病理制片技術(shù)規(guī)范

1、病 理 制 片 技 術(shù) 的 規(guī) 范病理技術(shù)是病理學(xué)診斷不可分割的一部分，制片質(zhì)量的好壞很大程度上影響病理醫(yī)生做出正確的病理診斷。因此，保證和提高制片質(zhì)量是每個(gè)病理技術(shù)員的責(zé)任。為了保證制片質(zhì)量，減少差錯(cuò)，防范責(zé)任事故，避免醫(yī)療糾紛，有必要加強(qiáng)對病理技術(shù)進(jìn)行科學(xué)規(guī)范管理和制片的控制，為提高臨床病理診斷水平，促進(jìn)臨床病理學(xué)事業(yè)的發(fā)展做出我們應(yīng)有的貢獻(xiàn)。一、 高素質(zhì)技術(shù)人員的規(guī)范管理1 要有敬業(yè)精神，強(qiáng)烈的工作責(zé)任心、2 努力學(xué)習(xí)，刻苦鉆研，掌握過硬的基本功，引進(jìn)和學(xué)習(xí)新技術(shù)，工作精益求精。3 領(lǐng)導(dǎo)重視，為技術(shù)人員提供進(jìn)修學(xué)習(xí)和提高的機(jī)會。4 技術(shù)員

2、和醫(yī)生，技術(shù)員與技術(shù)員互相團(tuán)結(jié)，密切配合，發(fā)揮團(tuán)隊(duì)精神的作用、二、 儀器設(shè)備分規(guī)范管理1 配備先進(jìn)，高質(zhì)量的儀器設(shè)備是保證和提高制片質(zhì)量的重要條件、2 正確使用，定期維修保養(yǎng)，保證儀器設(shè)備在最佳的狀態(tài)下工作、三、 標(biāo)本和資料檔案的規(guī)范管理1 標(biāo)本和送檢單的接收檢查標(biāo)本和送檢單的名字是否相符，有否標(biāo)本，有沒有病史。標(biāo)本補(bǔ)充固定液，送檢單編號登記。 2 資料檔案的規(guī)范管理診斷報(bào)告發(fā)出后，附有診斷報(bào)告記錄的送檢單、玻片和組織蠟塊存檔并專人保管。建立嚴(yán)格的資料借出制度，確保檔案資料不被丟失。四、 技術(shù)操作規(guī)范1. 

3、;及時(shí)固定組織：應(yīng)采用10%20%甲醛液（10%甲醛液即用濃甲醛液1份加蒸餾水9份稀釋）固定組織，因甲醛易氧化成甲酸，因此多會偏酸性，最理想的是配成中性甲醛液。巨大組織要切開固定，小塊組織的固定時(shí)間約4小時(shí)左右，然后取材時(shí)修切成大小約22 x 22mm，厚不超過2mm的組織塊進(jìn)行脫水。取材時(shí)必須注意核對編號是否與送檢單上的病理號一致，并記錄好對大體標(biāo)本的描述，取材組織的形狀和數(shù)量。l 常規(guī)固定液的配制（1） 10%甲醛液濃甲醛 10ml蒸餾水 90ml(2 ) 緩沖中性甲醛液濃甲醛 10mlPBS緩沖液（

4、Ph7.2） 90ml (3 ) 10%中性甲醛液濃甲醛 10ml蒸餾水 90ml碳酸鈣 加至飽和冷凍切片固定液(1) 乙醚酒精液無水乙醚 1份95%酒精 1份(2) 酒精冰醋酸液 95%酒精 100ml冰醋酸 35滴細(xì)胞學(xué)涂片固定液的配制(1) 酒精冰醋酸液95%酒精 97ml冰醋酸 3ml(2) 乙醚-酒精液95%酒精 50ml乙醚 50ml冰醋酸 1ml(3) Carne

5、ys液無水酒精 60ml氯仿 30ml冰醋酸 10ml2. 脫水徹底：脫水液常用乙醇，用乙醇脫水要由低濃度逐級上行至高濃度（一般70%100%的濃度），逐步置換組織內(nèi)的水份。組織在乙醇脫水時(shí)，低濃度乙醇的時(shí)間可適當(dāng)延長，高濃度乙醇脫水時(shí)間不能過長。3. 透明充分: 透明液多采用二甲苯，組織脫水后轉(zhuǎn)入二甲苯，依據(jù)組織的大小、厚薄，約置3090分鐘。4. 浸蠟足夠: 浸蠟多用純凈而熔點(diǎn)稍低(5658度)的石蠟，浸蠟時(shí)采用三級或四級，以盡量清除二甲苯。浸蠟時(shí)間依據(jù)組織大小厚薄而定，一般為12少時(shí)。浸蠟時(shí)包埋機(jī)所設(shè)定的溫度

6、應(yīng)比所用石蠟熔點(diǎn)稍高以保持石蠟恰在熔溶狀態(tài)。這樣，組織才能取得良好的浸蠟效果。如浸蠟溫度過高，導(dǎo)致組織收縮，變硬變脆，難以切出理想切片。5. 包埋恰當(dāng):包埋時(shí)，包埋石蠟的溫度要比組織高(約35度)，否則包埋冷凝后組織與包埋石蠟分離，特別是在冷天包埋時(shí)，動作更要迅速，否則容易導(dǎo)致組織與石蠟融合不好，影響切片。包埋是時(shí)把組織最大最平切面或所需是病灶切面向下，對皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應(yīng)包含有各層組織。組織包埋完后，要與取材時(shí)記錄的組織形狀和數(shù)量核對，發(fā)現(xiàn)問題，及時(shí)解決。6. 切片要薄:切片首要任務(wù)是把切片刀研磨鋒利，這是能否切薄而平整切片的關(guān)鍵。其次要把刀架上的切

7、片清除角調(diào)至25度，在此角范圍內(nèi)，才能切出良好蠟片。如使用一次性刀片，可轉(zhuǎn)動刀座上的弧形刻度盤選取最合適的刻度(該合適刻度并不等于真正的切片清除角)。切片前要把切片機(jī)上有關(guān)的各螺旋擰緊，如沒有擰緊或包埋少組織蠟塊過硬時(shí)就會出現(xiàn)跳片，使蠟片成一截厚一截薄。切片的厚度應(yīng)為34m，對一些組織如淋巴結(jié)、鼻咽和扁桃體，切片的厚度應(yīng)為23m 。7。貼片烤片：切出的蠟片應(yīng)放在恒溫貼片盆內(nèi)展開，并根據(jù)所用包埋石蠟的溫度調(diào)節(jié)水溫在4246度左右。為了利于展平蠟片，可先把蠟片放在一缸缸約1015%乙醇內(nèi)，然后用玻片再將蠟片移至恒溫貼片盆，由于水的表面張力比乙醇大，蠟片由乙醇移至水后就很容易展平。貼片時(shí)再

8、注意“定點(diǎn)”和“定向”。最后即可置入約6065度的烤片箱內(nèi)烤1530分鐘，也可放在熱板上烘干，蠟片就可牢固地粘附在載玻片或蓋玻片上。8 切片在染色前必須脫蠟干凈：未完全脫蠟的組織切片，染色后組織和細(xì)胞模糊不清。脫蠟要用兩級或三級脫蠟劑如二甲苯，時(shí)間為1020分鐘，應(yīng)視所用二甲苯的新舊以及室溫情況而定。脫蠟時(shí)間寧可長些，不應(yīng)過短。9. 蘇木素染液一定要配好:蘇木素液配制的好壞，決定染色的優(yōu)劣。蘇木素配制有多種配方，關(guān)鍵在于氧化。如加氧化汞作氧化劑時(shí)，要防止氧化過度，同時(shí)注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸鈉作氧化劑時(shí)，就無需把蘇木素液煮沸。要配制自然成熟的蘇木素則不需加氧化劑，但

9、要較長時(shí)間才能氧化成熟。不同蘇木素染液的染色時(shí)間為520分鐘，自然氧化成熟的蘇木素液染色時(shí)間可以更長。*蘇木素染液的配制(1) Harrys蘇木素蘇木素 1g無水酒精 10ml硫酸鋁鉀 20g蒸餾水 200ml氧化汞 0.5g冰醋酸 8ml分別用無水酒精溶解蘇木素，蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，然后兩液混合并煮沸，加入氧化汞，繼續(xù)加熱和攪拌至溶液為深紫色，立即冷卻，恢復(fù)至室溫后過濾備用。(2) 改良Lillie-Mayers蘇木素蘇木素 2.5g無水酒精 20ml硫酸鋁鉀 5g蒸餾水

10、0;330ml碘酸鈉 250mg甘油 150ml冰醋酸 10ml分別用無水酒精溶解蘇木素，蒸餾水溶解硫酸鋁鉀，然后兩液混合后，依次加入碘酸鈉、甘油和冰醋酸。(3) Mayers蘇木素蘇木素 100mg蒸餾水 100ml碘酸鈉 20mg硫酸鋁銨 5g檸檬酸 100ml水合氯醛 5g用蒸餾水溶解蘇木素后，依次加入碘酸鈉、硫酸鋁銨和水合氯醛，過濾后備用。10掌握好鹽酸酒精的分化：這是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。分化時(shí)間的長短視組織的性質(zhì)，切片的厚薄，蘇木素染色的深淺來決定，一般是12秒，若切片不分化或分化不足，組織

11、著色過深使核漿的景界不清楚；若分化過度，胞核過淡不清晰 。用Mayers蘇木素染色，通常都不分化。鹽酸酒精分化后，切片留有酸液，易使切片褪色。另一方面蘇木素經(jīng)流水沖洗來促蘭。流水沖洗一般需1530分鐘。如要說短時(shí)間，可用堿性的促藍(lán)液代替流水沖洗。*鹽酸-酒精分化液的配制濃鹽酸 1 ml70%酒精 99ml*促藍(lán)液的配制 （1） Scott促藍(lán)液重碳酸鈉 0.35g硫酸鎂 2g蒸餾水 100ml麝香草酚少量 (2 ) 氫氧化氨水溶液濃氨水 0.11ml 蒸餾

12、水 99ml(4) 碳酸鋰水溶液碳酸鋰 1g蒸餾水 100ml11.曙紅染色要適宜: 曙紅是作為對比染色，染色時(shí)不應(yīng)染的太紅，也不能染得太淡，否則紅蘭對比不鮮明。每200ml曙紅水溶液加一滴冰醋酸可起促染作用，如加酸太多，可使曙紅沉淀而慢慢失效。曙紅水溶液易發(fā)霉，每缸曙紅液加入甲醛液12滴有防霉作用。*曙紅液的配制（1）0. 250.5%曙紅Y水溶液曙紅Y 0.250.5g 蒸餾水 100ml冰醋酸 1滴(2)0.5曙紅Y氯化鈣水溶液曙紅Y 0.5g 蒸餾水 100

13、ml無水氯化鈣 0.5g (3)0.250.5%曙紅Y酒精溶液曙紅Y 0.250.5g 80%酒精 100ml切片脫水透明要徹底：染色后，要徹底脫水透明，才能進(jìn)行樹膠封蓋，成為永久標(biāo)本。如果脫水透明不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下模糊不清，過一段時(shí)間染片就褪色。脫水要經(jīng)過多次無水乙醇，也可使用石炭酸二甲苯進(jìn)行脫水。如采用后者，染片要經(jīng)過多次二甲苯以除去石炭酸。*石炭酸二甲苯混合液的配制石炭酸(加熱到約60度) 1份二甲苯 3份13.封膠要求中性，濃度適宜: 酸性的樹膠可使胞核褪色，如樹膠放置時(shí)間過長，因氧化而變酸。國

14、產(chǎn)樹膠偏酸，易使切片褪色。樹膠過濃，封片時(shí)容易導(dǎo)致氣泡，樹膠過稀，封片時(shí)使膠外溢，影響美觀。14. 在整個(gè)染色過程中不讓切片干涸: 切片完全干涸，會使組織收縮、割裂，形成所謂”龜裂”現(xiàn)象。也會使部分細(xì)胞核透明不良，看起來像黑色的細(xì)胞核。完成染色后，每張片子要在顯微鏡下觀察，檢查制片過程中有沒有發(fā)生差錯(cuò)。不好的片子不交給醫(yī)生。* HE切片的質(zhì)量要求一張高質(zhì)量的HE切片要做到:1. 切片完整、貼片恰當(dāng)2. 切片較薄而均勻3. 無皺折4. 無刀痕5. 染色清晰、核漿分明、透明度好6. 無固縮、龜裂、污染7.&#

15、160;封膠適當(dāng)、玻片清潔8. 字體端正、號碼清楚五、組織化學(xué)技術(shù)操作規(guī)范組織化學(xué)技術(shù)制片與一般的制片基本相同，但在操作上有其特殊的要求。（一） 組織化學(xué)技術(shù)對組織細(xì)胞前處理的要求1. 組織切片方法根據(jù)所檢測物質(zhì)的性質(zhì)及所采用的染色方法，組織切片分為冷凍切片和石蠟切片(培養(yǎng)的細(xì)胞也可分為細(xì)胞涂片、細(xì)胞冷凍切片和細(xì)胞石蠟切片)。在冷凍切片中，組織細(xì)胞的各種成份丟失最少，但形態(tài)結(jié)構(gòu)差，可溶性物質(zhì)彌散；石蠟切片中組織細(xì)胞的許多特殊物質(zhì)減少甚至丟失，酶活性降低甚至失去活性，但形態(tài)結(jié)構(gòu)好，所需顯示的物質(zhì)定位清晰。2 組織的固定無論用于冷凍切片的組織，取材越新鮮越好

16、，以保持生物體的原狀，使細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成份盡可能保存下來。組織取材后應(yīng)立即進(jìn)行冷凍切片，切片可于-20度或-80度保存。若作石蠟切片，組織取材后即進(jìn)行固定，因所檢測的物質(zhì)不同選用不同的固定液及固定時(shí)間。最常用的固定方法是用固定液浸泡組織。固定液有多種，不同的固定液具有不同的作用，至今還沒有一種固定液能用于所有染色的組織固定，最常用、用途最廣的是甲醛液。欲保存固定肝糖原則不能用甲醛固定液，需要用酒精固定液，如，Gender或Cranky氏固定液。在組織固定過程中，不能溶解細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)，使所顯示的物質(zhì)不會出現(xiàn)移位現(xiàn)象，定位準(zhǔn)確。如用酒精性固定液固定肝糖原，會將糖原顆粒推向細(xì)胞的一邊，稱為“極化現(xiàn)

17、象”，屬于一種人為改變，對定位有影響，在觀察時(shí)應(yīng)注意。（二） 組織化學(xué)染色方法的基本要求1 組織化學(xué)染色方法要有較高的特異性，能特異地顯示所需要觀察的物質(zhì)組織化學(xué)染色與常規(guī)HE染色不同，每種組化反應(yīng)都需要某種特殊的染料、試劑或底物，需要一定的染色時(shí)間和PH環(huán)境，使該反應(yīng)對所顯示的物質(zhì)具有一定的專屬性。如顯示糖原需用Schiff無色品紅試劑；顯示鐵離子應(yīng)用亞鐵氰化鉀和鹽酸；顯示堿性磷酸酶需用-甘油磷酸鈉作底物，PH9.4的環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)。在染色的操作過程中，應(yīng)采用已知含有或不含有所顯示的物質(zhì)的標(biāo)本進(jìn)行陽性和陰性對照，以證實(shí)該方法的特異性和操作的準(zhǔn)確性。如顯示堿性磷酸酶，可用正

18、常的腎組織進(jìn)行對照，腎皮質(zhì)堿性磷酸酶應(yīng)為陽性為髓質(zhì)應(yīng)為陰性。也可用抑制劑和消除法進(jìn)行陰性對照。如在孵育液中加入0.01mol/L的氟化鈉可抑制酸性磷酸酶的活性，染色結(jié)果則為陰性，在糖原染色前，用淀粉酶消化對照的組織切片，則對照片糖原染色為陰性。2 組織化學(xué)染色方法要具有一定敏感性，方法越是敏感，越能檢測組織細(xì)胞中含量少的物質(zhì)。3 組織化學(xué)染色在組織或細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物必須具有一定的顏色，該顏色越鮮艷、越深越好。顯示一種物質(zhì)可有不同的染色方法，陽性反應(yīng)有不同的顏色，選用的方法應(yīng)使陽性物顏色鮮艷，深色，而復(fù)染的底色要淺淡，這樣對比才清晰，易于觀察及照相。4 組織化

19、學(xué)染色最后顯示出來的物質(zhì)要具有穩(wěn)定性，盡可能不被制片過程中所用的化學(xué)試劑所影響。在染色過程中，避免使用減弱、破壞或溶解陽性物的試劑。如，著染蘇丹的脂肪要用水溶性膠封片，不能經(jīng)二甲苯透明和中性樹膠封片。組織化學(xué)技術(shù)的某些方法還存在著不能完善的地方，如要保持較好的組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，使被檢測的物質(zhì)定位準(zhǔn)確，則需要用石蠟切片染色，但組織在制作石蠟切片的固定、脫水和包埋過程中，被檢測的物質(zhì)會受到破壞甚至消失。如在石蠟切片中，腎組織的酸性磷酸酶活性僅保留20%；心肌的琥珀酸脫氫酶則全部失去活性。在肝糖原染色中用10%甲醛液固定肝組織可使肝糖原完全溶解消失，改用酒精性固定液可保存肝糖原，但由于固定液滲透作用

20、，使肝糖原顆粒出現(xiàn)移位“極化現(xiàn)象”。用冷凍切片可保存大量的酶，糖原丟失極少，又不會出現(xiàn)“極化現(xiàn)象”，但組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及陽性物質(zhì)定位較差。此外，冷凍切片容易出現(xiàn)冰晶，破壞原有的組織結(jié)構(gòu)，影響觀察。有些存在于組織細(xì)胞中的化學(xué)物質(zhì)較為復(fù)雜，往往需要用多種染色方法來進(jìn)行鑒別，如用AB（PH2.5）法可顯示一般的粘液；要區(qū)分中性和酸性粘液需要用AB-PAS染色法；酸性粘液中要區(qū)分硫酸粘液和唾液酸粘液要用HID-AB染色法。六、 免疫組織化學(xué)技術(shù)操作規(guī)范（一） 組織切片的要求免疫組織化學(xué)技術(shù)適用于冷凍切片和石蠟切片，部分抗體只能用于冷凍切片，大部分抗體可用于石蠟切片，適用于石蠟切片也適用

21、于冷凍切片。冷凍切片能很好地保存組織抗原，抗原丟失少，但形態(tài)結(jié)構(gòu)差，定位不很清晰；石蠟切片組織形態(tài)結(jié)構(gòu)好，定位清晰，但在組織的固定脫水包埋過程中容易破壞組織抗原，使抗原的免疫活性有所降低。（二） 組織的固定組織經(jīng)過固定可保存組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織抗原彌散，常用的固定液為10%甲醛液，最好選用10%中性甲醛液，國定時(shí)間為46小時(shí)。固定時(shí)間不足，組織結(jié)構(gòu)不佳，組織抗原彌散；固定時(shí)間過長，可封閉或破壞組織抗原。（三） 載玻片的處理組織切片貼在載玻片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，由于染色工程操作步驟及沖洗次數(shù)較多，容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，因此將載玻片涂膠或硅化是必要的。較常用較好的是采用

22、硅化玻片。硅化玻片的制備：1 載玻片經(jīng)酸洗沖洗干凈后烤干；2 2%APES水溶液浸12min；3 蒸餾水浸洗12min；4 烤干備用。*APES(3-MINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷 SIGMA產(chǎn)品(四)組織切片前處理經(jīng)甲醛液固定，石蠟包埋的組織在固定過程中，組織中的抗原蛋白與甲醛產(chǎn)生交聯(lián)，使得組織中抗原的決定簇被封閉，抗體難以和抗原充分結(jié)合。因此要進(jìn)行組織切片前處理，目的是打開組織抗原蛋白與甲醛的交聯(lián)，暴露組織抗原，以提高組織抗原的檢出率。組織切片前處理(也稱抗原修復(fù))常用的主要有以下方法:

23、1 胰蛋白酶消化將切片置入胰蛋白酶消化液 (0.2%胰蛋白酶 0.1%氯化鈣水溶液 PH7.8 ) 消化30分鐘，37。2 微波加熱將切片置入0.01mol/L pH6.0的檸檬酸緩沖液內(nèi)，用微波爐最大功率加熱10分鐘，自然冷卻。3 高壓鍋加熱法用高壓鍋加熱0.01mol/L pH6.0的檸檬酸緩沖液至沸騰，放入切片，蓋緊高壓鍋蓋，繼續(xù)加熱至減壓閥噴氣，計(jì)時(shí)90秒鐘至2分鐘，自然冷卻。是否進(jìn)行切片前處理要按第一抗原說明書的要求，切片前處理通?？梢蕴岣呙庖呓M化染色的陽性率，但并非所有的抗體染色均需

24、要前處理。(五)內(nèi)源性過氧化物酶的消除組織中的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及紅細(xì)胞等存在內(nèi)源性過氧化物酶消除，方法是用3%過氧化氫作用15分鐘。(六)酶標(biāo)抗體系統(tǒng)中的酶與顯色劑在LSAB等常用免疫組化方法中，與抗體連接的酶主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶(AP 或AKP), 顯色劑有DAB、AEC、固紅和固藍(lán)等。在HRP系統(tǒng)用DAB和AEC等作顯色劑，DAB顯色陽性物呈棕色，AEC呈紅色；AP系統(tǒng)用固紅和固藍(lán)作顯色劑，固紅顯色陽性物呈紅色，而固藍(lán)呈藍(lán)色。DAB顯色形成的沉淀物最穩(wěn)定和不易褪色，較為常用，用其是致癌物，故要避免接觸皮膚和污染環(huán)境。(七)實(shí)驗(yàn)對照為證實(shí)抗體和檢測試劑盒效價(jià)是

25、否可靠，染色操作是否正確，一般需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對照，以避免試劑失效或操作失當(dāng)而出現(xiàn)假陰性和假陽性，確保染色結(jié)果的可靠性。1陽性對照:選用已知染色中度陽性以上的組織切片染色，陽性切片應(yīng)呈陽性，此外組織中的內(nèi)對照也是很好的陽性對照。初學(xué)者應(yīng)設(shè)陽性對照。2陰性對照:選用已知染色陰性的組織切片染色，其結(jié)果應(yīng)為陰性，一般來說，陰性對照和陽性對照同時(shí)進(jìn)行，或其中有陽性染色結(jié)果時(shí)才有意義。(八)抗體的保存和稀釋抗體應(yīng)于低溫保存，第一抗體可分成少包裝于-20度保存，使用時(shí)存放在4度，不宜反復(fù)存放于4度和-20度之間。檢測試劑盒一般存放于4度，不宜于-20度保存，如長時(shí)間不用可存放于-20度，解凍使用后則不能再存放

26、于0度以下，因?yàn)榉磸?fù)凍融使得與抗體結(jié)合的酶容易分解，導(dǎo)致檢測的敏感度降低。濃縮的抗體在染色前應(yīng)根據(jù)說明書要求或自行摸索出的最佳工作濃度進(jìn)行稀釋。日常工作量不多時(shí)，可將抗體稀釋至1:520，染色前再稀釋成工作液。濃縮液抗體保存的時(shí)間較長，反之稀釋后的抗體保存的期限較短，如使用即用型抗體，經(jīng)過一定時(shí)間后應(yīng)注意其效價(jià)時(shí)否有所降低，避免出現(xiàn)假陰性染色?？贵w稀釋液可用0.01mol/L PBS Ph7. 4，在PBS中加入1%BSA和1%正常稀釋后的稀釋抗體，對減輕非特異性背景染色有所幫助。（九）染色結(jié)果的觀察1陽性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞中相應(yīng)的部位，在細(xì)胞膜表達(dá)的抗原陽性結(jié)果應(yīng)

27、定位在細(xì)胞膜上，在其他部位的陽性反應(yīng)均為非特異性染色。不當(dāng)?shù)目乖迯?fù)會導(dǎo)致抗原在組織細(xì)胞中定位的改變。根據(jù)所檢測抗原的不同，抗原分別定位在：（1）細(xì)胞膜，如LCA和UCHL1等；（2）細(xì)胞質(zhì)，如Keratin 和Lysozyme等；（3）細(xì)胞核，如PCNA和ER等。2組織的周邊、刀痕、皺折等部位往往呈陽性表達(dá)，但絕大多數(shù)都是非特異性染色。3染色結(jié)果呈陰性并非都是抗原不表達(dá)，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關(guān)。4組織切片背景深與下列因素有關(guān)：（1）第一抗體濃度太高或孵育時(shí)間過長，溫度過高。（2）顯色劑DAB濃度過高或H2O2太多。（3）正常血清封閉之后、滴加第一抗體之前用了PBS洗。

28、（4）抗體純度不高、（5）抗體孵育切片后洗不干凈。（十）免疫組織化學(xué)染色后的復(fù)染背景免疫組織化學(xué)染色后需要復(fù)染細(xì)胞核，以將組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示出來，使免疫組織化學(xué)染色結(jié)果定位清晰。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果根據(jù)顯色劑的不同而不同，有棕色、藍(lán)色和紅色，復(fù)染細(xì)胞核的顏色也因染液不同而不同，一般有勞色（蘇木素）、綠色（甲基綠）和紅色（核固紅）三種。應(yīng)根據(jù)顏色對比清晰的原則進(jìn)行搭配，常用的是DAB顯色呈棕色Mayers蘇木素復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色。（十一）染色操作注意事項(xiàng)1第一抗體分為單克隆（鼠抗）和多克?。ㄍ每梗┛贵w，檢測試劑盒中的第二抗體也有分為抗鼠和抗兔抗體，不能連接錯(cuò)，否則一抗、二抗連接不上而導(dǎo)致假陰性的染色

29、結(jié)果。最好比選用即是抗鼠又是抗兔的抗體。2抗體孵育時(shí)間隨孵育溫度升高而減少，但一般不超過37度、如果不是由于診斷急于發(fā)報(bào)告，一般一抗置于4度孵育過夜較佳。3用于一種染色方法，因檢測試劑盒的不同其敏感性不同，第一抗體的稀釋度也不同。免疫組織化學(xué)技術(shù)制片的規(guī)范和質(zhì)量控制  中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 梁英杰隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)在組織學(xué)研究和病理診斷尤其是在腫瘤鑒別診斷的應(yīng)用越來越廣泛。科學(xué)地規(guī)范免疫組化技術(shù)的操作對保證免疫組化制片質(zhì)量，提高臨床病理診斷水平，促進(jìn)病理學(xué)研究工作的發(fā)展有著重要的意義。影響免疫組化染色結(jié)果的因素很多，除了免疫組化染色操作

30、因素外，還包括組織切片制備各個(gè)環(huán)節(jié)的因素。因此，免疫組化技術(shù)的操作規(guī)范也要包括組織切片技術(shù)的規(guī)范。一、免疫組織化學(xué)技術(shù)對組織切片的要求免疫組織化學(xué)技術(shù)適用于冰凍切片和石蠟切片，部分抗體只能用于冰凍切片，大部分抗體可用于石蠟切片，適用于石蠟切片的抗體也適用于冰凍切片。冰凍切片能很好地保存組織抗原，抗原丟失少，但形態(tài)結(jié)構(gòu)差，定位不很清晰；石蠟切片組織形態(tài)結(jié)構(gòu)好，定位清晰，但在組織的固定、脫水、包埋等過程中容易破壞組織抗原，使抗原的免疫活性有所降低。因此在檢測石蠟切片組織抗原時(shí)，盡可能保存組織抗原的免疫活性十分重要。二、組織的固定 組織離體以后應(yīng)及時(shí)取材固定，組織經(jīng)過固定后可保存組織原有的

31、形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織抗原彌散。常用的固定液為10 福爾馬林液(4%甲醛液)，最好選用10中性福爾馬林液，固定時(shí)間為4-6小時(shí)，一般不超過24小時(shí)。固定時(shí)間不足，組織結(jié)構(gòu)不佳，組織抗原彌散；固定時(shí)間過長，可封閉或破壞組織抗原。冰凍切片常用的固定液為無水丙酮或4%多聚甲醛，固定時(shí)間為10-20min。三、載玻片的處理組織切片貼在載玻片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，由于染色過程操作步驟及沖洗次數(shù)較多，容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，因此將載玻片涂膠或硅化是必要的。較常用效果較好的是硅化玻片。硅化玻片的制備：1. 載玻片經(jīng)酸洗，沖洗干凈后烤干。2. 2APES丙酮溶液浸1-2min。3.

32、60;無水丙酮液浸1-2min。3. 蒸餾水浸洗1-2min。4. 烤干備用?？捎脽o水酒精代替無水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。 APES(3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷 SIGMA產(chǎn)品。四、組織切片前處理經(jīng)福爾馬林溶液固定，石蠟包埋的組織在固定過程中，組織中的抗原蛋白與甲醛產(chǎn)生交聯(lián)，使得組織中抗原的決定簇被封閉，抗體難以和抗原充分結(jié)合。因此要進(jìn)行組織切片前處理，目的是打開組織抗原蛋白與甲醛的交聯(lián)，暴露組織抗原，以提高組織抗原的檢出率。組織切片前處理（也稱抗原修復(fù)）常用的方法主要有：1

33、. 胰蛋白酶消化法將切片置入胰蛋白酶消化液（0.1胰蛋白酶 0.1氯化鈣水溶液 pH7.8）消化30分鐘，37。2. 水煮法將切片置入蒸餾水內(nèi)，加熱至沸騰持續(xù)10分鐘，自然冷卻。3.微波加熱法常規(guī)是將切片置入0.01mol/L pH6.0的檸檬酸緩沖液內(nèi)，用微波爐最大功率（約800W）加熱10分鐘，自然冷卻。4. 高壓加熱法用高壓鍋加熱0.01mol/L pH6.0的檸檬酸緩沖液至沸騰，放入切片，蓋緊高壓鍋蓋，繼續(xù)加熱至減壓閥噴氣，計(jì)時(shí)90秒鐘至2分鐘，自然冷卻。5.聯(lián)合處理法按上述方法先進(jìn)行胰蛋白酶消化，然后再進(jìn)行水煮法或

34、微波加熱法或高壓加熱法。是否進(jìn)行切片前處理要按第一抗體說明書的要求，切片前處理通?？梢蕴岣呙庖呓M化染色的陽性率，但并非所有的抗體染色均需要前處理。切片前處理不當(dāng)會出現(xiàn)： 假陽性、假陰性或陽性定位改變五、內(nèi)源性過氧化物酶的消除組織中的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及紅血球等存在內(nèi)源性過氧化物酶，可與顯色劑DAB、AEC起反應(yīng)而造成假陽性，因此，在顯色前要把這些內(nèi)源性過氧化物酶消除，方法是用3過氧化氫作用15分鐘。操作可以在加一抗之前也可以在加一抗之后。六、內(nèi)源性生物素的消除組織細(xì)胞中存在著內(nèi)源性生物素，在應(yīng)用與卵白素結(jié)合或生物素標(biāo)記抗體的免疫組化檢測系統(tǒng)檢測組織細(xì)胞中的抗原時(shí)，內(nèi)源性生物素容易與AB

35、C法中的卵白素（avidin）或S-P（LSAB）法中的鏈霉菌抗生物素蛋白(streptavidin)結(jié)合，引起假陽性。因此在加一抗 之前或在加一抗之后需要消除內(nèi)源性生物素。消除內(nèi)源性生物素的方法有：（1）用雞蛋清或卵白素封閉。（2）采用不含卵白素或生物素的免疫組化檢測系統(tǒng)檢測如Envision/Elivision二步法和EPOS一步法等。七、高敏感免疫組化染色方法的選用免疫組織化學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)之一是敏感性高，就是能把抗原抗體結(jié)合物特異性地放大。目前，免疫組化染色方法有一步法，二步法和三步法。一般來說，抗體與抗體的連接步驟少，特異性高，敏感性低；反之，連接步驟多，特異性低，敏感性高。但

36、是，不同公司生產(chǎn)的試劑盒，技術(shù)由于不斷地改進(jìn)和提高，在特異性和敏感性方面各有特點(diǎn)。各實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的實(shí)際情況對照比較，合理選用。目前應(yīng)用最廣泛的是S-P（LSAB）三步法和Envision/Elivision二步法。同一種染色方法，因檢測試劑盒的不同其敏感性不同，第一抗體的稀釋度也不同。八、第一抗體與免疫組化檢測系統(tǒng)的正確配套常用的第一抗體一般為單克隆（鼠抗）和多克?。ㄍ每梗┛贵w，也有羊抗的抗體。常用檢測試劑盒中的第二抗體也有分為抗鼠、抗兔或抗羊免疫球蛋白，不能錯(cuò)配，否則一抗、二抗連接不上而導(dǎo)致假陰性的染色結(jié)果。最好選用既含抗鼠又含抗兔和抗羊免疫球蛋白的抗體。九、酶標(biāo)抗體系統(tǒng)中的酶與顯色劑

37、的合理選用在S-P等常用免疫組化方法中，標(biāo)記抗體的酶主要有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP或AKP)，顯色劑有DAB、AEC、固紅和固藍(lán)等。在HRP系統(tǒng)用DAB和AEC作顯色劑，DAB顯色陽性物呈棕色，AEC呈紅色；AP系統(tǒng)用固紅、固藍(lán)或BCIP/NBT作顯色劑，固紅顯色陽性物呈紅色，而固藍(lán)、BCIP/NBT呈藍(lán)色。DAB顯色形成的沉淀物最穩(wěn)定和不易褪色，較為常用，因其是致癌物，故要避免接觸皮膚和污染環(huán)境。在多重免疫組化染色中，合理選用酶標(biāo)抗體檢測系統(tǒng)和顯色劑，在同一切片上可以清晰地顯示組織細(xì)胞中多種抗原的表達(dá)。十、實(shí)驗(yàn)對照的設(shè)置為證實(shí)抗體和檢測試劑盒效價(jià)是否可靠，染色操作是否正確，

38、一般需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對照，以避免試劑失效或操作失當(dāng)而出現(xiàn)假陰性和假陽性，確保染色結(jié)果的可靠性。1.陽性對照：選用已知染色中度陽性以上的組織切片染色，陽性切片應(yīng)呈陽性 ，此外組織中的內(nèi)對照也是很好的陽性對照。初學(xué)者更應(yīng)設(shè)陽性對照。2.陰性對照：選用已知染色陰性的組織切片染色，其結(jié)果應(yīng)為陰性，一般來說，陰性對照和陽性對照同時(shí)進(jìn)行，或其中有陽性染色結(jié)果時(shí)才有意義。十一、免疫組織化學(xué)染色后的背景復(fù)染免疫組織化學(xué)技術(shù)的另外一個(gè)特點(diǎn)是抗體在組織中的定位準(zhǔn)確。因此，免疫組織化學(xué)染色后需要復(fù)染細(xì)胞核，以將組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示出來，使免疫組織化學(xué)染色結(jié)果定位清晰。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果根據(jù)顯色劑的不同而不同，有

39、棕色、藍(lán)色和紅色，復(fù)染細(xì)胞核的顏色也因染液不同而不同，一般有藍(lán)色（蘇木素）、綠色（甲基綠）和紅色（核固紅）三種。應(yīng)根據(jù)顏色對比清晰的原則進(jìn)行搭配，常用的是DAB顯色呈棕色，Mayer!/s蘇木素復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色。甲基綠復(fù)染細(xì)胞核，顏色鮮艷，特別適用于顯微照相，但容易腿色。十二、免疫組化染色結(jié)果的觀察1. 陽性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞中相應(yīng)的部位，在細(xì)胞膜表達(dá)的抗原陽性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞膜上，在其他部位的陽性反應(yīng)均為非特異性染色。不當(dāng)?shù)慕M織切片前處理會導(dǎo)致抗原在組織細(xì)胞中定位的改變。根據(jù)所檢測抗原的不同，抗原分別定位在：（1）細(xì)胞膜如LCA和UCHL1等。（2）細(xì)胞漿如Keratin和Lysoz

40、yme等（3）細(xì)胞核如PCNA和ER、PR等2. 不當(dāng)?shù)慕M織切片前處理有可能出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。3. 組織的周邊、刀痕、皺折等部位往往呈陽性反應(yīng)，但絕大多數(shù)都是非特異性染色。4. 染色結(jié)果呈陰性并非都是抗原不表達(dá)，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關(guān)。5. 組織切片背景深與下列因素有關(guān)：(1)第一抗體濃度太高或孵育時(shí)間過長，溫度過高。(2)顯色劑DAB濃度過高或H2O2太多。(3)正常血清封閉之后、滴加第一抗體之前用了PBS洗。(4)抗體純度不高。(5)抗體孵育切片后沖洗不干凈。十三、抗體的保存和稀釋抗體應(yīng)于低溫保存，第一抗體可分成小包裝于-20保

41、存，使用時(shí)存放在4，不宜反復(fù)存放于4和-20之間。檢測試劑盒一般存放于4，不宜于-20保存，如長時(shí)間不用可存放于-20，解凍使用后則不能再存放于0以下，因?yàn)榉磸?fù)凍融使得與抗體結(jié)合的酶容易離解，導(dǎo)致檢測的敏感度降低。濃縮的抗體在染色前應(yīng)根據(jù)說明書要求或自行摸索出的最佳工作濃度進(jìn)行稀釋。日常工作量不多時(shí)，可將抗體稀釋至1:5-20，染色前再稀釋成工作液。濃縮液抗體保存的時(shí)間較長，反之稀釋后的抗體保存的期限較短，如使用即用型抗體，經(jīng)過一定時(shí)間后應(yīng)注意其效價(jià)是否有所降低，避免出現(xiàn)假陰性染色?？贵w稀釋液可用商品化的抗體稀釋液，也可以用0.01mol/L PBS（ pH7.4），在PB

42、S中加入1BSA和10正常血清后稀釋抗體，對減輕非特異性背景染色有所幫助。十四、注意事項(xiàng)1石蠟切片脫蠟要徹底。2抗體孵育時(shí)間隨孵育溫度升高而減少，但一般不超過37；如果不是由于診斷急需，一抗置于4孵育過夜也是一種較佳的選擇。3滴加抗體應(yīng)完全覆蓋組織，避免引起組織邊緣效應(yīng)。病理技術(shù)的發(fā)展與現(xiàn)狀  病理學(xué)技術(shù)包括傳統(tǒng)病理技術(shù)和現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)。傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)（HE切片、特殊染色）是病理學(xué)的基礎(chǔ)，大量應(yīng)用于日常工作中，是提高診斷水平和現(xiàn)代病理技術(shù)的保證?；仡欉^去，病理學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)，無一不是新技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用的結(jié)果。同時(shí)新技術(shù)的應(yīng)用，也受到病理診斷水平和科研能力的制約。病理學(xué)經(jīng)歷了組

43、織病理、超微病理、免疫病理和分子病理階段。免疫病理在很大程度上解決了很多疾病的性質(zhì)和來源，而分子病理學(xué)進(jìn)一步揭示了發(fā)病機(jī)制（特別是病毒學(xué)檢查），預(yù)后以及外源性基因在人體內(nèi)的存在和內(nèi)源性基因的突變和表達(dá)異常，解決了一些用蛋白水平不能解決的問題。目前，我國病理技術(shù)主要還是以常規(guī)HE、特染和免疫組化為主，整體水平不高，處于中等以下水平。我這樣說也許有很多技術(shù)員會有意見。請看一個(gè)數(shù)據(jù)：2004年，中國病理學(xué)工作委員會在全國最具代表性的15家3級甲類大型醫(yī)院病理科，對5個(gè)抗體的免疫組化質(zhì)量進(jìn)行測評，結(jié)果合格的只有3-4家，從一個(gè)側(cè)面反映了中國病理技術(shù)的現(xiàn)狀。而且這4家合格單位的成績還存在很多的水分：第一

44、，所有切片的前處理都是由北京友誼醫(yī)院統(tǒng)一完成的，消除了各家由于固定、脫水、切片、烤片等原因引起的抗原損失的因素；第二，很多單位對這幾張片子都是精心加工的，并不代表平時(shí)的水平。也就是說加上這二條，成績還會更差。要做好一、二張切片并不難，難的是要天天做好片子。那么造成這樣的結(jié)果原因是什么？我想用我自己的經(jīng)驗(yàn)片面的分析一下：一、技術(shù)員的定位中華病理學(xué)會給技術(shù)的定位是在醫(yī)生指導(dǎo)下工作。這里容易給人造成二大誤區(qū)：1、病理診斷與病理技術(shù)是二門完全不同的學(xué)科，對于病理技術(shù)而言，醫(yī)生是外行，技術(shù)員是內(nèi)行，讓外行來指導(dǎo)內(nèi)行，容易讓醫(yī)生錯(cuò)誤的認(rèn)為技術(shù)工作的簡單性。2、容易讓技術(shù)員產(chǎn)生被動性和依賴性。 醫(yī)

45、生說什么我做什么，喪失了主觀能動性創(chuàng)新性。出了問題需要醫(yī)生指出原因才去改。由于很多原因醫(yī)生并不可能真正知道，導(dǎo)致很多問題不能得到正確解決。所以，分工明確，各盡其職，充分發(fā)揮技術(shù)員的主觀能動性是提高技術(shù)水平的關(guān)鍵。醫(yī)生做好醫(yī)生自己的工作，技術(shù)員也應(yīng)該做好自己的工作。出現(xiàn)問題，做醫(yī)生的只要指出自己需要什么，或者出了什么問題，至于問題的原因和解決的辦法，就應(yīng)該讓技術(shù)員自己的解決。只有這樣，才能培養(yǎng)技術(shù)員的獨(dú)立思考能力和解決問題的能力，才能提高技術(shù)員的業(yè)務(wù)水平，才會讓技術(shù)員覺得知識的重要性以及享受到解決問題的喜悅，才會領(lǐng)悟到工作的意義。二、技術(shù)員本身的原因：1） 技術(shù)員隊(duì)伍整體素質(zhì)不高，學(xué)歷

46、偏低。大多數(shù)病理科技術(shù)員都是中專畢業(yè)，也有的是工人轉(zhuǎn)的，有的是護(hù)士轉(zhuǎn)的。我也反對唯學(xué)歷論，學(xué)歷并不能代表一個(gè)人真正的能力，但在大多數(shù)情況下，學(xué)歷還是能力的體現(xiàn)。經(jīng)歷了大學(xué)或研究生的培養(yǎng)學(xué)習(xí)，他們的知識面和考慮問題的思路都是不一樣的。而低學(xué)歷的人要學(xué)超過他們，需付出更多的努力才能達(dá)到。2）在主觀上不求上進(jìn)者甚多，我這樣說會引起技術(shù)員的公憤，但事實(shí)的確如此，看一下自己周圍：沒有理想，不思改進(jìn)，做一天算一天，已是很多技術(shù)員的通病。這就和我們的體制有關(guān)，只有通過崗位競聘，才會讓技術(shù)員認(rèn)識到問題的嚴(yán)重性。能上網(wǎng)關(guān)心技術(shù)的，都是好學(xué)的朋友，對整個(gè)技術(shù)隊(duì)伍來說，還是極少數(shù)。3）缺少正規(guī)的培養(yǎng)和學(xué)習(xí)的機(jī)會，很

47、多技術(shù)員的技術(shù)都是師傅帶徒弟式的方法教的，也有的自學(xué)了；有的盡管出去進(jìn)修了，但學(xué)回來的并不一定是正確的，就是正確的，也要和自己科里的實(shí)際情況相結(jié)合，作出相應(yīng)的調(diào)整，才能真正做好。還有就是缺少相互交流的機(jī)會，有關(guān)技術(shù)的會議較少，技術(shù)員出來開會的機(jī)會就更少。4） 缺少橫向比較：我到過很多片子做的很差的單位，我發(fā)現(xiàn)醫(yī)生、技術(shù)員的自我感覺都很好，認(rèn)為自己做的很不錯(cuò)，對“好”沒有概念，如果不知道別人做的怎么樣，那么對切片質(zhì)量就沒有一個(gè)正確的認(rèn)識。有的人出去學(xué)習(xí)，走馬觀花，覺得沒什么好學(xué)的，別人做的和自己沒什么不一樣。諸不知每一個(gè)人的動作都有差異，正因?yàn)檫@些細(xì)微的差異，導(dǎo)致了每個(gè)人切片質(zhì)量的不一

48、樣。還有一些技術(shù)員，把一些不規(guī)范的甚至是錯(cuò)誤的東西當(dāng)成了經(jīng)驗(yàn)來宣傳、使用和推廣。5）不能正確擺正自己的位置。程天民院士曾經(jīng)說過，診斷與技術(shù)是二個(gè)輪子，缺一不可，互為依存。這話有一定的道理的，但我認(rèn)為不夠確切，容易讓人主次不分，醫(yī)生與技術(shù)員的風(fēng)險(xiǎn)與價(jià)值是不能等同的。有的技術(shù)員什么事情都要和醫(yī)生比，當(dāng)二者出現(xiàn)差異后，醫(yī)技關(guān)系就開始緊張，有的就和醫(yī)生頂著干，有的自暴自棄，有的甚至目空無人，孤芳自賞。我覺的任何事物都有主次，紅花總要綠葉配，沒有綠葉的紅花會怎么樣？但不能說綠葉重要就可以做紅花。病理科也是一樣，醫(yī)生是主角，技術(shù)員是配角，技術(shù)員就是要配合醫(yī)生做好工作，你既然干了技術(shù)這個(gè)工作，就應(yīng)該有這樣的

49、思想準(zhǔn)備，應(yīng)該正確的面對現(xiàn)實(shí)。病人來看病，總是沖著醫(yī)生的診斷水平來的，不會因?yàn)槟愕钠幼龅煤脹_著你來。我覺得病理科更像一輛列車，主任是車頭，醫(yī)生是車廂，技術(shù)員就像輪子。技術(shù)是決定火車額定速度的動力，病理診斷就是司機(jī)，火車的好壞，動力的大小，最終要通過火車跑的怎么樣來表現(xiàn)出來。最終火車開的好不好，還要靠所有部件的齊心協(xié)力才行。5） 技術(shù)員的地位常聽技術(shù)員說現(xiàn)在技術(shù)員的地位越來越低了，于是就感到技術(shù)工作沒前途。我想這有二方面的因素，第一，你的工作有沒做好。第二，隨著社會的發(fā)展，改革的深入，對知識重視，醫(yī)生與技術(shù)員之間的差異會增大，我想這是正常的，我們不是整天叫中國要尊重知識嗎，不能因?yàn)閷?/p>

50、自己不利就不滿意了，我們只有服從這個(gè)社會，而不能叫社會服從我們。人與人，工作與工作之間由于機(jī)遇不同，工作性質(zhì)不同，地位與待遇也就不同，沒必要比來比去。如果你不用心去做事，任何一個(gè)好工作對你來說都沒有好前途。只要你把本職工作做好了，別人都會尊重你。在國外，有的國家的病理科技術(shù)員要比醫(yī)生早上班4 - 5個(gè)多小時(shí)（凌晨4點(diǎn)多），也就是說在醫(yī)生到科前，你就要把昨天取材的組織做好，放在他的桌上。我想遲早，中國也會走上這條路。我想每一人都應(yīng)該有這樣的觀念：工作不僅是一項(xiàng)事業(yè)，也是一種謀生的手段，敬業(yè)，是為了更好的保住自己的飯碗。那么，技術(shù)員的地位就不可以提高了嗎？不是。提高地位靠什么，

51、靠呼吁？同情？對抗？都沒有用。事物發(fā)展都有它內(nèi)在的規(guī)律，只有從根本上去解決決定技術(shù)員地位的東西。那就是提高技術(shù)的知識含量，提高技術(shù)的完成質(zhì)量。三、醫(yī)生與技術(shù)的關(guān)系：1、很多人會說，技術(shù)員工作做的不好，和醫(yī)生沒什么關(guān)系，其實(shí)不然。最簡單的如取材，如果醫(yī)生取材厚薄不均，組織就處理不好，HE切片和免疫組化質(zhì)量都會有影響。技術(shù)員片子做的不好，醫(yī)生可以退片，要求重切，這是我們技術(shù)員應(yīng)該做的；但是，如果醫(yī)生取材不好，技術(shù)員要退組織，大多數(shù)醫(yī)生是不會同意的。這里就存在一個(gè)不合理的現(xiàn)象。還有的醫(yī)生提出取材不好，技術(shù)員可以自己去修一下，我不同意這樣的做法，一是技術(shù)員有可能修去你需要的病變，這個(gè)責(zé)任誰負(fù)，這是一種

52、醫(yī)療事故，是對病人的不負(fù)責(zé)；二是作為醫(yī)生你應(yīng)該做好你自己的本職工作。2、醫(yī)生工作和學(xué)習(xí)的態(tài)度，在很大程度上影響著技術(shù)員，醫(yī)生不喜歡學(xué)習(xí)，技術(shù)員一般也不會學(xué)習(xí)。前面我說過新技術(shù)的應(yīng)用，會受到病理診斷水平和科研能力的制約。如果醫(yī)生什么都不懂，什么工作都不開展，技術(shù)員的業(yè)務(wù)水平也無法提高。我就碰到有的主任自己不會看特染，不懂免疫組化，卻說是技術(shù)員沒做好。真是比竇娥還冤，因?yàn)槟氵B申辯的地方都沒有，甚至有的還真以為自己就是這么差，在這樣的工作環(huán)境下，很多技術(shù)員會逐漸喪失了自信。3、將就。很多醫(yī)生不管技術(shù)員切片做的多差，能將就的就將就，造就了技術(shù)員的惰性，我認(rèn)為這是對病人的不負(fù)責(zé)，對技術(shù)員的不負(fù)責(zé)，也是對

53、自己不負(fù)責(zé)。4、看不起技術(shù)。這樣的病理醫(yī)生其實(shí)很多，認(rèn)為技術(shù)員只是操作工，培養(yǎng)個(gè)2-3個(gè)月就可以做得很好（當(dāng)然這很大程度也是我們技術(shù)員自己造成的，技術(shù)水平越差，醫(yī)生就越看不起，你越看不起，我就越差，是一種惡性循環(huán)）。技術(shù)工作我認(rèn)為有點(diǎn)象燒菜的，每個(gè)家庭都會燒。但是同樣的配方，同樣的油、鹽、醬、醋、味精，每人做出的味道就是不一樣。做菜的也分將就型的、主婦型的、廚師型的、特級廚師型的。什么是廚師？廚師不僅對色、香、味、各種菜系、營養(yǎng)的搭配有研究，找出存在的問題和解決的方法，不斷地吸收新的知識，還要有創(chuàng)新的能力。目前我們大多數(shù)的技術(shù)員（包括我自己）只是涉及到病理技術(shù)的一小部分，只學(xué)了一點(diǎn)點(diǎn)皮毛，要學(xué)

54、好技術(shù)，還有很長的一段路要走。重視技術(shù)，提高技術(shù)水平，可以減少診斷的差錯(cuò)，最終受益的是我們的醫(yī)生和病人。2、其他原因：1）有科研能力的與沒科研能力的病理科之間的差異）大醫(yī)院與小醫(yī)院之間的差異3）經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)與落后地區(qū)的差異如何解決這些問題：1、首先技術(shù)員要正確認(rèn)識自己，擺正自己的位置，要自尊，自強(qiáng)，自愛！增強(qiáng)技術(shù)員的自信心，要相信自己能做到，能做的最好。2、多學(xué)習(xí)理論知識，多向同行學(xué)習(xí)，學(xué)會總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，學(xué)會理論與實(shí)際相結(jié)合，學(xué)會用腦干活。3、科學(xué)的管理和規(guī)范化操作，是解決質(zhì)量問題的關(guān)鍵。病理技術(shù)很多是憑經(jīng)驗(yàn)工作，由于經(jīng)驗(yàn)的隨意性較大，導(dǎo)致質(zhì)量的不穩(wěn)定性。和國際接軌，是我們的奮斗目標(biāo)，在這背景下，

55、中華病理學(xué)會提出了病理技術(shù)規(guī)范化操作。病理技術(shù)有很多小竅門，有的是在犧牲制片質(zhì)量的前提下發(fā)明的，使用者往往自己不知道。每個(gè)地方操作方法不同，導(dǎo)致制片質(zhì)量各不相同。規(guī)范化操作是病理制片質(zhì)量的保證，而量化的管理增加了病理制片質(zhì)量的穩(wěn)定性。所謂規(guī)范化，就是在操作過程中，對使用試劑種類、pH值、濃度、溫度、時(shí)間以及操作的手法都有詳細(xì)的規(guī)定，盡可能的減少人為的影響，減少變量，減少影響制片質(zhì)量的條件。特別是在做分子技術(shù)時(shí)，更應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)則做。所謂量化，就是把以前經(jīng)驗(yàn)的東西用量來判定。比如說我們更換脫水試劑，一般都是要等組織不好切了才換，這樣總有幾天片子質(zhì)量不好；也有的是幾天到了就換，組織多時(shí)脫水液的水份

56、就多，后面幾天可能組織就脫不好；組織少了脫水液倒了很浪費(fèi)，我們通過幾年的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)組織的量和試劑的更換時(shí)間有一定的規(guī)律，用量來控制脫水的更換時(shí)間更具科學(xué)性。還有蘇木素、依紅也是如此。要想搞好制片質(zhì)量，各地必須建立質(zhì)控組織，通過技術(shù)交流和行政監(jiān)督的手段，促進(jìn)病理技術(shù)的發(fā)展，做好每一步。例如常規(guī)切片的注意事項(xiàng)：1 . 取材取材的好壞，直接影響切片的質(zhì)量。醫(yī)生在取材時(shí)，首先要有一把鋒利的取材刀，在切割組織時(shí)要避免取材刀來回拖拉，切取的組織塊厚薄要均勻，一般厚度以0.2 0.3cm為適，較容易發(fā)脆的組織如甲狀腺、肝臟、血塊、淋巴結(jié)、大塊癌組織等可適當(dāng)厚一點(diǎn)，而脂肪組織、肺

57、組織、纖維性腫瘤、平滑肌瘤等致密的或試劑不易滲入的組織應(yīng)取薄一些；淋巴結(jié)應(yīng)修掉兩側(cè)球冠，并盡量剔除周圍的脂肪組織。在取材中還應(yīng)十分注意組織內(nèi)是否有縫線或骨組織，如碰到不可避免的鈣化組織，應(yīng)與技術(shù)室講明，在切取纖維組織、肌肉組織、胃腸道時(shí)，應(yīng)注意纖維及肌肉的走向，取材時(shí)盡可能按與纖維平行走向切取為佳。2 . 固定固定是技術(shù)室工作的第一步，也是在整個(gè)制片過程中無法補(bǔ)救的一步。所謂“固定”，就是組織離體后，用各種辦法使其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量接近其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置的過程。固定的目的是為了防止組織細(xì)胞自溶與腐敗，防止了細(xì)胞內(nèi)的酶對蛋白質(zhì)的分解作用，使細(xì)胞內(nèi)的各和成分如蛋白質(zhì)、脂

58、肪、碳水化合物或酶類轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿。另外，組織固定后，均呈一定的硬化狀態(tài)，增加組織韌性，而且不易變形，有利于以后的組織處理。所以組織一旦離體必需及時(shí)固定，固定液的量應(yīng)為組織的5倍。固定的關(guān)鍵主要與固定的及時(shí)性、固定液的選擇、固定液的濃度、固定的溫度和時(shí)間有關(guān)。最常用的固定液為10福爾馬林。筆者認(rèn)為，10福爾馬林由于受到福爾馬林的質(zhì)量、使用時(shí)的揮發(fā)和取材時(shí)帶入的水分影響，濃度被降低致組織固定不足，而高濃度的福爾馬林，降低了對組織的穿透性，形成周圍固定好而中央固定不到的現(xiàn)象。通過實(shí)踐，本人認(rèn)為以酸性1215的福爾馬林最佳。大標(biāo)本（2cm厚）一般需要612個(gè)小時(shí)，小標(biāo)

59、本一般需要36個(gè)小時(shí)；當(dāng)室溫低18時(shí)，可在37以下的溫箱內(nèi)加溫46個(gè)小時(shí)。由于HE染色最佳著色PH為3.54.5, 中性福爾馬林對蘇木素染色有一定影響,細(xì)胞核容易發(fā)灰,核染色質(zhì)不佳。所以, 盡管中性福爾馬林對抗原有很好的保存作用，但酸性福爾馬林對絕大多數(shù)抗原來說也有很好的保存作用，所以在沒有特別處理的情況下常規(guī)HE用1215酸性福爾馬林也可以（每100毫升1215福爾馬林液內(nèi)加5毫升冰醋酸）。骨髓、結(jié)締組織固定以Bouin液為佳，經(jīng)Bouin液固定后的組織必須流水沖洗4小時(shí)以上。有條件的單位可根據(jù)不同要求選用二種或二種以上的固定液；少數(shù)單位還可建立組織冷凍庫，以便適應(yīng)各種特殊的處理要求。3. 水洗固定后水洗（1020分鐘），通常被很多人所忽視，而水洗不徹底，容易造成脫片和染色不鮮艷。對需做免疫組織化學(xué)的組織，更不應(yīng)當(dāng)忽視。福爾馬林不利于組織塊內(nèi)抗原的保存4 . 脫水和透明所謂脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來，以利于有機(jī)溶劑的滲入，這一過程稱為脫水。脫水是否徹底，直接關(guān)系到組織是否能充分透明，而脫水過度（原因是組織在純酒精內(nèi)時(shí)間過久，發(fā)生組織質(zhì)地發(fā)生變化）容易造成組織發(fā)脆。造成組織發(fā)脆的原因還有加溫（溫度超過35）、脫水劑內(nèi)加有丙酮、浸蠟用的石蠟中二甲苯過多等等。一般我們總認(rèn)為組織發(fā)脆跟高濃度酒精有關(guān)，而忽視