常 用 實 驗 方 法

1、常 用 實 驗 方 法實驗設計一、實驗設計的意義實驗設計是科學研究計劃內關于研究方法與步驟的一項內容。在醫(yī)學科研工作中，無論實驗室研究、臨床療效觀察或現(xiàn)場調查，在制訂研究計劃時，都應根據(jù)實驗的目的和條例，結合統(tǒng)計學的要求，針對實驗的全過程，認真考慮實驗設計問題。一個周密而完善的實驗設計，能合理地安排各種實驗因素，嚴格地控制實驗誤差，從而用較少的人力、物力和時間，最大限度地獲得豐富而可靠的資料。反之，如果實驗設計存在著缺點，就可能造成不應有的浪費，且足以減損研究結果的價值。總之，實驗設計是實驗過程的依據(jù)，是實驗數(shù)據(jù)處理的前提，也是提高科研成果質量的一個重要保證。眾所周知，科研工作者在進行醫(yī)藥方面

2、的科學研究之前，需要制定完善的統(tǒng)計研究設計方案，那么什么樣的設計方案才稱得上是完善的呢？一般來說，完善的設計方案需具備以下幾個條件：實驗所需的人力、物力和時間資源；實驗設計的“三要素”和“六原則”均符合專業(yè)和統(tǒng)計學要求，對實驗數(shù)據(jù)的收集、整理、分析等有一套規(guī)范的規(guī)定和正確的方法。而其中準確把握統(tǒng)計研究設計的“三要素和六原則”，是科學實驗設計的核心。二、實驗設計的“三要素” 1實驗對象：實驗所用的材料即為實驗對象。如用小鼠做實驗，小鼠就是本次實驗的實驗對象，或稱為受試對象。實驗對象選擇的合適與否直接關系到實驗實施的難度，以及別人對實驗新穎性和創(chuàng)新性的評價。一個完整的實驗設計中所需實驗材料的總數(shù)稱

3、為樣本含量。最好根據(jù)特定的設計類型估計出較合適的樣本含量。樣本過大或過小都有弊端。    2實驗因素：所有影響實驗結果的條件都稱為影響因素，實驗研究的目的不同，對實驗的要求也不同。影響因素有客觀與主觀，主要與次要因素之分。研究者希望通過研究設計進行有計劃的安排，從而能夠科學地考察其作用大小的因素稱為實驗因素（如藥物的種類、劑量、濃度、作用時間等）；對評價實驗因素作用大小有一定干擾性且研究者并不想考察的因素稱為區(qū)組因素或稱重要的非實驗因素（如動物的窩別、體重等）；其他未加控制的許多因素的綜合作用統(tǒng)稱為實驗誤差。最好通過一些預實驗，初步篩選實驗因素并確定取哪些水平較合

4、適，以免實驗設計過于復雜，實驗難以完成。    3實驗效應：實驗因素取不同水平時在實驗單位上所產(chǎn)生的反應稱為實驗效應。實驗效應是反映實驗因素作用強弱的標志，它必須通過具體的指標來體現(xiàn)。要結合專業(yè)知識，盡可能多地選用客觀性強的指標，在儀器和試劑允許的條件下，應盡可能多選用特異性強、靈敏度高、準確可靠的客觀指標。對一些半客觀（比如讀pH試紙上的數(shù)值）或主觀指標（對一些定性指標的判斷上），一定要事先規(guī)定讀取數(shù)值的嚴格標準，只有這樣才能準確地分析自己的實驗結果，從而也大大提高了自己實驗結果的可信度。三、實驗設計的“六原則” 1. 隨機原則：即運用“隨機數(shù)字表”實現(xiàn)隨機化；

5、運用“隨機排列表”實現(xiàn)隨機化；運用計算機產(chǎn)生“偽隨機數(shù)”實現(xiàn)隨機化。盡量運用統(tǒng)計學知識來設計自己的實驗，減少外在因素和人為因素的干擾。2. 對照原則：空白對照組的設立只有通過對照的設立我們才能清楚地看出實驗因素在當中所起的作用。當某些處理本身夾雜著重要的非處理因素時，還需設立僅含該非處理因素的實驗組為實驗對照組；歷史或中外對照組的設立一一這種對照形式應慎用，其對比的結果僅供參考，不能作為推理的依據(jù)；多種對照形式同時并存。3. 重復原則：所謂重復原則，就是在相同實驗條件下必須做多次獨立重復實驗。一般認為重復5次以上的實驗才具有較高的可信度。 4. 平衡原則：一個實驗設計方案的均衡性好壞

6、，關系到實驗研究的成敗。應充分發(fā)揮具有各種知識結構和背景的人的作用，群策群力，方可有效地提高實驗設計方案的均衡性。在實驗設計的過程中要注意時間上的分配，只有在時間上分配好了，才不會出現(xiàn)一段時間特別忙而一段時間特別閑的情況。5. 彈性原則：所謂空格，指的是在時間分配圖上留有空缺。適當?shù)目杖笔欠浅１匾?，只有這樣才能富有彈性的實施實驗計劃，并不斷地調整好自己的實驗進度。6. 最經(jīng)濟原則：不論什么實驗，都有它的最優(yōu)選擇方案，這包括在資金的使用上，也包括人力時間的損耗上，必要時可以預測一下自己實驗的產(chǎn)出和投入的比值，這個比值越大越好，當然是以你所擁有的實驗條件作基礎的。組織切片的制備【目的】組織標本必

7、須首先被制成組織切片，再經(jīng)過染色處理，然后才能在顯微鏡下進行臨床診斷和科學研究。【原理】蘇木素染色結合伊紅染色是常規(guī)組織學染色技術，也稱為H & E染色。蘇木素是堿性染色，細胞核被染成深紫或蘭色，常用作核染色；伊紅是酸性染色，細胞漿染呈紅色，常用作胞漿染色?！静牧稀?.試劑和溶液（1）2-甲基丁醇(異戊醇)（2）干冰（3）O.C.T.(Tissue-Tek, SAKURA)（4）冰凍或石蠟組織塊（5）酸性Harris 蘇木素染料（6）1酸性酒精70酒精 99 ml濃鹽酸 1 ml（7）醇溶性伊紅染料（8）酒精（9）二甲苯（10）樹脂封片液2.設備（1）塑料模具（2）長鑷子（3）Supe

8、rfrost Plus玻片(Fisher Scientific)（4）蓋玻片（5）刀片(一次性或非 一次性)；（6）冰凍或石蠟切片機(Leica , Micorm 或其它)【方法】方法1、冰凍切片的制備一、準備冰凍組織1. 用塑料或不銹鋼容器盛上2-甲基丁醇(異戊醇)，然后不時放入小塊干冰，使溫度降至-40ºC到-50ºC,并保持低溫。2. 標記塑料模具并將O.C.T灌入模具，覆蓋其底部。3. 收集組織標本?？焖伲p柔和準確地取材以保證組織標本的質量，是獲得高質量免疫標記染色的最基本條件。4. 將取下的組織標本置入灌有O.C.T 的模具，用O.C.T 灌滿模具，直至標本完全

9、被其覆蓋。組織標本應盡量貼近模具底部，使標本在切片時易于暴露。酌情調整組織標本的位置。用長鑷子挾住模具，放入冷卻了的2-甲基丁醇(異戊醇)溶液中。為了避免產(chǎn)生空泡，先將模具底部觸及溶液，盛有標本的模具從底部開始向表面冷凍，然后將整個模具放入溶液中5-10分鐘。（1）多數(shù)取下的組織標本可以直接放入模具。如標本沾有大量液體，應當用吸水性能好的紙沾去多余的液體，然后冷凍包埋。不要用溶液清洗標本。（2）需要先固定處理的組織標本，可以在完成固定后，用10到30蔗糖-緩沖液處理，再冷凍包埋。5. 將凍好的組織標本保存在-80ºC 冰箱以待使用。二、制作冰凍切片1. 切片前先將冰凍組織標本從-80

10、ºC冰箱里取出，放在冰凍切片機(-20ºC) 內復溫。2. 用O.C.T.將冰凍組織塊凍在冰凍標本盤上，然后將其固定在切片機上。調整好組織塊平面與刀片的位置后，開始切片。直至切到預想的部位后，開始收集切片。根據(jù)研究目的的不同，切片可選擇不同的厚度。3-6 µm是常用的切片厚度，也可以是25-50 µm厚。3.切片在室溫下晾干，然后用理想的固定液固定。如果選用冷丙酮或丙酮/甲醇，切片在經(jīng)過20 分鐘固定，并在室溫下晾干后，可以直接用于染色，或者將其放在密封的切片盒并存入-80ºC冰箱，以待使用。4. 余下的冰凍組織塊，可用O.C.T.覆蓋其暴露面

11、，然后存入-80ºC冰箱以待下次使用。方法2、石蠟切片的制備1收集組織標本并將其固定。10福爾馬林緩沖液是最常用固定液，也可根據(jù)實驗的需要選用其它固定液。根據(jù)標本的大小，將其在室溫下固定8-24小時，或更長。標本的厚度以不超過3 mm 最佳。完成固定后，標本即可進行下一步的處理。2制作石蠟組織塊需要專用的設備，以及復雜的組織處理過程。通常由組織學或病理學實驗室完成。3石蠟切片。準備好盛有40ºC蒸餾水的水浴箱，把包有組織的石蠟塊固定在石蠟切片機上，根據(jù)需要切成一定的厚度(常用4-6 m)，將切片浮在水浴箱的水面上，再轉到Superfrost Plus片子上。切片在室溫下自然

12、風干過夜，貯存待用。蘇木素-伊紅（HE）染色蘇木素-伊紅染色即通常所說的普通染色或常規(guī)染色，又稱H.E染色。是目前應用最廣泛的染色方法。在病理診斷、教學和科研中具有重要的價值。適合于各種固定、包埋方法制作的石蠟切片以及冰凍切片等。且切片不易褪色，可以長期保存。HE染色主用于顯示各種組織的正常成份和病變的一般形態(tài)結構，各種組織或細胞的一般形態(tài)、結構特點和病變的發(fā)生、發(fā)展及修復的全過程，在質量較佳的HE染色切片上，基本上都可以觀察到，從而進行判定或研究?！緦嶒灢襟E】1. 二甲苯脫蠟3-5分鐘。×22. 95%酒精3-5分鐘。×23. 水洗。4. 蘇木素3-15分鐘。根據(jù)所配制的

13、蘇木素染液決定。5. 水洗。6. 分化。7. 流水沖洗或弱堿性溶液返蘭。8. 伊紅3-15分鐘。根據(jù)所配制的伊紅染液決定。9. 95%酒精脫水1-2分鐘。×210. 無水酒精脫水1-2分鐘。×211. 二甲苯透明1-2分鐘。×212. 中性樹膠封固。免疫組織化學染色方法（S-P法）免疫細胞化學（immunocytochemistry）是根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術?？乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子相結合的小分子；抗體則是由漿細胞針對特定的抗原分泌的球蛋白。如果將抗體結合上標記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應，即可在光鏡或電鏡下顯示出該

14、抗原存在于組織中的部位。常用的標記物有熒光素和酶。熒光素標記的稱為免疫熒光法（immunofluorescent technique），常用的螢光素有異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate）、羅丹明（rhodamine）等。酶標記的稱為酶標免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase），酶與底物發(fā)生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位?？贵w與抗原的結合方法可分為直接法和間接法兩種，直接法是將帶有標記的抗體與抗原反應，顯示出抗原存在的部位。而間接法則是在抗

15、體抗原初級反應的基礎上，再用帶標記的次級抗體同初級抗體反應，從而使初級反應得到放大，顯示增強?！緦嶒灢襟E】1、石蠟切片4-5m；2、切片脫蠟至水；3、3%甲醇雙氧水阻斷室溫10分鐘；4、 0.01M(PH 7.2)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5分鐘´3次；抗原修復，加入0.01M（PH 6.0）檸檬酸緩沖液置微波爐中10檔3分30秒，之后可進行2檔1分至1分30秒微波維持。5、自然冷卻后PBS洗，加二抗同種動物非免疫血清封閉，室溫10分鐘；6、免洗，傾出血清，分別滴加配制好的一抗4過夜；7、PBS洗5分鐘 ´ 3次；8、滴加生物素標記的第二抗體，室溫孵育10分鐘；9、PBS洗5

16、分鐘 ´ 3次；10、滴加鏈親和素-過氧化物酶，室溫10分鐘；11、PBS洗5分鐘 ´ 3次；12、新鮮配制的DAB溶液顯色3-10分鐘；13、自來水洗，蘇木素淺染細胞核，分化。自來水沖洗返蘭，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。細胞培養(yǎng)一、操作規(guī)程：1.實驗前,無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射30-60分鐘滅菌,用70酒精擦拭無菌操作臺面,并開啟無菌操作臺風機運轉10分鐘后,才可開始實驗操作.每次操作只處理一株細胞,以免造成細胞交叉污染.實驗結束后,將實驗物品帶出工作臺。如需要繼續(xù)進行下一個實驗,則用70酒精擦拭無菌操作臺面,再讓無菌操作臺風機運轉10分鐘后,才可進行下

17、一個實驗操作。2.無菌操作工作區(qū)域應保持清潔與寬敞,必要物品,如試管架,移液器或吸管頭等可以暫時放置,其它實驗用品用完后應及時移出,以利氣體流通.實驗用品要用70酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺內。實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內進行,勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。3.小心取出無菌實驗用品,避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口,不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后,用手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。4.工作人員應注意自身的安全,必須穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心,并選擇適當?shù)燃壍臒o菌操作臺(至少

18、兩級)。操作過程中,應避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,小心有毒性試劑,例如DMSO及TPA等,并避免尖銳物品傷人等。5.定期檢查下列項目：CO2鋼瓶內的CO2壓力；CO2培養(yǎng)箱內的CO2濃度,溫度,及水盤是否有污染；無菌操作臺內氣流壓力是否正常,定期更換紫外燈管及HEPA過濾器濾膜,預濾網(wǎng)（300小時/預濾網(wǎng),3000小/HEPA)。二、粉末細胞培養(yǎng)基的配制(以1 升為例)： 細胞培養(yǎng)基通常須添加10血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為 7.2 - 7.4。NaHCO3另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成 pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉

19、末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變?！驹噭┡c設備】1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要) 2. 粉末培養(yǎng)基 （1640、DMEM等）3. NaHCO3 (Sigma S-4019) 4. 電磁攪拌器 5. 無菌血清瓶 6. 0.22 微米無菌過濾膜 7. pH meter 8. 真空瓣9. CO2 氣體 【配制步驟】 1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。 2. 稱取適量之NaHCO3粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異)溶

20、于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和，約3-5 分鐘。 3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐畃H 應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調整pH。培養(yǎng)基以真空幫助通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。 4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4 (血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)。 5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。 【注意事項】1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 冰箱，避免光

21、照，實驗進行前放在37水槽中溫熱。2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。PCR（聚合酶鏈式反應）【原理】PCR（polymerase chain reaction）用于在體外將微量的目標DNA大量擴增，以便進行分析。反應體系：樣品DNA；引物（primer），是人工合成的一對寡核苷酸鏈（約15-20個核苷酸），用于擴增夾在雙引物與模板DNA互補區(qū)之間的區(qū)域；4種dNTP；Tag DNA聚合酶，是從一種嗜熱水生菌（Thermus aquaticus）中分離出來的。此酶最適作用溫度為7580，但短時間在95

22、下不失活。適宜的緩沖體系和適量的Mg2+。反應過程：變性：將反應液置于PCR儀中，提高溫度（約90-95）使DNA雙鏈解離；復性：降溫（約60左右）退火，使引物與模板結合；延伸：升溫度至70-75，在引物的引導下合成模板單鏈的互補鏈，從而形成DNA雙鏈片段；重復上述“變性復性延伸”的過程。最初幾次循環(huán)中形成的長鏈DNA較多，但隨著反應的進行，長鏈DNA以算術級數(shù)增加，而夾在兩個引物之間的目標DNA以指數(shù)級數(shù)增長，經(jīng)大約2030次循環(huán)后，擴增產(chǎn)物中主要是目標DNA?！静牧稀?. 試劑和溶液 （1）10 × PCR緩沖液500 mM 氯化鉀100 mM Tris-Cl (室溫時

23、pH 8.3)15 mM 氯化鎂（2）10 mM脫氧三磷酸核苷(dNTPs) 溶液含有所有四種dNTPs(pH 8.0)（3）耐熱的DNA 聚合酶： Taq DNA 聚合酶是從表達克隆嗜熱水生菌的DNA 聚合酶基因的大腸桿菌提純而來。此酶有53 DNA聚合酶和53外切酶活性，但是缺乏35 外切酶活性。此酶由分子量約為94 千道爾頓的多肽組成。Taq DNA聚合酶對熱穩(wěn)定，能在較高的溫度下利用引物將單鏈模板合成為DNA。 催化一典型的PCR所需酶量約為2單位。加酶量過多則有可能導致非靶序列的擴增。Taq DNA 聚合酶缺乏校正功能，在PCR過程中核苷酸摻入錯誤率可達每循環(huán)2 × 10-

24、4個核苷酸，約比使用大腸桿菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段時高4倍。對于一個30輪循環(huán)的擴增反應來說，這一摻入錯誤率將導致0.25的總錯誤頻率。這一頻率似隨和濃度的升高而增大。這些錯誤的摻入可以發(fā)生在擴增產(chǎn)物的任何位置，既有顛換也有轉換（但并無長的缺失、嵌合或插入）。單位的定義：一單位是指于74ºC將l0 nmol的脫氧核糖核苷酸30分鐘內摻入到酸性沉淀的物質中。其實驗條件是：25 mM TAPS (pH9.3), 50 mM 氯化鉀, 2 mM 氯化鎂, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml 有活性的鮭魚精液DNA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTT

25、P。 rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)兩種菌中耐熱DNA聚合酶的混合。這種混合酶特別具有53DNA 聚合酶和35外切酶（校正）的雙重活性。當按推薦量使用時，此酶可提高保真度及長鏈PCR的產(chǎn)量。常規(guī)PCR擴增靶DNA序列一般在5 kb以內。而rTth DNA 聚合酶可從人類基因組DNA中擴增至19.6 kb的球蛋白基因群和噬菌體DNA的42 kb的片段。 （4）瓊脂糖凝膠（5）10 µM的上游和下游引物（6）DNA模板（7）對照DNA（含有靶序列的DNA）（8）DNA長度標準參照物2. 設

26、備（1）0.2 ml PCR擴增管（2）可預先設定擴增方案的溫度循環(huán)器(PCR儀)【方法】方法一、基本的PCR方法下面介紹的基本PCR方法可作為任何PCR擴增的一般指導和出發(fā)點。由于各種PCR反應條件（如PCR擴增次數(shù)、溫度、Taq DNA聚合酶的濃度、引物、氯化鎂以及模板DNA）變異極大，應根據(jù)具體情況，對各種PCR反應條件進行相應調整。1按以下次序，將各成分加入0.2 ml滅菌擴增管中：成分 體積 終濃度10 × PCR緩沖液 5 µl 1 ×10 mM dNTP溶液(pH 8.0) 1 µl 每種0.2 mM10 µM 上游引物 2.5

27、µl 0.5 µM10 µM 下游引物 2.5 µl 0.5 µM5單位/µl 耐熱DNA聚合酶 0.5 µl 2.5單位DNA模板 1-10 µl 1 pg-1µg消毒的蒸餾水 至50 µl * 我們主張，對于多管反應可配制混合液于一管中，然后分裝至各管，以減少試劑損失和各管分別加樣的不準確性。2將小管中的混合物混勻，并加入50 µl礦物油或硅化油覆蓋小管中的混合物。3蓋緊小管，短暫離心，以使PCR混合物沉于管底。4小管在溫度循環(huán)器（PCR儀）中94ºC溫育3分鐘，以使模板

28、DNA完全變性。5. 按以下方法進行25-35個循環(huán)的PCR擴增：變性 94ºC 30秒 退火 55ºC 30秒延伸 72ºC 1分鐘/1 kb672ºC溫育PCR樣本10分鐘，可于4ºC維持。樣本可貯存于-20ºC直至使用。7采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應產(chǎn)物，溴化乙錠染色顯影DNA，用合適分子量標準的DNA作參照。方法二、熱啟動方法熱啟動PCR的方法是在反應溫度降至80ºC時添加Taq DNA聚合酶，以保證高特異性PCR產(chǎn)物的合成。1如基本的PCR方法所述，添加所有的PCR反應的混合物，但不加Taq DNA 聚合酶。2

29、將小管中的混合物混勻，并加入50 µl礦物油或硅化油覆蓋之。3蓋緊小管，短暫離心，以便于PCR混合物沉于管底。4小管在PCR儀中94ºC溫育3分鐘，以使模板DNA完全變性。5. 94ºC溫育后，維持PCR反應在80ºC。6每一PCR反應管添加0.5 µl (2.5 U)的 Taq DNA 聚合酶，注意應保證酶加入到油下面的PCR混合物中。7按照基本的PCR方法所述，繼續(xù)完成25-35個循環(huán)的變性、退火和延伸?！咀⒁馐马棥?. PCR引物設計：引物設計可能是PCR擴增成功最關鍵的因素。如引物設計欠佳，可能導致擴增產(chǎn)物不足，甚至擴增失敗，其原因是設

30、計欠佳的引物可導致非特異擴增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應的競爭性產(chǎn)物，從而進一步抑制PCR產(chǎn)物形成。在引物設計時必須考慮以下幾個因素，其中最重要的是引物長度、溶解溫度(Tm)、特異性、引物序列互補問題、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3-末端序列等。 （1）引物長度：由于PCR反應的特異性、退火溫度以及時間均至少部分與PCR引物長度相關聯(lián)，因此引物長度是PCR擴增是否成功關鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。（2）溶解溫度(Tm)：因加熱而斷開H鍵，使雙鏈DNA分開或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度(Tm)即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度

31、。Tm可采用下列公式計算：Tm2(A+T) + 4(G+C)。需注意PCR反應至少有兩個（一對）引物，兩個寡核苷酸引物Tm 值應比較接近，不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應溫度時可發(fā)生錯配，而引物Tm值較低，反應溫度較高時則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導致PCR擴增效率低下甚至擴增失敗。（3）引物序列互補：設計引物時應絕對沒有3個堿基以上的內引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區(qū)域，“彈回”即部分雙鏈結構將發(fā)生在退火反應時。（4）G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸：待選擇的引物序列應盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長A+T和富含

32、G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45-55。在選擇的引物序列中應沒有多G 或多C延伸，因其可促進非特異性退火，多A 和多T延伸也應避免，因其可“呼吸”和使引物模板復合物展開延伸，降低擴增的效率。同時多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也應被避免。 （5）3-末端序列：為控制引物錯配，應認真地確定PCR引物中3末端的位置?？偠灾?，應重視PCR引物設計，設計PCR引物時應認真小心。對于一個成功的PCR來說，幾個重要因素如引物長度、GC含量和3序列必須優(yōu)化。理想的引物應為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50、長度約為20個堿基，因此能使Tm值處于56-62ºC范圍。分

33、析靶基因潛在引物位點時，應考慮無單聚合體, 沒有明顯的二級結構形成的傾向，不自我互補，與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設計，節(jié)省時間，減少錯誤，可應用計算機程序優(yōu)化設計、選擇、確定寡核苷酸引物。最常用的引物設計軟件和網(wǎng)站是：/cgi-bin/primer/ primer3_www.cgi2. 模板DNA：溶解模板DNA于含有低濃度的EDTA（<0.1 mM）的10mM Tris-Cl（pH 7.6）中。DNA的濃度分別為：哺乳動物基因組（100 µg/ml），酵母基因組DNA（1 µg/ml）

34、，細菌基因組DNA（0.1 µg/ml），質粒DNA（1-5 µg/ml）。3. 防止污染：由于PCR能夠使單個DNA分子得以擴增，所以應當注意防止反應體系被痕量DNA模板污染，尤其是在待擴增靶序列濃度低的情況下，更有必要采取防備措施。（1）如有可能，應在裝有紫外燈的層流式工作臺內吸加PCR試劑和進行反應。凡不用工作臺時應打開紫外燈。應使工作臺內始終置有PCR專用的微量離心機、一次性手套、整套移液器和其他必需品。由于自動移液器的管部是常見的污染源，因此配液和移液時應當使用配有一次性吸頭和活塞的正向排液式移液器。準備一套特殊的試劑和溶液專用于PCR。所有的玻璃器皿于150&#

35、186;C下烘烤6小時，所有塑料器皿、緩沖液、吸頭和離心管使用前必須經(jīng)過高壓處理。（2）一旦進入吸加PCR試劑的專用場所并開始工作，就應戴上一副新手套，并應勤于更換。（3）準備專供自己使用的成套試劑，分裝為小份，而且最好在靠近工作臺的冰箱中設立專門位置來保存。這些試劑不得用于其他用途。配制這些試劑時，要用從未接觸過實驗室內所用任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后便將這一小份全部廢棄，不得重新置存。（4）裝有PCR試劑的微量離心管打開之前，應先在專用工作臺內的微量離心機上作瞬時離心（10秒）。這樣可使液體沉積于管底，從而減少污染手套或加樣器的機會。（5）最好在加完所有的其他反應成份、

36、包括防止蒸發(fā)用的礦物油后才吸加模板DNA。將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕彈擊管側壁，以混勻液體。再作瞬時離心（10秒），使水相和有機相分開。（6）將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應。所有并非即用管均應蓋嚴。拿過模板DNA管后應更換手套。 （7）每一次PCR必須包含陽性和陰性對照。陽性對照用于監(jiān)測PCR反應的效率，而陰性對照用于確定是否存在DNA靶序列的污染。（8）只要有可能，就應當設置陽性對照反應（即由少量適當?shù)陌行蛄袇⑴c的PCR）。對靶序列DNA所作的適當稀釋工作應于實驗前在實驗室內別的位置進行，這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實

37、驗室專門進行PCR的位置。（9）必須設置一個不含模板DNA，但含有PCR系統(tǒng)中所有的其他成份的對照反應，這一對照管須在準備好其他所有PCR以后才進行吸加。4我們上面介紹的只是一種基本的PCR反應條件，對于具體的每一種PCR反應，反應條件差異很大，需要根據(jù)情況調整。（1）時間：上面介紹的時間適用于在0.2 ml薄壁管進行PCR反應，其反應體積為50 µl，熱循環(huán)儀為Perkin-Elmer 9600 或9700、Master Cycler PCR儀（Eppendorf公司）和PTC 100（MJ Research公司）。如PCR的設備和反應體積發(fā)生改變，則時間和溫度均需要調整。每一步的

38、時間應從反應混合物達到所需要的溫度后開始計算。一般來說，由混合液原溫度達到所要求溫度的時間需要30-60秒。溫度滯后時間的長短取決于以下幾個因素，包括反應管的類型、反應混合物的體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩個連續(xù)步驟間的溫度差。因此調節(jié)溫育時間以補償這一滯后時間是非常重要的。兩寡核苷酸引物之間的距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長。上面給出的反應時間是按1000個核苷酸的靶序列擬定的。（2）溫度：選擇寡核苷酸引物到DNA模板的退火溫度是一個折衷的方案。如果降低退火溫度則擴增效率提高，但引物與模板間的錯配現(xiàn)象又可明顯增加。若將溫度提高，則擴增反應的特異性增加，但總的反應效率則會下降。因此理

39、想的辦法是設置一系列對照反應，以確定某一特定擴增反應的最適退火溫度。（3）循環(huán)次數(shù)：擴增反應的循環(huán)數(shù)取決于反應混合液中靶DNA的濃度，若將哺乳動物基因組中單拷貝基因擴增至能為瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳所見，至少需要25個循環(huán)。靶序列的指數(shù)式的擴增不是一個無限制的過程。在正常反應條件下，經(jīng)過25-30個循環(huán)擴增（即擴增約106倍）后，Taq DNA聚合酶的酶量便成為制約反應進行的因素。如需進一步擴增，應將所得的DNA樣品稀釋1000至10000倍后，再作為模板進行新的PCR。（4）緩沖液：當標準緩沖液于72ºC溫育時，反應體系的pH值將下降1個多單位，致使緩沖液的pH值接近7.2。二價

40、陽離子的存在至關緊要，鎂離子優(yōu)于錳離子，而鈣離子則無效。鎂離子的最佳作用濃度相當?shù)?1.5 mM)，因此重要的是，所制備的模板DNA中不應含有高濃度的螯合劑，如EDTA；也不應含有高濃度的帶負電荷離子基團，如磷酸根。所以，用作模板的DNA應溶于10 mM Tris-Cl (pH 7.6), 0.1 mM EDTA (pH 8.0)中。在較為廣泛的范圍內，這種標準緩沖液對于各種模板的寡核苷酸引物都能行之有效，當它并非對于模板與引物的任何一種特定組合都是最佳的。因此，應當將以上所列條件作為出發(fā)點進行修飾和改良。每當首次使用靶序列和引物的一種新組合時，或者，dNTPs或引物的濃度變化時，特別要將Mg

41、2+濃度調至最佳。dNTPs是反應中磷酸根的主要來源，其濃度的任何變化都將影響到Mg2+的有效濃度。我們建議設置一組反應，其中每一反應的Tris-Cl (10 mM)和氯化鉀 (50 mM)濃度相同，而氯化鎂濃度不同（0.05-5 mM，每次增加0.5 mM）。反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來比較各擴增產(chǎn)物的量。PCR可在熱循環(huán)儀（即PCR儀）中自動進行，以使反應各循環(huán)標準化。5. 一般來說，如第一次用新的模板DNA、新的引物或者新制備的耐熱DNA聚合酶作PCR，擴增將不如預期理想。PCR反應條件需仔細調整，以抑制非特異擴增和（或）提高目標DNA的產(chǎn)量。6. 一個成功的PCR擴增

42、反應，可出現(xiàn)一個顯而易見的與預期大小一樣長度的DNA片段，此可通過DNA序列分析、Southern 雜交和或限制性圖譜分析確定。RNA抽提制備【試劑準備】1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。 2、75乙醇：用DEPC處理水配制75乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。 3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris·Cl(pH 7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.1SDS。4、洗脫緩沖液：1

43、0mmol/L Tris·Cl (pH 7.6)，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.05SDS。一、動植物總RNA提?。═rizol法）：【操作步驟】Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。 1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10。 2、研磨液室溫放置5分鐘，然后

44、以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 3、取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。 4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75乙醇，渦旋混勻，4下7500g離心5分鐘。 5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55-60水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70乙醇并保存于-70?！咀⒁馐马棥?、 整個操作要帶口罩及一次性手套

45、，并盡可能在低溫下操作。2、 加氯仿前的勻漿液可在-70保存一個月以上，RNA沉淀在70乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。二、mRNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA?！静僮鞑襟E】1、 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g Oligo(dT)纖維素。 2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0

46、.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 3、用1柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4、將提取的RNA液于65溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2 × 柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1 × 層析柱加樣溶液。5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。 7、加入1/10體積的3M NaAc(pH 5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-2030分鐘

47、。 8、4下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70乙醇洗滌沉淀，4下12000g離心5分鐘。9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。 10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70乙醇中并貯存于-70）。 【注意事項】1、 mRNA在70乙醇中-70可保存一年以上。 2、 Oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。用堿裂解并SDS法制備小量質粒DNA【目的】用堿裂解并SDS法從小量（12 ml

48、）培養(yǎng)的細菌制備質粒DNA?！驹怼繅A裂解法是純化質粒前最常使用的裂解細菌的方法之一。產(chǎn)生堿裂解產(chǎn)物包括四個基本步驟。1懸?。簩⑹斋@的細菌懸浮在含有RNA酶A的Tris-Cl/EDTA緩沖液中。2裂解：細菌被氫氧化鈉/SDS裂解。十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解細胞壁的磷脂和蛋白成分，導致細胞內容物的裂解和釋放。氫氧化鈉使染色體和質粒DNA以及蛋白質變性。RNA酶A使得裂解期間釋放出來的細胞內RNA被消化。3中和：裂解物被酸性的醋酸鉀中和。高鹽濃度的溶液使十二烷基硫酸鉀沉淀，加上變性的蛋白質、染色體DNA和細胞殘骸共同沉淀在不溶性的含鹽去污劑的復合物中?？蓮托院鸵怨矁r鍵結合關閉的質粒DNA通過復性

49、保留在溶液中。4裂解物的澄清：高速離心清除沉淀的殘骸，得到清亮的裂解液?！静牧稀?. 試劑和溶液（1）堿性裂解溶液I50 mM 葡萄糖25 mM Tris-Cl (pH8.0)10 mM EDTA (pH8.0)（2）堿性裂解溶液II0.2 N 氫氧化鈉1% SDS（3）堿性裂解溶液III (100 ml)5 M 醋酸鉀 60 ml冰醋酸 11.5 ml水 28.5 ml （4）質粒選擇性抗生素（5）乙醇（6）含20 µg/ml RNA酶A的TE液 (pH 8.0)10 mM Tris-Cl (pH 8.0)1 mM EDTA (pH 8.0)20 µg/ml RNA酶A（

50、7）LB培養(yǎng)基2. 設備（1）14 ml 聚丙烯管（2）預設至37ºC的搖床（3）微量離心管（4）微量離心機（5）真空設備（6）振蕩器【方法】一、細菌的準備1將轉化產(chǎn)生的單菌落接種到2 ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)液中，37ºC劇烈振搖培養(yǎng)過夜。2將1.5 ml培養(yǎng)液倒入微量離心管中，在微量離心機中4ºC以最大速度離心30秒。將剩余的培養(yǎng)液貯存于4ºC。3離心結束后，吸去上清培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。二、細菌的裂解1將細菌沉淀重懸于100 µl冰冷的堿性裂解溶液I中，劇烈振蕩。2將200 µl新鮮配制的堿性裂解溶液 II 加到各個細

51、菌懸液中，蓋緊管口，快速輕柔地顛倒離心管5次以混合內容物。將離心管放置于冰上。！不要振蕩。3加150 µl冰冷的堿性裂解溶液III。蓋緊管口，翻轉離心管幾次使堿性裂解溶液III在粘稠的細菌裂解液中分散均勻，然后將管置于冰上35分鐘。4于微量離心機4ºC以最大速度離心細菌裂解液5分鐘，將上清轉移到另一離心管中。三、質粒DNA的回收1加2倍體積的乙醇到上清中，室溫下沉淀核酸。振蕩混勻，室溫下放置2分鐘。2用微量離心機于4ºC以最大速度離心5分鐘來收集沉淀的核酸。3小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流盡。用Kimwipe紙巾或一次性吸頭將附于管壁的液

52、滴吸盡。4加1 ml 70乙醇到有沉淀的管中，翻轉蓋好的離心管幾次，用離心機于4ºC以最大速度離心2分鐘回收DNA。5再小心地吸去所有的乙醇。* 此步須留意，因沉淀有時貼壁不緊。6除盡管壁上的乙醇滴，室溫放置開蓋的離心管（510分鐘）直到乙醇揮發(fā)、管內無可視的液體。7用50 m1無DNA酶含20 mg/ml RNA酶A（胰RNA酶）的TE (pH 8.0)溶解核酸，稍微振蕩幾秒，將DNA液貯存于20ºC。【注意事項】1確保細菌培養(yǎng)液有足夠量的空氣氧化度：（1）培養(yǎng)管容量至少是培養(yǎng)液量的4倍以上。（2）培養(yǎng)管蓋應寬松留隙。（3）通過劇烈振蕩培養(yǎng)細菌。2未移盡的殘留培養(yǎng)液將導致

53、質粒DNA抵抗限制性內切酶消化反應，因為細菌菌株的細胞壁成分會散落在培養(yǎng)基中，而這些成分有抑制許多內切酶反應的作用。3保證細菌沉淀物完全分散懸浮于堿性裂解溶液I中。兩個離心管底部互相接觸的振蕩方式可有效地使兩管菌體沉淀完全、迅速地分散。4確保整個離心管內壁與堿性裂解液II充分接觸。5最好養(yǎng)成以同樣方式擺放離心管于離心機轉頭的習慣。比如：依順序地將離心管的塑料鉸鏈朝外擺放，沉淀將沉積在遠離轉頭中心的管內壁上，這樣就更易發(fā)現(xiàn)可見的沉淀以及有效地溶解“不可視”的沉淀。同時，標記離心管的管壁和管蓋可幫助識別每個管。6在干燥器或真空儀中干燥DNA，可至DNA難于溶解和變性，所以通常有效的方法是在室溫下讓

54、乙醇揮發(fā)1015分鐘來干燥DNA，不致使其過度失水。7制備好的DNA，可通過電泳或限制性內切酶消化來鑒定。經(jīng)PEG處理得到的高純度DNA，可用作測序的模板。用氯化鈣制備和轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞【目的】下面簡單而快速的變通技術常用于制備成批的感受態(tài)細菌，這些細菌可使每微克超螺旋質粒DNA產(chǎn)生5 × 106 - 2 × 107個轉化菌落。該方法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株?！驹怼坑帽A冷的氯化鈣溶液處理細菌然后作短暫加熱后，可用質粒DNA轉化細菌。該處理方法誘導受體細菌處于短暫的“感受態(tài)”，在此期間它們能夠攝取各種不同來源的DNA。若將按一定形式組合的二價陽離子處理改進的大腸桿菌

55、菌株更長時間，并用DMSO、還原劑和氯化六氨合高鈷處理細菌，轉化效率可提高100-1000倍。這些試劑的作用機制尚不清楚，而質粒DNA進入大腸桿菌感受態(tài)細胞的機制同樣撲朔迷離。至于轉化率的提高，則是經(jīng)驗性的實驗結果?！静牧稀?. 試劑和溶液（1）LB 培養(yǎng)基（2）SOC培養(yǎng)基大約每次轉化反應需要1 ml培養(yǎng)基。（3）氯化鎂·氯化鈣溶液80 mM 氯化鎂20 mM 氯化鈣（4）1 M氯化鈣·2水當準備感受態(tài)細胞時，解凍10 ml貯存液用90 ml水稀釋至100 ml，通過Nalgene濾膜(0.45 m孔徑)過濾除菌，然后驟冷到0ºC。（5）質粒DNA（重組質粒）（

56、6）含適當抗生素的瓊脂LB培養(yǎng)基2. 設備（1）搖床（2）離心機和轉頭（3）用冰預冷的聚丙烯管(50 ml)（4）用冰預冷的聚丙烯管(17×100 mm； Falcon 2059)（5）水浴預設置至42ºC和37ºC（6）溫育箱預設置至37ºC【方法】一、感受態(tài)細胞的準備1. 從37°C培養(yǎng)16-20小時的平板上挑取一個單菌落(直徑2-3 mm)，轉到一個含有100 ml LB培養(yǎng)基或SOB培養(yǎng)基的1 L燒瓶中。于37°C劇烈振蕩培養(yǎng)約3小時，并監(jiān)測培養(yǎng)物的生長情況。* 如一指南中指出：1 OD600 的大腸桿菌株DH1每毫升含有10

57、9 細菌。2在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌的、一次性使用的、用冰預冷的50 ml 聚丙烯管中。在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)液冷卻至0ºC。3于4°C以2700 × g離心10分鐘，回收細菌。4倒出培養(yǎng)基，將管倒置在紙巾上1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5加30 ml冰冷的氯化鎂氯化鈣溶液，通過振搖或輕微振蕩而懸浮細菌沉淀。64°C以2700 × g離心10分鐘，回收細菌。7倒出溶液，保留細菌，將管倒置在紙巾上1分鐘以使最后殘留的痕量溶液流盡。8每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml冰冷的0.1 M 氯化鈣，通過振搖或輕振蕩而懸浮細菌沉淀。9此時，細菌可直接用于下面步驟描述的轉化或者將細菌分裝成小份，貯存于-70ºC凍存。二、轉化1氯化鈣處理的細胞可直接作轉化實驗，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中取200 l到無菌的預冷的17 × 100 mm聚丙烯管中。加DNA（DNA50 ng而體積10 l）至管中。輕輕振搖以混勻內容物，在冰上放置30分鐘。2將試管放至42°C循環(huán)水浴中的試管架上，精確放置90秒