DNA甲基化檢測(cè)方法教育課件

1、1技術(shù)研究dna甲基化檢測(cè)方法總覽2技術(shù)研究 主要檢測(cè)途徑主要檢測(cè)途徑基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法(金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn))不基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法不基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法3技術(shù)研究 基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析水解核苷酸質(zhì)譜分析4技術(shù)研究5技術(shù)研究6技術(shù)研究用于甲基化分析的樣本常常是混合樣本，不適合直接直接進(jìn)行sanger測(cè)序分析7技術(shù)研究8技術(shù)研究圖圖6 pmvk基因擴(kuò)增產(chǎn)物反向測(cè)序結(jié)果基因擴(kuò)增產(chǎn)物反向測(cè)序結(jié)果9技術(shù)研究圖圖7 trib3基因擴(kuò)增產(chǎn)物正向測(cè)序結(jié)果基因擴(kuò)增產(chǎn)物正向測(cè)序結(jié)果10技術(shù)研究應(yīng)用二：應(yīng)用二： 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后pcr克隆

2、測(cè)序(bisulfite-sequence pcr，bsp)11技術(shù)研究12技術(shù)研究 注： a：癌組織；b：癌旁組織；：未甲基化；：甲基化43a43bm43ae43a43be43b(369bp)43bbsp克隆測(cè)序結(jié)果13技術(shù)研究bsp克隆測(cè)序甲基化率三維圖形14技術(shù)研究?jī)?yōu)點(diǎn):能準(zhǔn)確的檢測(cè)出每個(gè)dna分子單倍體型的 甲基化狀態(tài)，同時(shí)能分析不同cpg位點(diǎn)之間 的甲基化狀態(tài)的聯(lián)系。缺點(diǎn)：需要對(duì)pcr產(chǎn)物克隆，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi) 力，克隆子的數(shù)目影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。 測(cè)序重復(fù)性差。15技術(shù)研究應(yīng)用三：應(yīng)用三：甲基化特異性pcr (methylafion-specific pcr，ms-pcr)16技術(shù)研

3、究17技術(shù)研究18技術(shù)研究 u m u m u m ladder100150200250msp法檢測(cè)抑癌基因法檢測(cè)抑癌基因rassf1a啟動(dòng)子區(qū)的甲基化啟動(dòng)子區(qū)的甲基化圖圖 msp檢測(cè)組織切片檢測(cè)組織切片dna甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性甲基化特異性pcr（msp）結(jié)果，）結(jié)果，u為非甲基化，為非甲基化，m為甲基化。為甲基化。19技術(shù)研究 msp擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖注：注：m表示表示 甲基化，甲基化，u表示未甲基化表示未甲基化 b1-b6b1-b6為高脂血癥組六例標(biāo)本，為高脂血癥組六例標(biāo)本，d1-d5d1-d5為正常對(duì)照組五例標(biāo)本；為正常對(duì)照組五例標(biāo)本； h h2 2o o為

4、陰性對(duì)照；為陰性對(duì)照；m m為為50bpmarker50bpmarker。srebp-1srebp-1基因啟動(dòng)子區(qū)基因啟動(dòng)子區(qū)cpgcpg島甲基化狀態(tài)島甲基化狀態(tài)20技術(shù)研究?jī)?yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便；敏感性高；nested-msp提高靈敏度，便于分析微量檢材缺點(diǎn)缺點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)要求高；只能作定性研究；存在重亞硫酸鹽處理不完全導(dǎo)致的假陽(yáng)性；只能了解部分位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。21技術(shù)研究對(duì)msp的產(chǎn)物用taqman探針進(jìn)行qpcr，從而實(shí)現(xiàn)甲基化的定量分析。優(yōu)點(diǎn)：增加了重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和dna復(fù)性的質(zhì)控對(duì)照 避免了電泳、酶切等操作缺點(diǎn)：pcr bias22技術(shù)研究應(yīng)用四應(yīng)用四：結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(

5、combined bisulfite restriction analysis，cobra)23技術(shù)研究結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法24技術(shù)研究甲基化甲基化特異性特異性的限制性內(nèi)切酶的限制性內(nèi)切酶(mdre)：可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶甲基化甲基化敏感性敏感性的限制性內(nèi)切酶的限制性內(nèi)切酶(msre)：可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶25技術(shù)研究26技術(shù)研究圖圖 1-1 msre-pcr1-1 msre-pcr原理圖原理圖注：左圖dna無(wú)甲基化, dna被切斷, 無(wú)法得到pcr產(chǎn)物; 右圖dna有甲基化, dna保持完整,可以獲得pc

6、r產(chǎn)物.27技術(shù)研究采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶技術(shù)結(jié)合pcr的方法（msre-pcr）篩選在肝癌與癌旁組織中有甲基化差異的基因。28技術(shù)研究圖1-3：dnm基因瓊脂糖凝膠電泳圖m21ae 17b 17be 17a 17ae21a空21b21be100bp250bp150bp400bp500bp注：m：marker；e：加酶體系；a：癌組織；b：癌旁組織；空：水空白29技術(shù)研究酶識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)含有一個(gè)及以上cpg位點(diǎn)應(yīng)用條件：30技術(shù)研究?jī)?yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：方法相對(duì)簡(jiǎn)單；可進(jìn)行甲基化水平的定量研究；需要樣本量少。31技術(shù)研究缺點(diǎn)缺點(diǎn)：由于cg僅限于內(nèi)切酶識(shí)別序列中，因此非識(shí)別序列的cg將被忽略；只有檢測(cè)與轉(zhuǎn)

7、錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測(cè)方法的結(jié)果才有意義；存在酶消化不完全引起的假陽(yáng)性的問(wèn)題；32技術(shù)研究應(yīng)用五：應(yīng)用五：restriction digestion and real-time pcr(qamp)33技術(shù)研究基本步驟基本步驟34技術(shù)研究舉例：the evalution of differentially methylated region(mdr) of imprinted gene u2af1-rs1,in testis and liver of mouseprimer are designed to flank notl(n),hhal(hh),and mcrbc(m)r

8、estriction sites in the dmr region.35技術(shù)研究liver and testis genomic dna templates are pcr amplicated following digestion with no enzyme(sham),notl,hhal(hh) or mcrbc.amplication using a second primer pair that has been designed to a sequence devoid of restriction sites demonstrates that the templates a

9、re of equal concentration.36技術(shù)研究the difference in the ct value of an enzyme-digested templaterelative to the sham-digested template determinates the levelsof dna methylation in each tissue.msremdre37技術(shù)研究38技術(shù)研究39技術(shù)研究40技術(shù)研究41技術(shù)研究42技術(shù)研究43技術(shù)研究啟動(dòng)子區(qū)甲基化芯片技術(shù)啟動(dòng)子區(qū)甲基化芯片技術(shù)44技術(shù)研究45技術(shù)研究46技術(shù)研究47技術(shù)研究48技術(shù)研究base-spec

10、ific cleavage49技術(shù)研究primer extension methods50技術(shù)研究51技術(shù)研究52技術(shù)研究質(zhì)譜法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：靈敏度準(zhǔn)確性高。操作較簡(jiǎn)便。局限性： dna樣本要求純度較高，提取過(guò)程中的小離子，未消化完全的蛋白，rna對(duì)結(jié)果有干擾作用。需用質(zhì)譜儀。53技術(shù)研究54技術(shù)研究擴(kuò)增基因組dna樣本重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化exosap消化pcr引物延伸加入snp引物和snapshot mixsnp引物延伸(加入ddt或ddc)sap處理分析310/3100樣本準(zhǔn)備加入gs120liz內(nèi)標(biāo)abi310/3100電泳選用e5和pop4膠 數(shù)據(jù)分析（genescan） 樣本分型（genot

11、yper或genemapper id）步驟55技術(shù)研究12345 6這是一個(gè)多重snapshot的檢測(cè)結(jié)果，總共檢測(cè)了6個(gè)cpg位點(diǎn)，陰影峰代表甲基化的c，空白峰代表未甲基化c。位點(diǎn)1、2和4顯示大約50%的甲基化率，而位點(diǎn)3、5和6顯示0的甲基化率。56技術(shù)研究57技術(shù)研究hrmhrm技術(shù)： 用于篩選大量樣本，獲得感興趣的cpgcpg位點(diǎn) 鑒定感興趣的cpgcpg 島 。58技術(shù)研究hrm技術(shù)原理技術(shù)原理 59技術(shù)研究hrmhrm技術(shù)原理技術(shù)原理 60技術(shù)研究hrm特點(diǎn) 高靈敏性：可檢測(cè)低達(dá)0.1%0.1%甲基化程度。 高通量：1 1次可同時(shí)檢測(cè)不超過(guò)384384樣本，適用于大樣本多位點(diǎn)甲基

12、化掃描。 高重復(fù)性：重復(fù)性100%100%。 使用范圍廣：不受堿基位點(diǎn)局限。 操作簡(jiǎn)便：只需設(shè)計(jì)特異引物，無(wú)須序列特異性探針，無(wú)需測(cè)序。 標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：檢測(cè)序列長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò)100bp； 只能進(jìn)行半定量檢測(cè)61技術(shù)研究應(yīng)用十二：焦磷酸測(cè)序法 62技術(shù)研究焦磷酸測(cè)序法（pyrosequencing）63技術(shù)研究焦磷酸測(cè)序法（pyrosequencing）64技術(shù)研究焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序 65技術(shù)研究焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序 66技術(shù)研究焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序 67技術(shù)研究焦磷酸測(cè)序的優(yōu)

13、勢(shì)：焦磷酸測(cè)序的優(yōu)勢(shì)：靈敏度高，可測(cè)到鄰近c(diǎn)pg區(qū)域的單個(gè)甲基化水平，甚至包括測(cè)序的引物區(qū)域。除常規(guī)的檢測(cè)位點(diǎn)變化情況外，還可準(zhǔn)確計(jì)算頻率變化。 對(duì)于檢測(cè)位點(diǎn)要求低，可檢測(cè)未知序列信息，覆蓋到人類基因組的所有cpg位點(diǎn)；對(duì)于樣品要求低，適用于新鮮、冷凍和ffpe樣本。68技術(shù)研究69技術(shù)研究應(yīng)用十三：quantification of methylated dna by heavymethyl duplex pcr70技術(shù)研究principle of heavymethyl(a) when the dna is methylated, the blocker oligonucleotides

14、(solid black) do not bind, leaving the primer binding site accessible for the primers (gray arrows) to bind and amplify the target. the amplication is detected with a methylation specific oligonucleotide probe solid black, labeled with fuorescent dye (f) and quencher (q) in a 5-exonuclease assay, us

15、ed here as an example for a real-time detection method. (b) when the dna is unmethylated, the blocker oligonucleotides bind, blocking the access of the primers to their binding sites. no pcr product is generated.71技術(shù)研究sample throughput versus genome coverage. sample throughput versus genome coverage

16、. a plot of sample throughput against genome coverage for various dna methylation techniques. throughputthroughput is determined by the number of samples that can be analysed per experiment, based on large eukaryotic genomes. coveragecoverage is determined by the number of cpgs in the genome that can be analysed per experiment. 不同甲基化檢測(cè)方法的檢測(cè)通量72技術(shù)研究1.篩選differentially methylated region；課題流程：2.對(duì)篩選出的dmr進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證是否具有甲基化差異性，同時(shí)篩選出隨齡 變化相關(guān)性強(qiáng)的cpg位點(diǎn)；3.檢測(cè)每個(gè)樣本cpg位點(diǎn)的甲基化率，做回歸分析。做回歸分析需要的樣本量很大，每個(gè)樣本需要檢測(cè)多個(gè)cpg位點(diǎn)?；诳寺?/p>