細胞培養(yǎng)課件

1、1細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)發(fā)展歷史細胞培養(yǎng)發(fā)展歷史1885年年 Wilhelm Roux 將雞胚髓板在溫熱的鹽水中維持存活將雞胚髓板在溫熱的鹽水中維持存活 若干天，是有記錄的第一個體外移植成功的例子。若干天，是有記錄的第一個體外移植成功的例子。1887年年 Amold 把榿木的木髓碎片接種到蛙皮下，當白細胞侵入把榿木的木髓碎片接種到蛙皮下，當白細胞侵入 到木髓碎片后，他將這些白細胞收集到盛有鹽水的小碟到木髓碎片后，他將這些白細胞收集到盛有鹽水的小碟 中，接下來觀察到這些白細胞在運動，并存活一個短的時中，接下來觀察到這些白細胞在運動，并存活一個短的時 間。間。1902年年 哈泊蘭德哈泊蘭德 預言植物細胞

2、的全能性預言植物細胞的全能性1903年年 Jolly 將蠑螈的白細胞保存在懸滴中并維持了將蠑螈的白細胞保存在懸滴中并維持了1個月。個月。1906年年 Beebe&Ewing 在動物的血液中嘗試培養(yǎng)了傳染狗淋巴肉在動物的血液中嘗試培養(yǎng)了傳染狗淋巴肉 瘤病毒的細胞。瘤病毒的細胞。2細胞培養(yǎng)19071907年年 Ross Harrison Ross Harrison （美國）（美國）將蛙胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，將蛙胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這些組織在體外不但存活若干周，而且居然從細胞中這些組織在體外不但存活若干周，而且居然從細胞中長出了軸突（神經(jīng)細胞）。

3、長出了軸突（神經(jīng)細胞）。意義：公認的組織培養(yǎng)開始標志；意義：公認的組織培養(yǎng)開始標志；解決了軸突發(fā)生的爭論；解決了軸突發(fā)生的爭論；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)物放在蓋玻片上并培養(yǎng)方法將培養(yǎng)物放在蓋玻片上并倒置于凹玻片腔中培養(yǎng)。倒置于凹玻片腔中培養(yǎng)。3細胞培養(yǎng) 1923 Alexis Carrel (surgeon)Aseptic techniquesCarrel Flask1912-1946Culture Chicken Embryo FibroblastPlasma+tissue homogenate在沒有抗生素的條件下，使雞胚心臟細胞維持生存在沒有抗生素的條件下，使雞胚心臟細胞維持生存34年，先后傳代年，

4、先后傳代3400次。次。4細胞培養(yǎng)19341934年年 荷蘭溫特荷蘭溫特 發(fā)現(xiàn)生長素，并證實了對植物細胞發(fā)現(xiàn)生長素，并證實了對植物細胞 培養(yǎng)的作用培養(yǎng)的作用19371937年年 高特里特高特里特, ,諾比考特諾比考特( (法法) ) 幾乎同時離體培養(yǎng)幾乎同時離體培養(yǎng) 了胡蘿卜組織，并使細胞增殖了胡蘿卜組織，并使細胞增殖19401940年年 Earle Earle 建立了可無限傳代的建立了可無限傳代的C3HC3H小鼠的結(jié)締組小鼠的結(jié)締組 織細胞系織細胞系L L系（曾在體外經(jīng)甲基膽蒽系（曾在體外經(jīng)甲基膽蒽 轉(zhuǎn)化）。轉(zhuǎn)化）。19511951年年 Gay Gay 建立了人第一個細胞系人體宮頸癌建立了人

5、第一個細胞系人體宮頸癌 HelaHela細胞系（原報道為鱗癌，細胞系（原報道為鱗癌，19711971年更年更 正為腺癌）。正為腺癌）。5細胞培養(yǎng)動物細胞的生長動物細胞的生長 動物細胞特性動物細胞特性: : 真核細胞基本結(jié)構(gòu)：亞顯微水平真核細胞基本結(jié)構(gòu)：亞顯微水平(0.2m)(0.2m) 膜囊結(jié)構(gòu)膜囊結(jié)構(gòu)質(zhì)膜，核膜，內(nèi)膜系統(tǒng)質(zhì)膜，核膜，內(nèi)膜系統(tǒng) 纖維結(jié)構(gòu)纖維結(jié)構(gòu)染色質(zhì)，細胞骨架系統(tǒng)染色質(zhì)，細胞骨架系統(tǒng) 顆粒結(jié)構(gòu)顆粒結(jié)構(gòu)核糖體核糖體6細胞培養(yǎng)細胞器的化學組分：細胞器的化學組分：有機分子：蛋白質(zhì)類（結(jié)構(gòu)蛋白，分泌蛋白，酶等）有機分子：蛋白質(zhì)類（結(jié)構(gòu)蛋白，分泌蛋白，酶等） 脂類（磷脂，卵磷脂，腦磷脂，

6、心磷脂）脂類（磷脂，卵磷脂，腦磷脂，心磷脂） 多糖類（糖脂，糖蛋白等）多糖類（糖脂，糖蛋白等） 核酸類（核酸類（DNA,RNADNA,RNA等）等） 固醇類（膽固醇等）固醇類（膽固醇等）無機分子：水（結(jié)合水，游離水）無機分子：水（結(jié)合水，游離水） 無機離子（無機離子（NaNa+ +,K,K+ +,Ca,Ca2+2+,Mg,Mg2+2+) )7細胞培養(yǎng)細胞質(zhì)膜生物學特性：細胞質(zhì)膜生物學特性： 對水具有很強的通透性對水具有很強的通透性 對脂溶性物質(zhì)的通透性大于非脂溶性物質(zhì)對脂溶性物質(zhì)的通透性大于非脂溶性物質(zhì) 電阻率很高，一般在電阻率很高，一般在10109 910101111 表面張力較低表面張力較

7、低8細胞培養(yǎng)細胞膜下皮質(zhì)層細胞膜下皮質(zhì)層: :微絲微絲(microfilament,MF)中等纖維中等纖維(intermediate filament,IF)微管微管(microtubule,MT)9細胞培養(yǎng)動物細胞之間的連接形式動物細胞之間的連接形式 緊密連接緊密連接(tight junction)(tight junction) 間隙連接間隙連接(gap junction)(gap junction) 隔壁連接隔壁連接(separate junction)(separate junction)無脊椎動物細胞無脊椎動物細胞 中間連接中間連接(intermediate junction)(in

8、termediate junction)脊椎動物細胞脊椎動物細胞 橋粒連接橋粒連接(desmosome junction)(desmosome junction)10細胞培養(yǎng)培養(yǎng)細胞的生物學特征培養(yǎng)細胞的生物學特征1.貼壁型細胞貼壁型細胞2.懸浮型細胞懸浮型細胞上皮細胞型上皮細胞型成纖維細胞型成纖維細胞型游走細胞型游走細胞型多形性細胞多形性細胞11細胞培養(yǎng)培養(yǎng)細胞的生長特點培養(yǎng)細胞的生長特點1.貼附貼附 影響因素：離子（影響因素：離子（Ca2+) 機械、物理因素（低溫、培養(yǎng)液流動過快）機械、物理因素（低溫、培養(yǎng)液流動過快） 生物因素（生長因子）生物因素（生長因子）2.接觸抑制接觸抑制3.密度抑

9、制密度抑制12細胞培養(yǎng)培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程單個細胞的生長過程單個細胞的生長過程 細胞周期細胞周期 G1G1持續(xù)時間長短差異大持續(xù)時間長短差異大 S S 時間較恒定，平均時間較恒定，平均6-8hr6-8hr G2 G2對環(huán)境敏感對環(huán)境敏感 M M 持續(xù)時間很短持續(xù)時間很短13細胞培養(yǎng)14細胞培養(yǎng)細胞系的生長過程細胞系的生長過程 細胞在培養(yǎng)中存活時間的長短，主要取決于細胞的種類、性細胞在培養(yǎng)中存活時間的長短，主要取決于細胞的種類、性狀、和原供體的年齡等。狀、和原供體的年齡等。三個生長階段：三個生長階段： 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的從體內(nèi)取出

10、組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的 階段，一般維持階段，一般維持14周。周。 傳代期傳代期 衰退期衰退期15細胞培養(yǎng)每代細胞的生長過程每代細胞的生長過程每代細胞一般經(jīng)過三個生長階段：每代細胞一般經(jīng)過三個生長階段： 潛伏期潛伏期 指數(shù)生長期指數(shù)生長期 停止期（平臺期）停止期（平臺期）16細胞培養(yǎng)群體細胞的生長過程群體細胞的生長過程17細胞培養(yǎng)潛伏期潛伏期(1atent phase)(1atent phase)18細胞培養(yǎng)對數(shù)生長期對數(shù)生長期(logarithmic growth phase)(logarithmic growth phase)接觸抑制接觸抑制(contact inhibition) (c

11、ontact inhibition) 正常細胞會因為細胞接觸而發(fā)生相正常細胞會因為細胞接觸而發(fā)生相互抑制分裂和限制運動的現(xiàn)象?；ヒ种品至押拖拗七\動的現(xiàn)象。對數(shù)生長期對數(shù)生長期最具活力時期（細胞分裂旺盛，分最具活力時期（細胞分裂旺盛，分 裂相增多。）裂相增多。） 細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù)(mitotic index(mitotic index，MI)MI) MI MI( (分裂相個數(shù)分裂相個數(shù)10001000個細胞個細胞) )100100 19細胞培養(yǎng)穩(wěn)定期穩(wěn)定期(stationary phase) 培養(yǎng)空間和營養(yǎng)物質(zhì)有限培養(yǎng)空間和營養(yǎng)物質(zhì)有限 代謝廢物積累代謝廢物積累 新分裂細胞數(shù)新分裂細胞數(shù)

12、= =死亡細胞數(shù)死亡細胞數(shù) （穩(wěn)定期）（穩(wěn)定期）注：細胞代謝活動仍在進行中注：細胞代謝活動仍在進行中20細胞培養(yǎng)衰亡期衰亡期(senescence phase)21細胞培養(yǎng)培養(yǎng)細胞的遺傳學特征培養(yǎng)細胞的遺傳學特征1.染色質(zhì)與染色體染色質(zhì)與染色體 原代培養(yǎng)多呈二倍體原代培養(yǎng)多呈二倍體 長期傳代發(fā)生偏離二倍體現(xiàn)象長期傳代發(fā)生偏離二倍體現(xiàn)象2.細胞性別細胞性別 Barr小體小體 Y小體小體22細胞培養(yǎng)體內(nèi)外細胞的差異及培養(yǎng)細胞的分化體內(nèi)外細胞的差異及培養(yǎng)細胞的分化 體內(nèi)外細胞的差異體內(nèi)外細胞的差異 培養(yǎng)細胞的分化培養(yǎng)細胞的分化23細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液細胞培養(yǎng)液常用液體常用液體 1.1.水水2.2.平衡

13、鹽溶液平衡鹽溶液3.3.消化液消化液4.4.消化酶抑制液消化酶抑制液5.pH5.pH調(diào)整液調(diào)整液24細胞培養(yǎng)平衡鹽水平衡鹽水BSS v用途用途: : 作為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液作為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液 洗滌組織、細胞等洗滌組織、細胞等 v成分：成分： 無機鹽無機鹽 葡萄糖葡萄糖 v作用：作用： 維持滲透壓，調(diào)節(jié)維持滲透壓，調(diào)節(jié)pHpH， 供給能量和無機離子供給能量和無機離子25細胞培養(yǎng)v常用常用:Hanks:Hanks液液 EarleEarle液液 PBSPBSv 配制要求配制要求: :防止鈣沉淀防止鈣沉淀 良好的緩沖作用良好的緩沖作用26細胞培養(yǎng)27細胞培養(yǎng)細胞消化液細胞消化液:胰蛋白酶胰蛋白酶(tryp

14、sin)(trypsin)溶液溶液 濃度濃度0.125%0.125%和和0.25%0.25% 最適條件最適條件pH8.0pH8.037 37 配制配制無無CaCa2+2+、MgMg2+2+及血清的平衡鹽溶液及血清的平衡鹽溶液 乙二胺四乙酸二鈉乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(EDTA)溶液溶液VersenVersen液，常用濃度液，常用濃度0.020.02其他：鏈霉蛋白酶，骨膠原酶，透明質(zhì)酸酶其他：鏈霉蛋白酶，骨膠原酶，透明質(zhì)酸酶28細胞培養(yǎng)消化酶抑制液消化酶抑制液大豆胰酶抑制液大豆胰酶抑制液終濃度：終濃度：0.1% 0.5% 常以常以DMEM/F12培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液配制過濾除菌過濾除菌-20 保

15、存保存29細胞培養(yǎng)pH調(diào)整液調(diào)整液3.73.7，5.65.6，7.47.4NaHCONaHCO3 3溶液溶液 0.22m0.22m濾膜過濾除菌濾膜過濾除菌 NaHCONaHCO3 3+H+H2 2O NaO Na+ +OH+OH- -+ H+ H2 2O+COO+CO2 2HEPESHEPES 0.22m0.22m濾膜過濾除菌濾膜過濾除菌30細胞培養(yǎng)抗生素溶液：抗生素溶液： 青、鏈霉素青、鏈霉素( (雙抗雙抗) )青霉素青霉素抑制細菌細胞壁的合成抑制細菌細胞壁的合成100U/ml100U/ml鏈霉素鏈霉素抑制細菌蛋白質(zhì)的合成抑制細菌蛋白質(zhì)的合成 100g/ml100g/ml 卡那霉素卡那霉素

16、制霉菌素制霉菌素31細胞培養(yǎng)谷氨酰胺補充液谷氨酰胺補充液 溶液中不穩(wěn)定溶液中不穩(wěn)定 過濾除菌過濾除菌 -20 -20 保存保存32細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基營養(yǎng)成分：營養(yǎng)成分： 氨基酸：氨基酸：L型型 單糖：葡萄糖單糖：葡萄糖 維生素維生素 其他成分其他成分 ：核酸降解物、抗氧：核酸降解物、抗氧化劑等化劑等促生長因子及激素促生長因子及激素 pH滲透壓滲透壓33細胞培養(yǎng)天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 血清血清 組織提取液組織提取液 雞胚汁雞胚汁 鼠尾膠原鼠尾膠原 水解乳蛋白水解乳蛋白34細胞培養(yǎng)血清血清 種類種類: : 小牛血清小牛血清 牛血清：牛血清： 新生牛血清新

17、生牛血清 胎牛血清胎牛血清 馬血清馬血清 雞血清雞血清 兔血清兔血清 羊血清羊血清35細胞培養(yǎng)主要成分：主要成分： 各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等。素、無機物等。36細胞培養(yǎng)血清的主要作用：血清的主要作用：v 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)v 提供貼壁和擴展因子提供貼壁和擴展因子v 提供激素和各種生長因子提供激素和各種生長因子v 提供結(jié)合蛋白提供結(jié)合蛋白v 對培養(yǎng)中的細胞提供某些保護作用對培養(yǎng)中的細胞提供某些保護作用37細胞培養(yǎng)使用血清的缺點：使用血清的缺點：v可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)?？赡芨淖兡撤N細胞

18、在體內(nèi)的正常狀態(tài)。v 取材過程有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)的細胞取材過程有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)的細胞 產(chǎn)生潛在影響，可能導致實驗失敗或?qū)嶒灝a(chǎn)生潛在影響，可能導致實驗失敗或?qū)嶒?結(jié)果的不結(jié)果的不 可靠性可靠性v 每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致v 血清中含有一些物質(zhì)對細胞會產(chǎn)生毒性作用血清中含有一些物質(zhì)對細胞會產(chǎn)生毒性作用38細胞培養(yǎng)血清的質(zhì)量標準血清的質(zhì)量標準v 理化性質(zhì)（滲透壓、理化性質(zhì)（滲透壓、pHpH、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等）水平、內(nèi)毒素等）v 微生物檢測（細菌、真菌、支原體、病毒等）微生物檢測（細菌、真菌、支原體、病毒等）v 促生長效果促生長效果39細胞培養(yǎng)血清的使用與儲存血清的使用與儲存v 使用前處理：使用前處理： 滅活處理滅活處理5656，30min30min 目的目的去除血清中的補體成分，避免補體去除血清中的補體成分，避免補體 對細胞產(chǎn)生細胞毒作用對細胞產(chǎn)生細胞毒作用v 儲存條件：儲存于儲存條件：儲存于-20 -20 ，避免反復凍融，避免反復凍融v 使用濃度：一般為使用濃度：一般為5%5%20%20%，常為，常為10% 10% 40細胞培養(yǎng)合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 無機鹽無機鹽v 基本組分：基本組分： 氨基酸：氨基酸：1212種必需氨基酸種必需氨基酸 維生素維