谷氨酸生產(chǎn)工藝

1、第一部分 實驗?zāi)康囊徽莆展劝彼岚l(fā)酵的操作原理：谷氨酸的生物合成途徑、生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制、發(fā)酵條件對發(fā)酵過程影響的機(jī)制及其調(diào)控等。二掌握并實踐利用生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的一般工藝流程、發(fā)酵生產(chǎn)過程中的基本操作。三熟悉各種實驗儀器的基本原理并掌握其操作方法。四熟練掌握各項基本實驗操作技能，并了解其應(yīng)用原理。 第二部分 谷氨酸發(fā)酵的原理操作一、谷氨酸的生物合成途徑： 谷氨酸的生物合成主要包括糖酵解途徑（emp）、磷酸乙糖途徑（hmp途徑）、三羧酸循環(huán)（tca環(huán)）、乙醛酸循環(huán)、伍德沃克曼反應(yīng)（co2的固定反應(yīng)等）。 由葡萄糖發(fā)酵谷氨酸的理想途徑為：氧化還原共軛的氨基化反應(yīng)co2co2谷氨酸nadphnad

2、ph-酮戊二酸葡萄糖異檸檬酸emp（為主）2丙酮酸檸檬酸乙酰coa草酰乙酸 蘋果酸nh3hmp（約占26%）nadpnadphmp（約占26%） 在谷氨酸發(fā)酵時，糖酵解經(jīng)過emp及hmp兩個途徑進(jìn)行，生物素充足菌hmp所占的比例是38%，控制生物素亞適量，發(fā)酵產(chǎn)酸期，emp所占的比例更大，hmp所占的比例約為26%，生成丙酮酸后，一部分氧化脫羧生成乙酰coa，一部分固定co2生成草酰乙酸或蘋果酸，草酰乙酸與乙酰coa在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，再經(jīng)氧化還原共軛的氨基化反應(yīng)生成谷氨酸。由于三羧酸循環(huán)中的缺陷，即喪失-酮戊二酸脫氫酶的氧化能力或氧化能力微弱，谷氨酸生產(chǎn)菌采用乙醛酸循環(huán)途

3、徑進(jìn)行代謝，提供四碳二羧酸及菌體合成所需的中間產(chǎn)物等，因此，對異檸檬酸的兩種競爭性反應(yīng)是很重要的。在發(fā)酵的菌體生長期，為了獲得能量和產(chǎn)生生物合成反應(yīng)所需的中間產(chǎn)物，需要異檸檬酸裂解酶反應(yīng)，走乙醛酸途徑；在谷氨酸生產(chǎn)期，最好沒有異檸檬酸裂解酶反應(yīng)，封閉乙醛酸循環(huán)。這就說明，再谷氨酸發(fā)酵中，菌體生長期和谷氨酸生產(chǎn)積累期的最適條件是不一樣的。谷氨酸產(chǎn)生糖代謝的一個重要特征就是-酮戊二酸氧化能力微弱。在銨離子存在下，-酮戊二酸因谷氨酸脫氫酶的催化作用，經(jīng)還原氨基化反應(yīng)生成谷氨酸。谷氨酸生產(chǎn)菌的谷氨酸脫氫酶活性都很強(qiáng)，這種每以nadp為專一性輔酶，谷氨酸發(fā)酵的氨同化過程，是通過連接nadp的l-谷氨酸脫

4、氫酶催化完成的。在銨離子存在下谷氨酸脫氫酶與異檸檬酸脫氫酶緊密偶聯(lián)起來，形成強(qiáng)的氧化還原共軛體系，使-酮戊二酸還原氨基化生成谷氨酸。若銨離子進(jìn)一步過剩，發(fā)酵液偏酸性，ph在5.56.5，谷氨酸進(jìn)一步生成谷氨酰胺。二發(fā)酵過程主要變化及中間代謝控制 建立發(fā)酵過程的各種監(jiān)控系統(tǒng)，對于發(fā)現(xiàn)和分析過程中出現(xiàn)的問題，及時對發(fā)酵的方向加以控制是高產(chǎn)和穩(wěn)定的重要條件。為此我們必須了解：（1）.在短的間隔時間內(nèi)過程所處的狀態(tài)，（2）.微生物怎樣適應(yīng)環(huán)境條件的變化。即我們需要一種控制發(fā)酵的模型。 發(fā)酵過程主要變化規(guī)律及中間代謝控制的方法如下：a適應(yīng)期發(fā)酵初期，菌體長大，但沒有分裂，糖等基質(zhì)基本不消耗，ph稍有上升

5、是由于尿素分解放出氨氣所致。b對數(shù)生長期 菌體開始繁殖，代謝逐漸旺盛。個體生長和群體繁殖交替進(jìn)行，菌體形態(tài)和二級種子相同，絕大多數(shù)為e型分裂。耗糖速度逐漸加快，尿素被尿酶分解放出氨使ph上升，然后被菌體利又使ph下降，這時必須及時添加尿素來補(bǔ)充氮源和調(diào)整ph值，此階段一般為3-10hc轉(zhuǎn)化期 在生物素限量的情況下部分菌體體內(nèi)生物素含量由豐富轉(zhuǎn)向貧乏，使部分菌停止繁殖，在條件適宜時開始伸長膨脹，形成生產(chǎn)型細(xì)胞，開始積累谷氨酸，這是菌體有增殖型向生產(chǎn)型轉(zhuǎn)化的時期，在此時期中菌體數(shù)量達(dá)到最大值，v字型和伸長膨大型菌同時存在。 這是代謝最旺盛階段耗糖加快，谷氨酸生成迅速增加，耗氧速率加快。并接近最大值

6、.對發(fā)酵控制來說，此時期以前的控制是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵，此時期的變化受生物素的明顯影響，當(dāng)生物素過量時，沒有明顯的轉(zhuǎn)化期，菌體形態(tài)為粗狀，短胖，類似粽子培養(yǎng)的菌型，耗糖快，耗脲快，產(chǎn)酸低，若生物素太少，菌的數(shù)量不足，耗糖慢產(chǎn)酸低，周期長d產(chǎn)酸期 菌體完成又正值期向生產(chǎn)期轉(zhuǎn)化后，菌體都伸長膨大像花生，大量累積谷氨酸，耗糖與產(chǎn)酸相適應(yīng)，產(chǎn)酸大最大值，對糖轉(zhuǎn)化率達(dá)50-60%，應(yīng)繼續(xù)流加尿素，保證有充足的氮源，ph值維持7.0-7.2。為加快產(chǎn)酸速率適當(dāng)提高溫度，一般為36-37攝氏度。根據(jù)菌體的體積耗氧速率繼續(xù)供氧，在正常的發(fā)酵情況下，這一時期中發(fā)酵已定局，容易控制。隨著發(fā)酵時間的延長，糖已逐漸耗盡,

7、產(chǎn)酸增加，菌體活力逐漸降低。流加尿素以少量為好，控制ph值6。8-7。0。當(dāng)殘?zhí)墙档?%，根據(jù)發(fā)酵情況，可將風(fēng)量降到最低，促進(jìn)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成谷氨酸，這時就可以開始提取谷氨酸了。次倍增期間，開始出現(xiàn)異常形態(tài)的細(xì)胞；發(fā)酵后期，常出現(xiàn)類似花生狀的有橫膈膜的多節(jié)細(xì)胞，菌體形狀基本清楚，谷氨酸高產(chǎn)。倘若生物素過量，就會只長菌不產(chǎn)酸或長菌好產(chǎn)酸低。三 、谷氨酸發(fā)酵過程中的檢測原理（1）氨基酸檢測茚三酮法茚三酮反應(yīng)原理 茚三酮在弱酸溶液中，與氨基酸反應(yīng)，進(jìn)行脫氨氧化的脫羧反應(yīng)其反應(yīng)物呈藍(lán)色，可用作比色復(fù)寫，或在紙層析上顯色。所生成的co2 也可用于氣體分析法進(jìn)行定量。步驟：混勻 樣品稀釋100倍取1ml +

8、 茚三酮1ml沸水浴20min定容至10ml 梯度標(biāo)樣配制515nm測光度（2）還原糖檢測dns法dns反應(yīng)原理 還原糖的測定是生化分析中常做的項目，最方便的方法是分光光度法。在堿性條件下，顯色劑dns與還原糖共熱后被還原成紅棕色氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與顯色后溶液的顏色強(qiáng)度成比例關(guān)系，因此可用分光光度法測定樣品中還原糖的含量。步驟：樣品稀釋1000倍取1ml + dns 1ml沸水浴5min定容至10ml梯度標(biāo)樣配制520nm測吸光度（3）革蘭氏染色 一種傳統(tǒng)的菌體染色方法，可更清楚的觀色菌體形態(tài)及結(jié)構(gòu)程序：涂片干燥加熱固定冷卻結(jié)晶紫初染碘液媒染酒精脫色番紅復(fù)染干燥鏡檢1涂片 固定

9、 取干凈載玻片一張放在染色架上， 滴發(fā)酵液一滴，干燥加熱固定2染色 待涂片冷卻后，滴結(jié)晶紫染色1分鐘，水洗；碘液媒染1分鐘，水洗；95%的酒精脫色，20-30秒（嚴(yán)格控制時間）；番紅復(fù)染2-3分，水洗；干燥。第三部分 材料和儀器一、實驗材料（1） 菌種：谷氨酸發(fā)酵棒桿菌（2） 試劑蛋白胨nacl瓊脂粉 葡萄糖尿素 k2hpo4 mgso47h2okcl 酵母膏 牛肉膏 活性炭粉 feso4.7h2o cacl2（無水）3，5-二硝基水楊酸（dns） 酒石酸鉀鈉 二甲苯95%乙醇 na2hpo 茚三酮 鹽酸mgso47h2o k2hpo4na2hpo4feso4 ,二、實驗器材 可見分光光度計紫

10、外分光光度計恒溫水浴鍋恒溫水箱恒溫?fù)u床恒溫培養(yǎng)箱高壓蒸汽滅菌鍋無菌超凈工作臺電動離心機(jī)ph計廣泛試紙電爐電子天平吸爾球光學(xué)顯微鏡洗瓶玻璃器皿三角瓶燒杯試管具塞刻度試管培養(yǎng)皿移液管膠頭滴管容量瓶量筒第四部分 試驗過程一培養(yǎng)基的制備一、級種子培養(yǎng)基配方：（50ml）1尿素：0.54g2磷酸氫二鉀：0.05g3葡萄糖：1.250g4七水合硫酸鎂：0.02g5牛肉膏：0. 5g6 酵母膏：0.05g發(fā)酵培養(yǎng)基配方：（500ml）1尿素：4.841g2葡萄糖：50.1g3氯化鉀：0.251g4七水合硫酸鎂：0.302g5磷酸氫二鈉：0.851g6酵母膏：0.5g7微量元素：5ml（七水合硫酸鐵，硫酸鎂，

11、二水合氯化鈣）發(fā)酵培養(yǎng)基用1000ml錐形瓶裝液500ml，酵母膏調(diào)節(jié)ph為3-4單獨滅菌。培養(yǎng)基均為高溫滅菌，滅菌溫度為121攝氏度，30min。二谷氨酸和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線（一）谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：。取7支10ml具塞刻度試管，編號，分別加入標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，再加入茚三酮各1ml，沸水浴20min，冷卻以后蒸餾水稀釋至10ml，在570nm下比色，以谷氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。濃度00.10.30.50.70.91比色值00.5240.7441.0611.2871.4011.423谷氨酸濃度單位：0.1m

12、g/ml標(biāo)準(zhǔn)公式y(tǒng)=1.724x（二）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：從三角瓶中用具塞刻度試管取發(fā)酵液1ml，注意無菌操作，以10倍比稀釋100倍，另取一個具塞刻度試管（10ml）,加入1ml稀釋液，1mldns，沸水浴5min，在比色儀下以520nm比色，記錄吸收度值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線下求出葡萄糖濃度濃度00.10.30.50.70.91比色值00.0920.3090.4520.5750.6140.624葡萄糖濃度單位：0.1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)公式y(tǒng)=0.769x三、發(fā)酵過程的監(jiān)控發(fā)酵過程中的ph值控制在7.27.4之間。搖床的轉(zhuǎn)速120r/min時間谷氨酸比色值谷氨酸濃度葡萄糖比色值葡萄糖濃度葡萄糖濃度顯微鏡

13、觀察結(jié)果備注1.1 23：000.0660.038283060.0486666670.063285650.06328565接種一級培養(yǎng)基1.2 11：300.0686666670.039829850.2273333330.295622020.29562202取出一級培養(yǎng)基液加入發(fā)酵液培養(yǎng)18:000.1103333330.063998450.3793333330.493281310.49328131菌體較小密度不大22:000.1620.0939675170.3750.4876462940.487646294菌提較小密度增加1.3 8：350.3140.1821345710.230333333

14、0.299523190.29952319桿狀 長度（5、4、5、5、6、6）含有少量雜菌14:550.3250.1885150810.1880.2444733420.244473342 桿狀 長度（4、8、7、5、5.55、6、5.5、8.7）雜菌含量增多 雜菌較小且運動較快18:250.4663333330.2704949730.1190.1547464240.154746424長度（7、6、6.8、6、7、7、）19：15向培養(yǎng)液中加入15克葡萄糖22:300.4683333330.271655060.525250.68302990.68302991.4 10：350.4770.27668

15、2130.236250.307217160.3072171614:550.3420.198375870.2150.2795838750.27958387519:100.9456666670.5485305490.1490.1937581270.1937581270.5630.3265661250.0760.0988296490.09882964921:500.4363333330.2530935810.3920.5097529260.5097529260.4096666670.2376256770.4066666670.5288253140.5288253140.3670.212877030.

16、4090.5318595580.5318595581.5 10:150.4740.2749419950.2593333330.3372345040.33723450421：25菌液滅菌 121 30min0.4186666670.2428460940.2506666670.3259644560.32596445622:200.3440.1995359630.1436666670.1868227130.1868227130.3360.1948955920.1276666670.1660164720.1660164720.4696666670.2724284610.1026666670.1335067190.133506719葡萄糖濃度變化值圖示如上谷氨酸濃度變化圖示如上四.谷氨酸的提取（1）將500ml發(fā)酵液