無菌方法驗證

1、無菌方法驗證品名： 規(guī)格：批號： 檢查時間： 1.培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，批號： 由： 提供； 營養(yǎng)肉湯， 批號： 由： 提供； 改良馬丁培養(yǎng)基 批號： 由： 提供。2.驗證試驗用菌種：(1) 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cmcc(b) 26003；(2) 枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）cmcc(b) 63501； (3) 大腸埃希菌（escherichia coli） cmcc(b) 44102；(4) 銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa) cmcc(b) 10104(5) 生孢梭菌(clostridium s

2、porogenes)cmcc(b) 64941；(6) 白色念珠菌(candida albicans)cmcc(f) 98001； (7) 黑曲霉菌(aspergillus niger) cmcc(f)98003。3. 儀器和濾器：zw-2008智能集菌儀 zw-808a智能集菌儀4.方法：中國藥典2005版二部附錄。5.操作方法： 5.1 菌液制備：取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中, 生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中, 培養(yǎng) 小時。取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌肉湯培養(yǎng)物 ，

3、加 生理鹽水，10倍遞增稀釋至約10-510-8之間，其中金黃色葡萄球菌取 稀釋級，銅綠假單孢菌取 稀釋級，大腸埃希菌取 稀釋級，枯草芽孢桿菌取 稀釋級，生孢梭菌取 稀釋級。白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中, 培養(yǎng) 小時。再取白色念珠菌真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水 洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，取 加 生理鹽水，10倍遞增稀釋至 ，取 加生理鹽水 ，混勻備用。將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基上， 培養(yǎng) ，使大量的孢子成熟。再取黑曲霉真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水 洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，稀釋至 ，取 加生理鹽水 混勻備用。5.2 菌液計數(shù)：分別取上述5

4、種細(xì)菌菌液 加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，每種菌液做平行 管。 培養(yǎng) 。 分別取上述2種真菌菌液 加入改良馬丁培養(yǎng)基中，每種菌液做平行 管。 培養(yǎng) 。細(xì)菌和真菌數(shù)計數(shù)結(jié)果分別見表1和表2。表1     細(xì)菌數(shù)計數(shù)結(jié)果菌 種大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌生孢梭菌計數(shù)(cfu)均值(cfu)表2    真菌數(shù)計數(shù)結(jié)果菌 種黑曲霉菌白色念珠菌計數(shù)(cfu)均值(cfu)5.3 培養(yǎng)基靈敏度檢查：取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基11支，分別接種的大腸埃希菌菌液 ml，金黃色葡萄球菌菌液 ml、枯草芽孢桿菌菌

5、液 ml、銅綠假單胞菌菌液 ml、生孢梭菌液 ml各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天。取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種白色念珠菌菌液 ml，黑曲霉菌 ml各2支，另1支不接種作空白對照，培養(yǎng)5天。結(jié)果如下表：表3 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基靈敏度檢查觀察結(jié)果菌 種大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌生孢梭菌cfu陰性對照表4 改良馬丁培養(yǎng)基靈敏度檢查觀察結(jié)果菌 種黑曲霉菌白色念珠菌cfu陰性對照 6. 供試液制備：取樣品 袋，分別用力擠壓使兩室完全貫通，藥物充分溶解備用。7. 薄膜過濾：將供試品液按薄膜過濾法過濾，氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次 ，沖洗液量分別考察

6、： ml， ml,在最后一次的沖洗液中逐一加入試驗菌少于100cfu。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。每天觀察并記錄結(jié)果。7.1 陽性對照：取以配制好的大腸埃希菌菌液 ml，金黃色葡萄球菌菌液 ml、枯草芽孢桿菌菌液 ml、銅綠假單胞菌菌液 ml、生孢梭菌細(xì)菌菌液 ml，分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中；取白色念珠菌菌液 ml，黑曲霉菌 ml，分別接種至改良馬丁培養(yǎng)基。7.2 陰性對照：兩個濾器桶內(nèi)各過濾氯化鈉-蛋白胨緩沖液 ml，然后取出濾膜分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中，不加對照菌液，分別給以相應(yīng)條件培養(yǎng)。8. 培養(yǎng)：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 培養(yǎng) ；改良馬丁培養(yǎng)基 培養(yǎng) 。9. 結(jié)果9.1 實驗結(jié)果見表5和表6。 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌生孢梭菌沖洗量 ml 沖洗量 ml  陽性對照 陰性對照 表5   細(xì)菌實驗結(jié)果 (20小時觀察)表6     36小時觀察真菌結(jié)果 黑曲霉菌白色念珠菌沖洗量 ml沖洗量 ml陽性對照陰性對照10.結(jié)論： 檢驗人： 復(fù)核人：檢驗人：結(jié) 論陰性對照