高效液相色譜法分析芳香類化合物

1、 高效液相色譜法分析芳香類化合物 系別：化學(xué)物理系 學(xué)號(hào)：pb09206108 姓名：倪 宇 飛 高效液相色譜法分析芳香類化合物1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?） 了解高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及基本作用；（2） 了解色譜分離的基本原理，尤其是反相色譜的基本規(guī)律；（3） 掌握色譜的基本定性、歸一化定量方法。2、 實(shí)驗(yàn)原理以液相為流動(dòng)相的色譜稱為液相色譜。廣義的講，可以分為柱色譜、紙色譜、薄層色譜。如果按照兩相分離過(guò)程的物理化學(xué)原理進(jìn)行分類，可分為吸附色譜、分配色譜、凝膠色譜、離子色譜、親和色譜等。高效液相色譜適合于分析沸點(diǎn)高不易揮發(fā)、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大的、不同極性的有機(jī)化合物，生物活性物質(zhì)和多種天然

2、產(chǎn)物，合成的和天然的高分子化合物等。它們涉及石油化工產(chǎn)品、食品、合成藥物、生物化工產(chǎn)品及環(huán)境污染物等，約占全部有機(jī)化合物的80%.。1. 吸附色譜吸附色譜法又稱為液固色譜法，是液相色譜法中發(fā)展歷史最長(zhǎng)的一種方法。液固色譜法的固定相為固體吸附劑，常用的是碳酸鈣、硅膠、三氧化二鋁、氧化鎂、活性炭等。固定相的表面存在著分散的吸附中心，溶質(zhì)分子和流動(dòng)相分子在吸附劑表面呈現(xiàn)的吸附中心上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)吸附，溶質(zhì)分析反復(fù)的被吸附，又反復(fù)的被流動(dòng)相分子頂替解吸，隨著流動(dòng)相的流動(dòng)而在柱子中向前移動(dòng)。由于不同的待測(cè)分子在固定相表面的吸附能力不同，使得吸附-解吸附的速度也不同，導(dǎo)致各組分洗出的時(shí)間不同，實(shí)現(xiàn)各組分物質(zhì)被分

3、離，所以溶質(zhì)分子和流動(dòng)相分子在吸附劑表面的吸附-解吸附平衡就是液固吸附色譜具有選擇性分離的基礎(chǔ)。2. 分配色譜分配色譜是基于樣品分子在包裹與惰性載體（基質(zhì)）上的固定相液體和流動(dòng)相液體直接按分配平衡的色譜方法，又稱為液液色譜法。在固液色譜中使用的固體吸附劑，如全多孔球形、無(wú)定形微粒硅膠、全多孔氧化鋁等皆可作為液液色譜固定相的惰性載體。但作為固定相的液體往往容易溶解到流動(dòng)相找哦那個(gè)去，導(dǎo)致保留值減少，柱效下降，使得重復(fù)性很差，不大方便人們所采用。直到化學(xué)鍵合固定相的出現(xiàn)，才使液液色譜得到廣泛應(yīng)用?；瘜W(xué)鍵合固定相是將固定相通過(guò)化學(xué)結(jié)合的方法結(jié)合到惰性載體上，這樣固定相就不會(huì)溶解到流動(dòng)相中。常見的化學(xué)

4、鍵固定相有十八烷基三氯硅烷等，它是將十八烷基三氯硅烷通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八碳烷基，其極性很小，而常用的流動(dòng)相，如甲醇、乙腈以及它們和水的混合溶液，極性比固定相大，因此成為反相高效液相色譜；反之流動(dòng)相的極性比固定相小，稱之為正相高效液相色譜。3. 凝膠色譜凝膠色譜與其他幾種液相色譜不同，不是通過(guò)樣品分子與固定相之間的相互作用力（吸附、分配和離子交換等）的差異被分離，而是根據(jù)樣品分子的尺寸不同而達(dá)到分離目的，因而凝膠色譜又常被稱作體積排阻或空間排阻色譜。凝膠色譜以多孔性填料做固定相。樣品分子的分離受填料孔徑的影響，比填料孔徑大的樣品分子不能進(jìn)入填料的孔內(nèi)

5、，最先流出色譜柱。填料顆粒上有很多不同尺寸的孔，在那些可以進(jìn)入孔內(nèi)的樣品分子中，體積較大的分子可以利用的孔較少，所以樣品分子按體積從大到小的順序依次流出色譜柱。在凝膠色譜中，流動(dòng)相的作用不再是控制分離，而是溶解樣品。以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的稱凝膠滲透色譜（gpc），以水溶液作為流動(dòng)相的成為凝膠過(guò)濾色譜。4親和色譜、離子色譜親和色譜與其他色譜伐相比較，其突出優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)天然生物活性物質(zhì)進(jìn)行高特效的分離和純化，具有高的濃縮效應(yīng)，可以從大量的樣品基本中分離純化出所希望獲取的少量生物活性物質(zhì)。這種特效的原因是在親和色譜固定相基體上，鍵和了具有錨式結(jié)構(gòu)特征的配位體。離子色譜（gpic），又稱為離子交換色譜，

6、分離機(jī)理為離子交換。它是基于離子交換樹脂上可離解的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子之間進(jìn)行的顆粒交換，依據(jù)這些離子對(duì)交換劑有不同的親和力而被分離。它是離子色譜的主要分離方式，用于親水陰、陽(yáng)離子的分離。5. 儀器結(jié)構(gòu)與原理高效液相色譜儀最基本的組件是輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和工作站。輸液泵將流動(dòng)相以穩(wěn)定的速度（或壓力）輸送至待分析體系，通過(guò)進(jìn)樣器，載著待測(cè)樣品進(jìn)入色譜柱。在色譜柱中，樣品的各組分在色譜柱中被分離，并依次隨流動(dòng)相流至檢測(cè)器監(jiān)測(cè)到的信號(hào)送至工作站記錄處理和保存。（1） 儲(chǔ)液灌液相色譜中所使用的儲(chǔ)液灌應(yīng)耐腐蝕可以為玻璃、不銹鋼、氟塑材料或特種塑料聚醚醚酮（peek），容積為0

7、.52.0l。儲(chǔ)液灌必須放置于高于泵體的位置。（2） 輸液泵輸液泵一般須具備以下特點(diǎn)1. 泵體材料耐化學(xué)腐蝕2. 能在高壓下連續(xù)工作3. 輸出流量范圍寬4. 輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高（3） 進(jìn)樣裝置本實(shí)驗(yàn)中使用的進(jìn)樣裝置是較為常見的六通閥進(jìn)樣器，樣品的進(jìn)樣體積用定量管來(lái)確定。 （5） 色譜柱色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管座色譜柱管，其內(nèi)徑多為4.6mm或3.9mm，長(zhǎng)度在1015cm。色譜柱內(nèi)部緊密填充著大量的510m粒度的顆粒作為固定相。（6） 檢測(cè)器檢測(cè)器是用來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后流出物的組成和含量變化的裝置。它利用被監(jiān)測(cè)物的某一物理或化

8、學(xué)性質(zhì)與流動(dòng)相有差異的原理，當(dāng)被監(jiān)測(cè)物質(zhì)從色譜柱中流出時(shí)，會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相的背景發(fā)生變化，從而在色譜圖上一色譜峰的形式表現(xiàn)出來(lái)。被實(shí)驗(yàn)中使用的檢測(cè)器為紫外-可見光（uv-vis）檢測(cè)器，是目前在高效液相色譜中使用最廣泛的檢測(cè)器，它既具有較高的靈敏度和選擇性，也有很廣寬廣的應(yīng)用范圍。由于uv-vis對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成變化不是很敏感，所以也可以用于梯度洗脫。（7） 工作站液相色譜的工作站主要是用進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和處理，一般都可以在線模擬顯示，數(shù)據(jù)自動(dòng)采集、處理和儲(chǔ)存，并可對(duì)整個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制。6. 數(shù)據(jù)的處理方式本實(shí)驗(yàn)采用的定量分析方式為歸一化法，把所有的組分含量之和按100%進(jìn)行計(jì)算。歸一

9、化發(fā)的重要前提是樣品中的所有組分都可以流出色譜柱，并在檢測(cè)器上都能產(chǎn)生信號(hào)。由于存在雜質(zhì)的原因，該方法并不能測(cè)定出樣品中某組分的含量，只能測(cè)出個(gè)組分之間的含量之比。計(jì)算公式為 其中ai為組分i的峰面積；fi為組分i的質(zhì)量（或摩爾、體積）校正因子。3、 儀器與試劑1. 儀器agilent series1100型液相色譜儀：真空在線脫氣裝置；四元梯度泵；多波長(zhǎng)檢測(cè)器；ods-c18色譜柱；2. 試劑 甲醇（色譜純）；水（超純水）；苯、萘、菲的甲醇溶液，三種化合物的混合甲醇溶液。 4、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 實(shí)驗(yàn)條件的確定打開計(jì)算機(jī)，待計(jì)算機(jī)啟動(dòng)完畢后，依次打開輸液泵、真空在線脫氣裝置、柱溫箱、檢測(cè)器開關(guān)。

10、通訊完畢后，設(shè)定操作條件。流動(dòng)相： 甲醇：水=80：20（體積流量比）?？偭魉伲?0.500ml/minuv-vis檢測(cè)器設(shè)定在220nm、254nm兩個(gè)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，柱溫30oc，流動(dòng)相的比例可以按照實(shí)驗(yàn)的需要在工作站自帶軟件的控制單元中修改。2.定性分析（確定保留時(shí)間）流動(dòng)相比例設(shè)定為甲醇：水=80：20，等基線穩(wěn)定后依次將苯、萘、菲的甲醇溶液進(jìn)樣5微升，得出三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間。由于儀器在之前一直處于開啟狀態(tài)，故不需要等待基線之水平。在流動(dòng)相的組分為甲醇：水=80：20的條件下，工作站顯示流動(dòng)相壓強(qiáng)穩(wěn)定在約40mpa附近。色譜測(cè)試結(jié)果如下表所示（對(duì)于單一組分的測(cè)試溶液，峰面積并沒(méi)有實(shí)

11、際應(yīng)用的意義，故并未在這里寫出） 苯 萘 菲220nm保留時(shí)間/min 4.583 5.723 7.534254nm保留時(shí)間/min 4.583 5.721 7.534從這一結(jié)果可以初步看出色譜的uv-vis檢測(cè)器選擇在的檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)于保留時(shí)間的影響并不大，影響保留時(shí)間的主要因素有進(jìn)樣器到色譜柱之間管線的規(guī)格，輸液泵的流速，柱溫，色譜柱的規(guī)格，流動(dòng)相的物理性質(zhì)等。通常來(lái)說(shuō)，同一物質(zhì)在同一儀器相同條件下測(cè)得的保留時(shí)間大致相等。其次，由于反相色譜中流動(dòng)相的極性比固定相大，因此極性較大的溶質(zhì)會(huì)先被洗脫，即極性大的溶質(zhì)保留時(shí)間較短。在本實(shí)驗(yàn)中也得到驗(yàn)證，苯、萘、菲的極性是遞減的，反映在色譜圖上就是它們?cè)?/p>

12、同一儀器相同測(cè)試條件下的保留時(shí)間遞增。3. 將三種物質(zhì)的混合溶液進(jìn)樣5微升，在同樣的測(cè)試條件下，記錄色譜曲線，確定各峰保留時(shí)間。測(cè)試結(jié)果見下表 檢測(cè)器波長(zhǎng) 項(xiàng)目 苯 萘 菲 220nm保留時(shí)間/min 4.601 5.730 7.537 峰面積 228.88731 2.44371104 890.38922 254nm保留時(shí)間/min 4.600 5.731 7.537 峰面積 937.72241 1785.11499 2211.303908在測(cè)試混合溶液時(shí)，關(guān)于uv-vis檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，并不是選用組分的最大吸收波長(zhǎng)，因?yàn)椴煌M分的最大吸收波長(zhǎng)并不相同，對(duì)于復(fù)雜組分的溶液來(lái)說(shuō)，不可能使每

13、個(gè)物質(zhì)都達(dá)到最大吸收。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中選擇的是一個(gè)兼顧波長(zhǎng)，即讓盡可能對(duì)的組分在檢測(cè)波長(zhǎng)處有較強(qiáng)的吸收，且每個(gè)組分之間的吸收強(qiáng)度相差不可以太大。與單組分的溶液進(jìn)行對(duì)比，可以看到相應(yīng)組分的保留時(shí)間并沒(méi)有太大變化。已知在254nm條件下，各物質(zhì)的矯正因子分別是苯1.00 萘0.08 菲0.01.校正因子的引入是為了解決混合溶液中不同組分在同一波長(zhǎng)處吸光系數(shù)不同造成色譜圖上相應(yīng)峰面積不代表實(shí)際物質(zhì)的濃度之比這一問(wèn)題。將數(shù)據(jù)帶入之前的計(jì)算公式可得 需要注意的是計(jì)算出的結(jié)果并不是三種組分在混合溶液中占得比例，而是各組分在這三種組分中占得比例。因?yàn)槿芤褐写嬖陔s質(zhì)（這一點(diǎn)從色譜圖中的雜質(zhì)峰也可以看出），且雜質(zhì)的

14、歸一化因子是不可能得知的，因此無(wú)法算出某組分在溶液中實(shí)際的相對(duì)含量。實(shí)際上三種組分在溶液中的相對(duì)含量是要略小于該值的。由于將上面的形式化成精確的連比形式比較繁瑣且沒(méi)有太大意義，故這里不再化為連比形式。從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出無(wú)論是在混合樣中還是獨(dú)立的溶液，各組分顯影的保留時(shí)間并沒(méi)有變化。4. 流動(dòng)相組成對(duì)混合樣保留時(shí)間的影響梯度條件 時(shí)間/min 函數(shù) 參數(shù) 0 更改流動(dòng)相溶劑組分溶劑組分：甲醇:80.0% 水:20.0% 4 更改流動(dòng)相溶劑組分 溶劑組分：甲醇:90.0% 水:10.0% 5 更改流動(dòng)相溶劑組分溶劑組分：甲醇:100.0% 水:0.0%設(shè)定開始是的流動(dòng)相組分為甲醇：水=80：20

15、；平衡至極限穩(wěn)定后，開始進(jìn)樣。完成一次梯度洗脫后將流動(dòng)相的組分重新設(shè)定為初始狀態(tài)，穩(wěn)定10分鐘后，開始第二次梯度洗脫。測(cè)試結(jié)果如下表所示 檢測(cè)器波長(zhǎng) 項(xiàng)目 苯 萘 菲 220nm保留時(shí)間/min 4.430 5.308 6.538 峰面積 430.60651 2.26765104 882.17023 254nm保留時(shí)間/min 4.431 5.307 6.538 峰面積 927.26422 1747.91797 2252.18433 計(jì)算結(jié)果的意義與之前相同，不再重復(fù)說(shuō)明，值得注意的是，在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)可以看出隨著時(shí)間的變化，流動(dòng)相中有機(jī)組分的比例在上升，這也就使得每種組分的洗脫時(shí)間均變短，而

16、且越是靠后的組分算短的時(shí)間越多，直觀上看，色譜圖中每個(gè)峰之間的距離變小了。梯度條件2 時(shí)間/min 函數(shù) 參數(shù) 0 更改流動(dòng)相溶劑組分溶劑組分：甲醇:80.0% 水:20.0% 3 更改流動(dòng)相溶劑組分 溶劑組分：甲醇:90.0% 水:10.0% 4 更改流動(dòng)相溶劑組分溶劑組分：甲醇:100.0% 水:0.0%測(cè)試數(shù)據(jù) 檢測(cè)器波長(zhǎng) 項(xiàng)目 苯 萘 菲 220nm保留時(shí)間/min 4.595 5.565 6.659 峰面積 221.01622 2.10591104 945.32166 254nm保留時(shí)間/min 4.594 5.568 6.659 峰面積 1001.71021 1913.46741

17、2325.88770各組分含量 將兩次梯度洗脫的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比可以看出相應(yīng)的峰面積有大約10%的差距，且第二組梯度洗脫的保留時(shí)間比第一次洗脫略長(zhǎng)。這兩次洗脫的區(qū)別在于第二次洗脫時(shí)流動(dòng)相中甲醇比例的變化速率更快，即洗脫相的極性減小的更快，因此可以初步推知在梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的極性減小的越快，需要的洗脫時(shí)間越長(zhǎng)。注：上述計(jì)算中涉及到的多有組分含量計(jì)算結(jié)果均為某一組分在三種組分中所占的比例，并不是在混合溶液中所占的比例。5、 思考題（1） 反相色譜的基本規(guī)律是什么？為什么會(huì)有這樣的規(guī)律?反相色譜的基本規(guī)律是流經(jīng)色譜柱的待測(cè)樣品中極性較大的組分將會(huì)先被洗脫，即極性相對(duì)較大的的組分保留時(shí)間較短。這是因?yàn)榉聪嗌V的流動(dòng)相的極性比固定相大，根據(jù)相似相容原理，極性較大的組分的更易溶解到流動(dòng)相中，從而更容易被洗脫。（2) 反相色譜中流動(dòng)相的組成對(duì)保留時(shí)間有何影響？通常情況下認(rèn)為洗脫速率與流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例有如下關(guān)系 lnk=a+bm其中k是洗脫速率常數(shù)，m代表流動(dòng)相中有機(jī)溶劑所占的比例，對(duì)于有機(jī)待測(cè)樣品來(lái)說(shuō)，有機(jī)溶劑所占比例越大時(shí)洗脫速率越大，保留時(shí)間越短（一般對(duì)于有機(jī)樣品來(lái)說(shuō)a是正值）。（3） 在什么情況下，可以用面積歸一化發(fā)作定量分析？有什么優(yōu)缺點(diǎn)？歸一化法的前提是樣品中所有的組分均能流出色譜柱，并在色譜的檢測(cè)器上均能產(chǎn)生信號(hào)。同時(shí)對(duì)于每一組