、BET42a、GAM42a和CF319a作為二級探針對兩個(gè)不同脫氮反應(yīng)器活性污泥中的分子生物學(xué)特征進(jìn)行了定量研究，結(jié)果表明變形菌綱亞綱是反應(yīng)器中的優(yōu)勢菌

26、群，變形菌綱亞綱是反應(yīng)器中的第二大優(yōu)勢菌群。OlavSliekers等15采用FISH技術(shù)對CAN-ON工藝調(diào)試過程中的優(yōu)勢菌種變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明：在厭氧運(yùn)試階段，以亞硝酸菌或硝酸菌的核酸探針檢測，沒有在污泥中檢出亞硝酸細(xì)菌和硝酸細(xì)菌（檢測限1%），以厭氧氨氧化細(xì)菌的核酸探針檢測，大部分細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，污泥中的厭氧氨氧化菌占80%左右；在限氧運(yùn)行7周后，同等測試結(jié)果顯示活性污泥中的亞硝酸菌與厭氧氨氧化菌所占的百分率分別為45%和40%，而硝酸菌則未被檢出。由此推斷：在限氧條件下，硝酸細(xì)菌不能與亞硝酸細(xì)菌競爭氧，也不能與厭氧氨氧化菌競爭亞硝酸鹽。2.2 對除磷細(xì)菌的監(jiān)測近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者

27、利用原位雜交技術(shù)對不同除磷工藝中聚磷菌的生態(tài)變化進(jìn)行了大量研究。FISH技術(shù)的應(yīng)用克服了以往除磷菌難于用常規(guī)方法培養(yǎng)造成的研究上的困難，并對不同條件下生物除磷工藝的改進(jìn)起到了指導(dǎo)性的作用。Mamoru對除磷工藝的FISH研究中，使用ALF1b、HGC和Bet42a探針檢測出的細(xì)菌量所占比例較大，分別在10%64%；MP2和CF探針探測到的細(xì)菌含量并不高，在4%以下。在強(qiáng)化除磷（EBPR）工藝中，無論好氧或厭氧區(qū)的活性污泥中都存在著大量豐富的除磷微生物，其中常見類群為Bet Proteobacteria亞類的Actinobacteria菌、GPBHGC、Epbr15和Epbr16等。近期報(bào)道16

28、的Rholocyclus也是生物除磷的優(yōu)勢種群，并且利用常規(guī)培養(yǎng)方法不能培養(yǎng)的- 亞綱變型細(xì)菌也在EBPR工藝中探測到。 2.3 FISH技術(shù)在絲狀微生物研究中的應(yīng)用在污水生物處理工藝系統(tǒng)內(nèi)，絲狀微生物的大量滋生是引起污泥膨脹的主要成因。由于其對培養(yǎng)基的選擇性很強(qiáng)，不易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)，所以用傳統(tǒng)的方法對絲狀菌進(jìn)行監(jiān)測困難較大。利用FISH技術(shù)使該問題得到了較好的解決，許多科學(xué)工作者對活性污泥中絲狀微生物作了大量的FISH鑒定工作，從探針的設(shè)計(jì)及應(yīng)用等方面作了詳盡的闡述。FISH技術(shù)的應(yīng)用對深入認(rèn)識絲狀微生物膨脹機(jī)理提供了大量有用的信息。2.4 對厭氧顆粒污泥中微生物的監(jiān)測厭氧顆粒污泥是由多

29、種具有互營共生關(guān)系的厭氧微生物形成的復(fù)雜聚集體，是UASB、EGSB和IC等厭氧反應(yīng)器高效穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵，眾多研究者對其形成機(jī)理、微觀結(jié)構(gòu)、微生態(tài)等進(jìn)行了大量研究，但基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物學(xué)研究方法自身存在的缺陷、顆粒污泥中微生物組成及其相互關(guān)系的復(fù)雜性以及某些厭氧細(xì)菌（如產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌和產(chǎn)甲烷細(xì)菌）的生長特異性等，使得對厭氧顆粒污泥的認(rèn)識至今仍未取得共識。FISH技術(shù)的出現(xiàn)可以在很大程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。利用FISH技術(shù)對顆粒污泥所進(jìn)行的研究，主要集中在以下幾個(gè)方面17：（1）組成顆粒污泥的各種微生物的種屬關(guān)系及其空間分布；（2）工藝或環(huán)境條件對顆粒污泥內(nèi)部微生物空間分布的影響；（3）兩

30、種或多種特定微生物之間的生態(tài)關(guān)系等。HermieJ ， MHarmsen18等人利用EUB338、ARC915、MX825和MG1200等探針的不同組合，研究發(fā)現(xiàn)以蔗糖為基質(zhì)的顆粒污泥分為三層：外層為真細(xì)菌，中間層為產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌與產(chǎn)甲烷絲菌的共生體，內(nèi)層存在著較大空洞，有少量產(chǎn)甲烷細(xì)菌和無機(jī)物；而以混合揮發(fā)酸為基質(zhì)的顆粒污泥只分為較明顯的兩層：外層是真細(xì)菌內(nèi)層則以產(chǎn)甲烷絲菌為主。Sekiguchi YY等人19利用EUB338和ARC915探針確定了真細(xì)菌和古細(xì)菌在中溫和高溫厭氧顆粒污泥中的分布情況，然后利用MX825、MG1200、MB1174、MS1414和D660等探針的不同組合對不同

31、種類產(chǎn)甲烷細(xì)菌與真細(xì)菌的空間分布進(jìn)行研究。結(jié)果表明：中溫和高溫顆粒污泥具有相似的微生物分布結(jié)構(gòu)，外層主要是真細(xì)菌，內(nèi)層主要是古細(xì)菌；顆粒中心均不能被染色，可能是無機(jī)物或死亡細(xì)菌；古細(xì)菌中以索氏產(chǎn)甲烷絲菌為主，在高溫顆粒污泥中還存在少量的產(chǎn)甲烷八疊球菌；真細(xì)菌則種類較多，主要有脫硫葉菌、互營桿菌、和綠色非硫細(xì)菌等。2.5 對自然環(huán)境中微生物多樣性的監(jiān)測由于顯微鏡下可見的微生物99%以上通過常規(guī)方法不能被培養(yǎng)，由于培養(yǎng)條件與自然條件的差異，實(shí)際上培養(yǎng)所得到的只是自然環(huán)境中的少部分微生物，而且往往加入了濃度遠(yuǎn)高于自然狀況的營養(yǎng)物質(zhì)，其結(jié)果是在新的選擇壓力下群落結(jié)構(gòu)通常會發(fā)生變化，適應(yīng)豐富營養(yǎng)條件的菌

32、種成為優(yōu)勢種，取代了自然條件下的優(yōu)勢種。20由于核酸序列可以提供遺傳距離、分子雜交探針等信息，可進(jìn)一步用于鑒定、監(jiān)測自然生態(tài)系統(tǒng)中的微生物?；诤怂岢樘岷蚉CR擴(kuò)增等技術(shù)存在一定程度的偏差，而FISH技術(shù)可以將整體微生物清晰地呈現(xiàn)出來而不需要額外的抽提和擴(kuò)增等易引起偏差的步驟，精確性更好。所以，F(xiàn)ISH技術(shù)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物多樣性的研究。近幾年，應(yīng)用FISH技術(shù)研究自然環(huán)境微生物多樣性的報(bào)道較多，如河水和高山湖水的浮游菌體、海水沉積物的群落以及土壤和根系表面的寄居群落。SimonNathalie等21在2002年利用FISH技術(shù)研究海水中細(xì)菌和有害藻類種群之間的相互作用；應(yīng)用FISH技術(shù)不

33、僅能研究微生物群落結(jié)構(gòu)的特征，還可以跟蹤微生物種群的動(dòng)態(tài)變化。Liu J等222002年利用FISH技術(shù)監(jiān)測了河流中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，并利用此技術(shù)得到了一些在人工條件下很難培養(yǎng)的菌種以及一些新的微生物信息。FISH技術(shù)也被用于監(jiān)測環(huán)境中的微生物群落動(dòng)態(tài)，如季節(jié)變化對高山湖水微生物群落的影響、原生動(dòng)物的攝食對浮游生物組成的影響等。此外，我們不僅可以更準(zhǔn)確地了解不同環(huán)境下微生物群落中各種功能菌群的組成比例，而且對不同功能菌群的相互作用有了更直觀的認(rèn)識。3 未來展望FISH技術(shù)在國內(nèi)外環(huán)境微生物監(jiān)測中已得到較為廣泛的應(yīng)用，技術(shù)水平日趨成熟。然而，F(xiàn)ISH技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用尚處在起步階段

34、，還存在著不足：首先，F(xiàn)ISH檢測的精確性和可靠性依賴于寡核苷酸探針的特異性，因此探針的設(shè)計(jì)和評價(jià)十分重要，目前一些探針的靈敏度還有待提高；其次，微生物的自身熒光也會干擾FISH檢測而出現(xiàn)假陽性使檢測結(jié)果出現(xiàn)正偏差，一些細(xì)菌如假單孢菌屬、軍團(tuán)菌屬、世紀(jì)紅藍(lán)菌、藍(lán)細(xì)菌屬和古細(xì)菌如產(chǎn)甲烷菌中存在這樣的熒光特性，環(huán)境樣品中自發(fā)熒光的生物或存在于微生物周圍的化學(xué)殘留物使應(yīng)用FISH分析環(huán)境微生物變得復(fù)雜；此外，試驗(yàn)過程中雜交液滲透不充分、雜交后熒光標(biāo)記見光褪色等則會導(dǎo)致假陰性而使檢測結(jié)果出現(xiàn)負(fù)偏差；另外，一些生長緩慢的細(xì)胞由于rRNA含量低而很難被探測到。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)作為一項(xiàng)新興的研究手段和工具

35、，還需要在高靈敏度探針的研究與開發(fā)、熒光信號的完善與加強(qiáng)、雜交過程的優(yōu)化等幾個(gè)方面進(jìn)行加強(qiáng)和改進(jìn)。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)和精密儀器設(shè)備研制技術(shù)的不斷發(fā)展和新探針的開發(fā)，F(xiàn)ISH技術(shù)將具有更強(qiáng)的可操作性和實(shí)用性，從而使FISH技術(shù)在環(huán)境微生物的監(jiān)測和生態(tài)學(xué)解析中具有更廣闊的應(yīng)用前景。參 考 文 獻(xiàn)1 Giovannoni S J, DeLong E F, Olsen G J, et al. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cellsJ. J

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