微生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)

1、微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)則與安全微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的對(duì)象大多為病原微生物，具有傳染性，因此要求進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后必須嚴(yán)格遵守以下實(shí)驗(yàn)室規(guī)則：1進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)穿白大衣，離室時(shí)脫下，反折放回原處，不必要的物品不得帶入實(shí)驗(yàn)室，必須帶入的書(shū)籍和文具等應(yīng)放在指定的非操作區(qū)，以免受到污染。無(wú)菌操作時(shí)必須戴口罩，并不得開(kāi)電風(fēng)扇。2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食、抽煙，不得高聲談笑或隨便走動(dòng)。3各種實(shí)驗(yàn)物品應(yīng)按指定地點(diǎn)存放，用過(guò)的器材必須放入消毒缸內(nèi)，禁止隨意放于桌上及沖入水槽。4須送溫箱培養(yǎng)的物品，應(yīng)做好標(biāo)記后送到指定地點(diǎn)。5實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生差錯(cuò)或意外事故時(shí)，禁止隱瞞或自作主張不按規(guī)定處理，應(yīng)立即報(bào)告老師進(jìn)行正確的處理。如有

2、傳染性的材料污染桌面、地面等，應(yīng)立即用0.2%0.5% “84”消毒液浸泡污染部位，作用510min后方可抹去。如手被活菌污染也應(yīng)使用上述消毒液浸泡510min后，再以自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈。6愛(ài)護(hù)室內(nèi)儀器設(shè)備，嚴(yán)格按操作規(guī)則使用。節(jié)約使用實(shí)驗(yàn)材料，不慎損壞了器材等，應(yīng)主動(dòng)報(bào)告老師進(jìn)行處理。7實(shí)驗(yàn)完畢，應(yīng)物歸原處并將桌面整理清潔，實(shí)驗(yàn)室打掃干凈。最后以0.2%0. 5% “84”消毒液浸泡手5min，洗凈后方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)一 器皿包扎及消毒與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培養(yǎng)皿的包扎方法。2、了解干熱滅菌、紫外線(xiàn)滅菌、微孔濾膜過(guò)濾除菌和高壓蒸汽滅菌的原理和應(yīng)用范圍。

3、3、掌握高壓蒸汽滅菌的操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理（1）實(shí)驗(yàn)室中使用的玻璃器皿簡(jiǎn)介 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的玻璃器皿，大多要進(jìn)行消毒、滅菌和（將“和”改為“才能”）用來(lái)培養(yǎng)微生物，因此對(duì)其質(zhì)量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。玻璃器皿的質(zhì)量一般要求硬質(zhì)玻璃，才能承受高溫和短暫灼燒而不致破壞；玻璃器皿的游離堿含量要少，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的酸堿度；對(duì)玻璃器皿的形狀和包裝方法的要求，以能防止污染雜菌為準(zhǔn)；洗滌玻璃器皿的方法不當(dāng)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。目前微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，有些玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的實(shí)驗(yàn)室用具。（2）滅菌的常用方法和基本原理實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法有干熱滅菌

4、法、紫外線(xiàn)照射法、微孔濾膜過(guò)濾除菌法和高壓蒸汽滅菌法等。A.干熱滅菌是用電熱干燥箱（圖1）加熱，利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的酶、蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。B.紫外線(xiàn)殺菌機(jī)制主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。C.微孔過(guò)濾除菌（圖2、圖3）是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌、真菌孢子等的方法。D.高壓蒸汽滅菌也是使蛋白質(zhì)變性而滅菌，高壓蒸汽滅菌鍋（圖4、圖5、圖6）滅菌時(shí)是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而

5、增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。圖1 電熱干燥箱的外觀和結(jié)構(gòu)圖2 圖3 圖4 高壓蒸汽滅菌鍋圖5 臥式滅菌鍋 圖6 手提式滅菌鍋1.安全閥；2.壓力表；3.放氣閥；4.軟管；5.緊固螺栓；6.滅菌桶；7.篩架；8.水干熱滅菌與高壓蒸汽滅菌的滅菌效果與所滅物品的蛋白質(zhì)含水量有很大的關(guān)系（表1）。就效果而言，濕熱滅菌效果要比干熱滅菌效果好（表2）。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要（表3），因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度

6、。表1 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系卵白蛋白含水量/%30分鐘內(nèi)凝固所需溫度/50562574-801880-906145表2 干熱、濕熱穿透力及滅菌效果比較溫度/時(shí)間/h透過(guò)布層的溫度/滅菌10層20層100層干熱130-1404867270.5不完全濕熱105.33101101101完全表3 滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)壓力與溫度的關(guān)系壓 力 數(shù)全部空氣排出時(shí)的溫度 ()2/3空氣排出時(shí)的溫度()l/2空氣排出時(shí)的溫度 ()1/3空氣排出時(shí)的溫度 ()空氣全不排出時(shí)的溫度 ()MPakg/cm2 1b/in20.030.070.100.140.170.210.350.701.051.40

7、1.752.10 51015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121壓力數(shù)全部空氣排出時(shí)的溫度2/3空氣排出時(shí)的溫度1/2空氣排出時(shí)的溫度1/3空氣完全排除時(shí)的溫度空氣完全排除時(shí)的溫度MPaKg/cm21b/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.101.0515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.

8、7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121延伸閱讀1、紫外線(xiàn)滅菌法紫外線(xiàn)滅菌是用紫外線(xiàn)燈進(jìn)行的，波長(zhǎng)為200300 nm的紫外線(xiàn)都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長(zhǎng)一定的條件下，紫外線(xiàn)的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線(xiàn)殺菌機(jī)制主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過(guò)氧化氫（H2O2），O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線(xiàn)穿透力不大，所以，只適用于無(wú)菌室、接種箱、手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線(xiàn)燈距照

9、射物以不超過(guò)1.2 m為宜。此外，為了加強(qiáng)紫外線(xiàn)滅菌效果，在打開(kāi)紫外線(xiàn)燈以前，可在無(wú)菌室內(nèi)（或接種箱內(nèi)）噴灑3-5的石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。無(wú)菌室內(nèi)的桌面，凳子可用2-3的來(lái)蘇爾擦洗，然后再開(kāi)紫外線(xiàn)燈照射，即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。2、化學(xué)試劑滅菌大多數(shù)化學(xué)藥劑在低濃度下起抑菌作用，高濃度下起殺菌作用。常用5%石炭酸、70%乙醇和乙二醇等?；瘜W(xué)滅菌劑必須有揮發(fā)性，以便清除滅菌后材料上殘余的藥物?；瘜W(xué)滅菌常用的試劑有表面消毒劑、抗代謝藥物（磺胺類(lèi)等）、抗生素、生物藥物素。抗生素是一類(lèi)有（由）微生物或其他生物生命活動(dòng)過(guò)程中的（刪除）合成

10、的次生代謝產(chǎn)物或人工衍生物，他（它）們?cè)诤艿蜐舛葧r(shí)就能抑制或感染它種生物（包括病原菌，病毒，癌細(xì)胞等）的生命活動(dòng)，因而可用作優(yōu)良的化學(xué)治療劑。氣體滅菌法，利用環(huán)氧乙烷或甲醛性殺微生物的一種方法。本辦法主要用于玻璃制品、磁制品、金屬制品、橡膠制品、塑料制品、纖維制品等，用于設(shè)施、設(shè)備或粉末狀的醫(yī)藥品等，使用氣體滅菌時(shí)，其被滅菌的物品以未變質(zhì)為前提條件；藥液滅菌法，是用藥液殺滅微生物的方法。本辦法主要用于玻璃制品、磁制品、金屬制品、橡膠制品、塑料制品、纖維制品等物品的滅菌，還可用于手指、無(wú)菌箱或無(wú)菌設(shè)備等的消毒，藥液滅菌用于未變質(zhì)的物品。通常使用的有酒精（70-75%乙醇）、0.11 % （w/v

11、）鹽化苯類(lèi)溶液、甲酚、苯酚水或福爾馬林水等。三、實(shí)驗(yàn)材料1、各種玻璃器皿、試管刷、洗滌劑、培養(yǎng)皿、移液管、牛皮紙或報(bào)紙等。2、棉花、紗布、線(xiàn)繩、三角瓶和試管等。3、高壓蒸汽滅菌鍋。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.棉塞制作2. 移液管和培養(yǎng)皿的包扎3. 高壓蒸汽滅菌鍋的操作（1）加水：將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水使水面與三角擱架相平為宜。（2）裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。（3）加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以?xún)蓛蓪?duì)稱(chēng)的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓。（4）排氣：通電加熱，待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥。（5）升壓至0.1Mpa。（6）保壓：當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持

12、壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用0.1Mpa，121.5，20min滅菌。（7）降壓：滅菌所需的時(shí)間到后，關(guān)閉電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表降至“0”時(shí)，打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。（8）無(wú)菌檢查：將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。五、注意事項(xiàng)1切勿忘記加水，同時(shí)加水量不可過(guò)少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2壓力一定要降到“0”時(shí)，才能打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、主要的滅菌技術(shù)有哪幾種？2、滅菌鍋的

13、使用（步驟）3、玻璃器皿包扎（培養(yǎng)皿、移液管）操作：每人嘗試使用手提式滅菌鍋1次，每組制作試管塞4個(gè)、三角瓶塞3個(gè)（2小，1大），練習(xí)包扎移液管4根，包扎玻璃培養(yǎng)皿1組滅菌。七、思考題1、為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需要的溫度高，時(shí)間長(zhǎng)？請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較的實(shí)驗(yàn)方案。2、高壓蒸汽滅菌開(kāi)始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢之后，為什么待壓力降至“0”時(shí)才能打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取物？3、你知道紫外線(xiàn)燈管是用什么玻璃制作的？為什么不用普通玻璃？實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握培養(yǎng)基的配制原理；2、通過(guò)對(duì)幾種培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是供

14、微生物生長(zhǎng)、繁殖和代謝的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，需要適宜的pH值、一定的緩沖能力及合適的滲透壓。在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)微生物時(shí)需要添加凝固劑，實(shí)驗(yàn)室常用凝固劑是瓊脂，即從石花菜等海藻中提取的多糖，是應(yīng)用最廣泛的凝固劑，它在96-100融化，46以下凝固，培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后方可使用。（1）培養(yǎng)基據(jù)組成成分可分為:合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。 半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。天然培養(yǎng)基：利用天然來(lái)源的有機(jī)物配制而成。（2）據(jù)用途可分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：能滿(mǎn)足各種微生物的營(yíng)養(yǎng)需求的培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基：加入某種物質(zhì)抑制其他微生物生長(zhǎng)，使目標(biāo)微生物得到富集，便于分離。鑒別培養(yǎng)基：用來(lái)檢

15、測(cè)微生物的某些代謝特性。鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助開(kāi)快速鑒別某種微生物。如常用的麥康凱培養(yǎng)基，它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門(mén)氏菌和志賀氏菌）（3）從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為： 液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。 半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.20.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。延伸閱讀牛肉膏蛋白胨

16、培養(yǎng)基的一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基本培養(yǎng)基，有時(shí)又稱(chēng)普通培養(yǎng)基，其中牛肉膏為微生物提供碳源 、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無(wú)機(jī)鹽。（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基適用于培養(yǎng)一般細(xì)菌，其配制方法是： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 20g 水 1000ml pH 7.47.6（2）高氏1號(hào)培養(yǎng)基（適用于培養(yǎng)放線(xiàn)菌）可溶性淀粉 2gKNO3 0.1gK2HPO4 0.05gMgSO47H2O 0.05gNaCl 0.05gFeSO47H2O 0.001g （可用母液法）瓊脂 2g水 100mLpH 7.47.6（3）孟加拉紅培養(yǎng)基（適用于培養(yǎng)分離

17、真菌）蛋白胨 5g 葡萄糖 10g 磷酸二氫鉀 1g 硫酸鎂(MgSO47H2O) 0.5g 瓊脂 20g 1/3000孟加拉紅溶液 100mL 蒸餾水 1000mL 氯霉素 0.1g三、實(shí)驗(yàn)材料：1、溶液和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/L HCl、1mol/L NaOH等。2、儀器和其他用品：天平、試管、量筒、小燒杯、玻璃棒、藥匙、pH試紙、棉花塞、報(bào)紙、棉繩、標(biāo)簽、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌鍋、電爐等。四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）稱(chēng)量。l 蛋白胨很易吸濕，在稱(chēng)取時(shí)動(dòng)作要迅速。l 牛肉浸膏用小燒杯或培養(yǎng)皿稱(chēng)量，然后熱水溶化轉(zhuǎn)移。l 稱(chēng)藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱(chēng)取一種藥品

18、后，洗凈，擦干，再稱(chēng)取另一藥品。l 瓶蓋不要蓋錯(cuò)。（2）熔化。l 配制培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化。l 向燒杯中加入少許所需要的水量，然后隔以石棉網(wǎng)小心加熱，用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后定容，補(bǔ)足水分。l 在瓊脂溶化時(shí)，應(yīng)控制火力，以免沸騰而溢出容器。需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。（3）調(diào)pH。l pH勿調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。滅菌后pH值會(huì)下降0.10.2，在做培養(yǎng)基校正pH值時(shí)，應(yīng)比實(shí)際值高0.10.2。l 若偏酸，滴加1mol/L NaOH調(diào)整，若偏堿，滴加1mol/L HCl調(diào)整（4）過(guò)濾。用濾紙或紗布過(guò)濾，供一般用的培養(yǎng)基此步驟可省略。（5）分裝。分裝過(guò)程中，

19、注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免引起污染。注意：固體裝入試管中的量不宜超過(guò)試管高度的1/5，半固體1/3，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。（6）加塞。培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶上塞好棉塞，以阻止外界微生物污染培養(yǎng)基，并保證有良好的通氣性能。（7）包扎。加塞后，將全部試管用棉繩捆好，再在棉塞外包一層報(bào)紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，最后用扎好。同時(shí)用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、配制日期、組別。（8）滅菌。將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，121，15min高壓蒸汽滅菌。（9）擱置斜面。滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50左右，將試管一端傾斜擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(zhǎng)度以不

20、超過(guò)試管長(zhǎng)的一半為宜。（10）無(wú)菌檢查。將滅菌培養(yǎng)基于37，培養(yǎng)24-48h，以檢查滅菌是否徹底。五、注意事項(xiàng):1. 蛋白胨很易吸濕，在稱(chēng)取時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱(chēng)藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱(chēng)取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱(chēng)取另一藥品。2. 在瓊脂溶化過(guò)程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。配置培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱熔化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。3. pH不要調(diào)過(guò)頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4. 分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果每組配制高氏1號(hào)培養(yǎng)基：100ml，試管斜面2個(gè)；牛肉膏蛋白胨

21、瓊脂培養(yǎng)基：200ml，試管斜面4個(gè)；孟加拉紅培養(yǎng)基：100ml，試管斜面2個(gè)。剩余三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基保留瓶?jī)?nèi)，統(tǒng)一滅菌后，下次實(shí)驗(yàn)倒平板操作。七、思考題1、 培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是否為無(wú)菌的？2、 在配置培養(yǎng)基的操作過(guò)程中應(yīng)主要些什么問(wèn)題，為什么？3、 馬丁氏培養(yǎng)基的pH“自然”，根據(jù)你配制前2種培養(yǎng)基的經(jīng)驗(yàn)和所學(xué)知識(shí)你認(rèn)為此培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)是偏酸還是偏堿？為什么？實(shí)驗(yàn)三 無(wú)菌操作技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟練掌握從固體培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)接微生物的無(wú)菌操作技術(shù)；2、體會(huì)無(wú)菌操作的重要性；3、掌握倒平板的基本操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)或科研生產(chǎn)中，要經(jīng)常地

22、把一定種類(lèi)的微生物菌種接種或移植到新鮮培養(yǎng)基中。由于我們接種的微生物都是純種的，所以接種工作都必須在無(wú)菌環(huán)境下（在無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)）進(jìn)行，并嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)。利用接種工具（如接種環(huán)、接種鏟等）進(jìn)行菌種的移植。因此無(wú)菌操作是接種培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。（1）斜面接種法 把各種培養(yǎng)條件下的菌種，接入斜面上（包括從試管斜面、培養(yǎng)基平板、液體純培養(yǎng)物等中把菌種移接于斜面培養(yǎng)基上）。這是微生物學(xué)中最常用、最基本的技術(shù)之一。接種前，需在待接種試管上貼好標(biāo)簽，注明菌名及接種日期。接種最好在無(wú)菌室或無(wú)菌箱內(nèi)進(jìn)行，若無(wú)此條件，

23、可在較清潔密閉的室內(nèi)進(jìn)行。（2）液體接種液體接種是一種用移液管、滴管或接種環(huán)等工具將菌液移接到培養(yǎng)基中的方法。吸管不同于其它接種工具，不能灼燒，可預(yù)先對(duì)其進(jìn)行烘烤法滅菌。（3）穿刺接種穿刺接種常用于保藏菌種或細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的檢查。一般適用于細(xì)菌、酵母菌的接種培養(yǎng)。用接種針沾取少許菌種，移入裝有固體或半固體培養(yǎng)基的試管中，自培養(yǎng)基中心垂直刺入到底，然后按原來(lái)的穿刺線(xiàn)將針慢慢拔出。三、實(shí)驗(yàn)材料：超凈工作臺(tái)、接種環(huán)等接種工具、斜面培養(yǎng)基、酒精燈、酒精棉球等。接種工具有：接種環(huán)、接種鉤、接種針、接種圈、接種鋤、玻璃涂棒、其他接種工具。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、無(wú)菌操作要點(diǎn)1）要求建立“有菌概念”。2）接種時(shí)要有一個(gè)

24、潔凈的環(huán)境，整個(gè)操作過(guò)程必須在火焰旁進(jìn)行。3）接種環(huán)，棉塞一定要拿在手上，不能隨便亂丟。2、用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種接種細(xì)菌應(yīng)用接種針（環(huán)）來(lái)沾取細(xì)菌標(biāo)本，進(jìn)行接種。接種環(huán)與接種針為用白金絲或合金絲所制，亦可用電爐絲代替，因它能耐高熱且散熱快，便于接種前后通過(guò)火焰滅菌（整個(gè)接種環(huán)燒紅即達(dá)到滅菌目的）。在使用接種環(huán)時(shí)一般用右手持筆式較為方便，左手可持培養(yǎng)基進(jìn)行配合，其接種程序可分為：滅菌接種環(huán)稍冷沾取細(xì)菌樣品進(jìn)行接種（包括：?jiǎn)⑸w或塞、接種劃線(xiàn)、加蓋或塞）進(jìn)行接種環(huán)滅菌等五個(gè)程序。不同培養(yǎng)基，接種方法也不同。接種方法：A、接種前用酒精棉球擦凈桌面；B、將試管貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等，然后

25、用酒精棉球擦手消毒；C、點(diǎn)燃酒精燈以后，在火焰旁將每一支試管內(nèi)的棉塞稍微轉(zhuǎn)一下，使其松動(dòng)，以便在接種時(shí)易拔出，并將試管放在試管架上，放在接種臺(tái)的右前方；D、將菌種和斜面培養(yǎng)基的兩支試管，用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于兩試管之間的部分，斜向上，并使他們呈水平位置，也可將試管橫放在左手掌中央，用四個(gè)手指托住試管，大拇指壓在試管上，斜面向上；E、右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)的部分燒紅滅菌，環(huán)以上凡在接種可能進(jìn)入試管內(nèi)的部分，均應(yīng)通過(guò)火焰灼燒。（見(jiàn)圖）以下操作，需要使管口靠近火旁。F、用右手小指、無(wú)名指和手掌拔掉棉塞；G、以火焰灼燒管口，灼燒時(shí)應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動(dòng)試管口，使試管口沾染的少量菌得以燒死；H

26、、將燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒(méi)有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的菌體，然后輕輕接觸菌體，取出少許，慢慢將接種環(huán)抽出試管（圖），注意盡量不要使環(huán)的部分碰釘子到管壁，取出后不可使環(huán)通過(guò)火焰；從一個(gè)試管移種到另一試管I、迅速將接種環(huán)在火焰旁伸進(jìn)另一試管，在斜面培養(yǎng)基上從底部劃線(xiàn)到頂部，但不要把培養(yǎng)基劃破，也不要使菌種沾染管壁；J、取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將棉塞塞上，不要用試管去迎棉塞，以免試管在運(yùn)到時(shí)灌入不潔的空氣；K、將接種環(huán)在火焰上再灼燒滅菌，放回原出后，再騰出手來(lái)將棉塞塞緊，將新接種的斜面試管放在試管架上；L、接種后的斜面培養(yǎng)基，放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。3、液體培

27、養(yǎng)基中的菌種接入液體培養(yǎng)基中接種工具：移液器，無(wú)菌移液管和無(wú)菌滴管移液管和滴管不能在火焰上燒，應(yīng)預(yù)先滅菌用無(wú)菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即可。4、倒平板操作當(dāng)培養(yǎng)基冷至45左右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無(wú)名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開(kāi)，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和逆時(shí)針來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30培養(yǎng)2448h，然后觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果操作：每組倒2皿高氏一號(hào)培養(yǎng)基，2皿孟加拉紅培養(yǎng)基和6皿牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（4個(gè)玻璃培養(yǎng)皿，2個(gè)一次性塑料培養(yǎng)

28、皿）。通過(guò)無(wú)菌接種技術(shù)每組各接一支大腸桿菌試管和一支金黃色葡萄球菌試管。每組各倒3種不同類(lèi)型的培養(yǎng)基3個(gè)平板以備下次實(shí)驗(yàn)使用。六、思考題1、為什么接種完畢后，接種環(huán)還必須灼燒后再放回原處，吸管也必須放進(jìn)廢物桶中？實(shí)驗(yàn)四 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和人體表面的微生物檢查一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、證實(shí)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與人體表面存在微生物；2、體會(huì)無(wú)菌操作的重要性；3、觀察不同類(lèi)群微生物的菌落形態(tài)特征。二、實(shí)驗(yàn)原理如何知道我們周?chē)翱床灰?jiàn)”的微生物變得可以看得見(jiàn)。通過(guò)“放大”成子細(xì)胞群體（菌落），使我們看得到它們的存在，即通過(guò)培養(yǎng)的方法使肉眼看不見(jiàn)的單個(gè)菌體在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)繁殖形成幾百萬(wàn)個(gè)菌聚集在一起的肉眼可見(jiàn)的菌落,來(lái)檢

29、查實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和人體表面的微生物，從而使我們牢固樹(shù)立“無(wú)菌概念”。平板培養(yǎng)基含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)成分，當(dāng)取自不同來(lái)源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)，1-2d內(nèi)每一菌體既可以通過(guò)很多次細(xì)胞分裂而進(jìn)行繁殖，形成一個(gè)可見(jiàn)的細(xì)胞群體的集落，稱(chēng)為菌落。每一種細(xì)菌所形成的菌落都有它自己的特點(diǎn)，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤(rùn)、隆起或扁平、粗糙或光滑、邊緣整齊或者不整齊，菌落透明或半透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。因此可以通過(guò)平板培養(yǎng)基來(lái)檢查環(huán)境中細(xì)菌的數(shù)量和類(lèi)型。三、實(shí)驗(yàn)材料：1、培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂平板2、酒精燈、記號(hào)筆、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、打火機(jī)等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、標(biāo)記培養(yǎng)皿標(biāo)記時(shí)在其邊緣寫(xiě)上

30、自己的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目、名字和日期，如果同一培養(yǎng)皿有多個(gè)小區(qū)時(shí)，要在各個(gè)小區(qū)內(nèi)分別標(biāo)記待處理的樣品名，為了不影響觀察，可用符號(hào)或者數(shù)字表示。注意：不能在皿蓋上作標(biāo)記，因?yàn)樵谖⑸飳W(xué)試驗(yàn)中，經(jīng)常需要同時(shí)觀察很多平板，很容易錯(cuò)蓋皿蓋。分別在兩套塑料一次性平板底部用記號(hào)筆劃分出4個(gè)小區(qū)，在4個(gè)小區(qū)內(nèi)分別標(biāo)上平皿1：A、B、C、D平皿2：E、F、G、H另外2個(gè)玻璃培養(yǎng)皿平板分別在標(biāo)簽上標(biāo)記空氣1、空氣22、人體表面微生物的檢查（1）手指表面：在火焰旁，半開(kāi)皿蓋，用洗前的手指在平板A區(qū)輕輕按一下，迅速蓋上皿蓋。然后用洗手2次，自然干燥后，在平板B區(qū)輕輕按一下，迅速蓋上皿蓋。（2）頭發(fā)：將你的1-2根頭發(fā)輕輕放在

31、平板C區(qū)，迅速蓋上皿蓋。（3）鼻腔：取出滅菌的濕棉簽在自己鼻腔內(nèi)滾動(dòng)數(shù)次后，立即在平板D區(qū)輕輕摩擦2-3次，蓋上皿蓋。3、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的檢查（1）將標(biāo)有“空氣1”的平板在實(shí)驗(yàn)室打開(kāi)皿蓋，使培養(yǎng)基表面完全暴露在空氣中，20分鐘后蓋上皿蓋。（2）將另一標(biāo)有“空氣2”的平板同樣操作，置于一個(gè)你認(rèn)為空氣中微生物數(shù)量較多的環(huán)境內(nèi)，20分鐘后蓋上皿蓋。注意：在記錄本上記下“空氣X分別代表的含義。（3）按同樣方法取滅菌濕棉簽，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)等4個(gè)你認(rèn)為微生物較多的地方擦拭，再分別在第2個(gè)塑料平板的E、F、G、H相應(yīng)區(qū)域滾動(dòng)接種。（注意做好取樣地點(diǎn)記錄）4、培養(yǎng)將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底朝上，置37攝氏度培養(yǎng)1天。

32、5、菌落特征描述如下（1）大?。捍?、中、小、針尖狀。可先將整個(gè)平板上的菌落粗略觀察一下，再?zèng)Q定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)；（2）顏色：黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等；（3）干濕情況; 干燥、濕潤(rùn)、粘稠；（4）形態(tài)：圓形、不規(guī)則等；（5）高度：扁平、隆起、凹下；（6）透明程度：透明、半透明、不透明；（7）邊緣：整齊、不整齊。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌落ABCDEFGH空氣1空氣2數(shù)量*大小顏色干濕情況形態(tài)高度透明程度邊緣簡(jiǎn)要說(shuō)明*菌落數(shù)量可用+和-符號(hào)表示，從多到少依次為：+，+，+，+，+，-六、思考題1、列舉2-3類(lèi)微生物，說(shuō)明它們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)條件下（肉膏蛋白胨瓊脂平板，37）不能生長(zhǎng)。2、比較各種來(lái)源的

33、樣品，哪一種菌落數(shù)和菌落類(lèi)型最多？為什么？實(shí)驗(yàn)五 普通光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、復(fù)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分功能和使用方法；2、學(xué)習(xí)掌握油鏡的使用方法及油鏡使用中的注意事項(xiàng)；3、利用油浸系物鏡觀察細(xì)菌。二、實(shí)驗(yàn)原理微生物的個(gè)體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到。因此，顯微鏡就成為微生物學(xué)研究工作者不可缺少的基本工具。顯微鏡的結(jié)構(gòu)1、機(jī)械裝置（1）鏡座：是顯微鏡的底座，支持整個(gè)鏡體，使顯微鏡放置穩(wěn)固。（2）鏡柱：鏡座上面直立的短柱，支持鏡體上部的各部分。（3）鏡臂：彎曲如臂，下連鏡柱，上連鏡筒，這取放鏡體時(shí)手握的部位。鏡臂的下端與鏡柱連接處有一活動(dòng)關(guān)節(jié)，可使鏡體在一定范圍內(nèi)

34、后傾，便于觀察。（4）鏡筒：為顯微鏡上部圓形中空的長(zhǎng)筒，其上端放置目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相連，并使目鏡和物鏡的配合保持一定的距離，其作用是保護(hù)成象的光路與亮度。（5）物鏡轉(zhuǎn)換器：接于鏡筒下端的圓盤(pán)，可自由轉(zhuǎn)動(dòng)，盤(pán)上有3-4個(gè)螺旋圓孔，為安裝物鏡的部位，當(dāng)旋動(dòng)轉(zhuǎn)換器時(shí)，物鏡即可固定在使用的位置上，保證物鏡與目鏡的光線(xiàn)合軸。（6）載物臺(tái)：為放置玻片標(biāo)本的平臺(tái)，中央有一圓孔，以通過(guò)光線(xiàn)。兩旁裝有壓片夾或移動(dòng)器，可固定玻片標(biāo)本和移動(dòng)玻片。（7）調(diào)節(jié)器：為了得到清晰的物像，必須調(diào)節(jié)物鏡與標(biāo)本之間的距離，使它與物鏡的工作距離相等。這種操作叫調(diào)焦。在鏡臂兩側(cè)有粗、細(xì)調(diào)焦螺旋各一對(duì)，旋轉(zhuǎn)時(shí)可使鏡筒上升或下降。

35、大的一對(duì)是粗調(diào)焦螺旋，調(diào)動(dòng)鏡筒升降距離大，旋轉(zhuǎn)一周可使鏡筒移動(dòng)2毫米左右。小的一對(duì)是細(xì)焦螺旋，調(diào)動(dòng)鏡筒的升降距離很小，旋轉(zhuǎn)一周可使鏡筒移動(dòng)約0.1毫米。在用低倍物鏡觀察時(shí)，使用粗調(diào)焦螺旋；用高倍物鏡觀察時(shí)，用細(xì)調(diào)焦螺旋。2、光學(xué)系統(tǒng)（1）光源（2）聚光器（或鏡）：裝在載物臺(tái)下，由聚光鏡（幾個(gè)凸透鏡）和虹彩光圈（可變光欄）等組成。它可將平行的光線(xiàn)匯集成束，集中在一點(diǎn)，以增強(qiáng)被檢物件。聚光器可以上下調(diào)節(jié)，如用高倍鏡時(shí)，視野范圍小，則需上升聚光器，用低倍物鏡時(shí)，視野范圍大，可下降聚光器。（3）光圈：裝在聚光器內(nèi)，位于載物臺(tái)下方，撥動(dòng)操縱桿，可使光圈擴(kuò)大或縮小，借以調(diào)節(jié)通光量。 3、光學(xué)部分（1）物鏡

36、：這是決定顯微鏡質(zhì)量的最主要部件，安裝在鏡筒下端的物鏡轉(zhuǎn)換器上，一般有三個(gè)放大倍數(shù)不同的物鏡，即低倍（10）、高倍（40）、油鏡（100）。使用油鏡時(shí)，必須在蓋玻片上和聚光器上滴加一滴香柏油（鏡油），然后才能使用。在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標(biāo)志，它反應(yīng)該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率（N.A.）工作距離（mm）100.257.0400.650.651001.300.15（2）目鏡：安裝在鏡筒上端，它的作用是將物鏡所成的像進(jìn)一步放大，使之便于觀察。其上刻有5、10、16等，表示不同放大倍數(shù)，可根據(jù)當(dāng)時(shí)需要選擇使用。目鏡內(nèi)的光欄上可裝一段頭發(fā)，

37、在視野中則為一黑線(xiàn)，叫指針，可以用它指示要觀察的部分。顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率：放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù)顯微鏡的分辨率：表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為：D=/2nsin。式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離，l：可見(jiàn)光的波長(zhǎng)（平均0.55mm)，n：物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率，a：鏡口角（即入射角）。與其他物鏡不同，油鏡需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，原因有二：1）增加照明亮度。油鏡的放大倍數(shù)可達(dá)100，焦距很短，直徑很小，但所需要的光照強(qiáng)度卻最大。為了不使通過(guò)的光線(xiàn)有所損失，必須加入與玻璃的折射率（n=1.55）相仿的鏡油。通常用香柏油（n=1.

38、52）。2）增加顯微鏡的分辨率，油鏡的分辨率可達(dá)到0.2m左右。三、實(shí)驗(yàn)材料：1、自制觀察玻片；2、香柏油、二甲苯等；3、普通光學(xué)顯微鏡等。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）顯微鏡的使用操作1、顯微鏡的安置；2、光源調(diào)節(jié)；3、調(diào)節(jié)雙筒顯微鏡的目鏡；4、聚光器數(shù)值孔徑的調(diào)節(jié)；5、觀察。（二）顯微鏡觀察的操作順序1、低倍鏡觀察觀察任何標(biāo)本，都必須先用低倍鏡，因?yàn)榈捅剁R的視野范圍大，容易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定觀察的部位。兩眼從側(cè)面注視物鏡，并慢慢按順時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，使鏡筒徐徐下必至物鏡玻片約5毫米處，接著用左眼注視鏡筒內(nèi)，同是按反時(shí)針?lè)较颍蛴?、向?nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋使鏡筒緩慢上升，直到看見(jiàn)清晰的物像為止（注意不可在調(diào)

39、焦點(diǎn)時(shí)邊觀察邊下必鏡筒，否則會(huì)使物鏡和玻片觸碰，壓碎破片，損壞物鏡）。如一次調(diào)節(jié)看不到物像，應(yīng)重新檢查材料是否在光軸線(xiàn)上，重新移正材料，再重復(fù)上述操作過(guò)程直至物像出現(xiàn)和清晰為止。為了使物像更加清晰，此時(shí)可使用細(xì)調(diào)焦螺旋，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)到使物像最清楚時(shí)為止，但切忌連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)多圈，以免損傷儀器的精確度。當(dāng)細(xì)調(diào)焦螺旋向上或向下轉(zhuǎn)不動(dòng)時(shí)，就是轉(zhuǎn)到了極限，千萬(wàn)不能再硬擰，而應(yīng)重新調(diào)粗調(diào)焦螺旋，把物鏡與標(biāo)本的距離稍稍拉開(kāi)后，再反擰細(xì)焦螺旋，約10圈左右（因一般可動(dòng)范圍為20圈）。2、高倍鏡觀察先用低倍鏡找到要觀察的物像，然后把物像移至視野中央，最后換用高倍鏡，再調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋對(duì)焦，調(diào)清物像，同時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)光圈以增加通

40、光量。在換用高倍鏡觀察時(shí)，視野變小變暗，所以要重新調(diào)節(jié)視野的亮度，此時(shí)或升高聚光器或放大虹彩光圈。3、油鏡觀察（1）用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔；（2）調(diào)節(jié)光亮度；（3）低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào)；（4）依次再進(jìn)行中倍、高倍觀察；（5）油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止；（6）換片：另?yè)Q新片，必須從第三條開(kāi)始操作；（7）用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。（三）觀察玻片的制作1）取一干凈載玻片；2）在載

41、玻片中間滴一小滴水；3）用接種環(huán)取少量斜面培養(yǎng)基上的細(xì)菌于水中；4）自然干燥；5）火焰固定；6）染色：用染液染色一分鐘；7）水洗；8）自然干燥。五、注意事項(xiàng):1.顯微鏡使用中的注意事項(xiàng)（1）不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞； （2）鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度；（3）觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面：（4）觀察時(shí)，兩眼睜開(kāi)，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖；（5）拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿；

42、（6）顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。2.油鏡使用注意（1）在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。（2）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開(kāi)通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果取上次實(shí)驗(yàn)得到的2-3個(gè)菌落制片，繪制你的觀察結(jié)果。七、思考題1、用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？在載玻片和鏡頭之間滴加香柏油有什么作用？2、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)體會(huì)，談?wù)剳?yīng)如何根據(jù)所觀察微生物的大小選擇不同的物鏡進(jìn)行有效的觀察。實(shí)驗(yàn)六 革蘭氏染色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

43、的1、了解革蘭氏染色原理；2、鞏固顯微鏡操作技術(shù)；3、學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法。二、實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色與細(xì)胞壁密切相關(guān)，是C. Gram（革蘭）于1884年發(fā)明的一種鑒別不同類(lèi)型細(xì)菌的染色方法。通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物。革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類(lèi)脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類(lèi)脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋

44、結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。 革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陽(yáng)性桿菌 Procedures of Gram Staining初染1min結(jié)晶紫媒染1min碘液脫色30s復(fù)染2min復(fù)紅/番紅95%乙醇G+G-革蘭氏染色三、實(shí)驗(yàn)材料：1、菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、環(huán)境中分離得到的菌種；2、試劑：草酸銨結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、番紅染液；3、儀器材料：顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、生理鹽水等。附：實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配制方法1、結(jié)晶紫染色液(Huclker改訂)A液：結(jié)晶紫 2.5g，95%酒精 25.0ml

45、；B液：草酸銨 1.0g，蒸餾水 100ml。將結(jié)晶紫研細(xì)后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。將草酸銨溶于蒸餾水，配成B液。兩液混合即成。2、盧戈氏碘液的成份為5%碘、10%碘化鉀的清水。碘本身很難在水中溶解，但是假如水中已經(jīng)有被溶解了的碘離子的話(huà)，那么碘可以通過(guò)形成多碘離子而被溶解；碘很容易溶解在乙醇中，但是由于乙醇易燃、易揮發(fā)、有時(shí)會(huì)導(dǎo)致副作用，因此有時(shí)乙醇不宜作為溶液。溶有碘的乙醇被稱(chēng)為碘酒。試劑配方：碘化鉀 2g；蒸餾水 300ml；碘 1g。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，待全溶解后再加碘，振蕩溶解后稀釋至300ml，保存在棕色玻璃瓶?jī)?nèi)。用時(shí)可將其稀釋2-10倍，這樣染色不致過(guò)深，效

46、果更佳。四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）涂片：常規(guī)方法涂片；（2）干燥：讓涂片自然晾干；（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過(guò)火焰2-3次固定（以不燙手為宜）；（4）初染：加適量（以蓋滿(mǎn)細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色40s；水洗至流出水無(wú)色，吸去殘水；（5）媒染：用碘液覆蓋菌膜1min，水洗至流出水無(wú)色；（6）脫色：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，在白色背景下將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色（一般20-30s）至流出液無(wú)色，立即用水洗去乙醇；（7）復(fù)染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，滴加番紅復(fù)染3min；水洗，吸去殘水；（8）晾干；（9）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。五、注意事項(xiàng):1、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過(guò)度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定；2、染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果；3、盡量選用幼齡的細(xì)菌。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果描述你所處理的至少4種菌的染色效果。七、思考題1、革蘭氏染色是否成功，有哪些問(wèn)題需要注意，為什么？2、為什么用老齡菌進(jìn)行革蘭氏染色會(huì)造成假