蛋白質組學研究介紹結合雙向電泳

1、 蛋白質組學介紹蛋白質組學介紹 結合結合bio-rad相關儀器相關儀器one genome many proteomes對生物的生化功能,形成途徑與代謝過程之研究而更加了解 normal geneexpression基因體功能的最終目的就是表現蛋白質;基因表現及調控(gene expression and regulation)的過程,則是為了保障蛋白質能適時,適地并適量的表現 中心法則中心法則 蛋白質組學蛋白質組學(proteomics)，就是從整體的角度，分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律的一個新的研究領

2、域。蛋白質組學與基因組學的關系：蛋白質組學與基因組學的關系：1、蛋白質組與基因組相對應2、基因組是相對穩(wěn)定的，而蛋白質組是一個動態(tài)的概念3、蛋白質組是基因組研究不可缺少的后續(xù)部分蛋白質組學蛋白質組學 蛋白質組學的研究可以幫助我們去尋找新的疾病指標,相信在不久的將來將有助于監(jiān)測疾病的進程,更進一步有助于疾病的治療。1-1 心血管疾病研究領域心血管疾病研究領域 擴大性心肌病變(dilated cardiomyopathy, dcm )是一種嚴重的心臟疾病,也是現代繁忙的都市人經常易患的疾病,最后將導致心臟失去功能;病人通常都只能期待換心以維持生命。 運用蛋白質體的方法已經鑒定出心肌中150種蛋白質

3、,比較后發(fā)現有25個蛋白質有明顯的差異;經由這些已確認的蛋白質資料庫與病人(或高危險群)的蛋白質做比對,或許可以在疾病產生初期達到早期預防的目的. 一、疾病診斷一、疾病診斷蛋白質組學應用蛋白質組學應用1-2腫瘤研究領域腫瘤研究領域1-2-1肺癌肺癌 肺癌是最具腫瘤性 (oncological) 的疾病之一.臨床上肺癌的診斷往往已屬晚期.直至目前為止,并無有效的治療方案可得.所以任何有助于肺癌診斷或預后的發(fā)展都是有助于肺癌的治療方針的。 因此,許多科學家致力于以雙向電泳技術研究肺癌.在分析組織病理學上不同種類的肺癌細胞時,結果發(fā)現不同組織病理類型細胞體會有不同的蛋白質表現圖譜。 另外,已發(fā)現有一

4、種專一性的蛋白質僅會出現在原發(fā)性肺腺癌上.例用此技術將可有效地鑒定出新的腫瘤標志 (tumor marker),在鑒別診斷麟狀上皮細胞肺癌與腺癌時有相當大的助益。蛋白質組學應用蛋白質組學應用 人類的腎臟癌是很難治愈的癌癥,其中源自于近端腎小管上皮細胞的腎細胞癌大約占成人惡性腫瘤的3 %.但如同許多實質性腫瘤般,腎細胞癌發(fā)現時期均屬癌癥末期,外科手術已難治愈的階段.并且無適當的腫瘤標志可參考。 科學家在用雙向電泳技術研究腎臟癌組織的研究中發(fā)現有四種蛋白質的表現在腎癌細胞中會消失. 雖然該研究沒有發(fā)現特定的標志蛋白質，但尚有許多可能與該癌癥發(fā)生相關的蛋白質仍待被鑒定.1-2-2腎臟癌腎臟癌 蛋白質

5、組學應用蛋白質組學應用蛋白質組學應用蛋白質組學應用1-2-3結腸癌結腸癌 結腸癌是一種常見的癌癥.利用雙向電泳與免疫轉印技術,分析自人類結腸癌細胞粗萃取蛋白質中分離出的一系列蛋白質.并將有意義之蛋白質點切割出,進行蛋白質序列分析以鑒定這些蛋白質。 結果發(fā)現 hsp 70 酸性的 isoforms 在結腸息肉 (polypous) 與惡性組織 (malignant tissues) 中的表現不論是在量上或質上均有相當的差異;此外在慢性發(fā)炎性腸炎的黏膜或 crohns 腸炎組織中則有不同的 hsp 70 堿性 isoform 被發(fā)現。蛋白質組學應用蛋白質組學應用1-3神經精神系統(tǒng)疾病研究領域神經精

6、神系統(tǒng)疾病研究領域 對精神分裂癥患者以及正常人群的腦脊液進行蛋白質組學的研究。對老年癡呆癥(lzhermer 癥)的研究：通過對神經原纏結的2de及質譜分析則發(fā)現,其主要蛋白質成份-微管相關蛋白(map)在疾病狀態(tài)下發(fā)生了磷酸化、糖基化等多種修飾作用。二、病原微生物的蛋白質組學研究二、病原微生物的蛋白質組學研究1、確定致病菌毒力;2、尋找新的診斷標記物;3、為疫苗的研制尋找新的候選抗原;4、闡明藥物抗菌作用機制與病菌耐藥性發(fā)生機理,為新的抗生素的研制尋找靶點。蛋白質組學應用蛋白質組學應用三、蛋白質組學在藥物開發(fā)中的應用 疾病特異性蛋白的不斷發(fā)現為藥物設計提供了豐富的靶點,另外通過翻譯后修飾的蛋

7、白質組學研究,使得新藥研制獲得了前所未有的契機。以dsps為靶點,分析其分子結構,定向合成有效藥物成為藥物設計的理想模式。蛋白質組學應用蛋白質組學應用蛋白質組學研究流程蛋白質組學研究流程condition acondition b34710ph+-+sample preparationfirst dimensionseconddimensionstainingimaginganalysis &extractionmass spectrometricidentification of spots2-d expression proteomics methodology 根據實驗流程介紹相關儀器根

8、據實驗流程介紹相關儀器 樣品提取試劑盒樣品提取試劑盒 通過多維層析的技術可以獲得常規(guī)2d技術中比較難得到的低豐度低豐度蛋白和疏水性強的蛋白蛋白和疏水性強的蛋白,是對2d技術的一個必要補充。 液相等電聚焦儀液相等電聚焦儀根據蛋白質等電點的不同將其分離，這項功能強大的非變性技術可快速、簡單而有效地從復雜蛋白混合物中純化分離出低豐度蛋白質從復雜蛋白混合物中純化分離出低豐度蛋白質，快捷的收集已分步分離的樣品，合并或富集合并或富集，甚至可以對初步分離的樣品進行再分離。對于那些難溶、不溶性蛋白或者不能通過以等電聚焦原理為基礎的膠分離手段的樣品，使用液相等電聚焦是非常有效的實驗方法。根據實驗流程介紹相關儀器

9、根據實驗流程介紹相關儀器二、樣品定量二、樣品定量rc dc protein assay 蛋白定量試劑盒蛋白定量試劑盒smartspecplus核酸蛋白測定儀核酸蛋白測定儀根據實驗流程介紹相關儀器根據實驗流程介紹相關儀器三、雙向電泳第一向三、雙向電泳第一向protean i12ief等電聚焦儀等電聚焦儀主要特點主要特點每個泳道可獨立控制每個泳道可獨立控制 這意味著：這意味著：不同的樣品不同的樣品不同的方法不同的方法不同的不同的ph梯度梯度 bio-rad 是是唯一唯一可以提供獨立泳道控制的可以提供獨立泳道控制的ief系統(tǒng)系統(tǒng)價值所在價值所在每個泳道獨立控制每個泳道獨立控制優(yōu)點：節(jié)省時間優(yōu)點：節(jié)省

10、時間減少優(yōu)化試驗條件需要的運行次數減少優(yōu)化試驗條件需要的運行次數同時可運行多個試驗同時可運行多個試驗優(yōu)點：保證試驗質量優(yōu)點：保證試驗質量個別不良樣品不會使整個試驗失敗個別不良樣品不會使整個試驗失敗更好的重復性更好的重復性原因原因?可對每個泳道設定最大電流可對每個泳道設定最大電流傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的ief是對所有泳道設定一個總的最大電流是對所有泳道設定一個總的最大電流如果同一次運行過程中樣品的導電性能差別較大，如果同一次運行過程中樣品的導電性能差別較大，可造成電流在各個泳道內分布不均可造成電流在各個泳道內分布不均protean i12 ief : 為每一泳道設定獨立的電流限為每一泳道設定獨立的電流限制，

11、避免了樣品間的相互影響，提高試驗重現性和制，避免了樣品間的相互影響，提高試驗重現性和一致性。一致性。節(jié)省時間保證試驗質量protean i12 ief cell傳統(tǒng)傳統(tǒng)ief：每個泳道的電流都受到其他泳道內樣品影響：每個泳道的電流都受到其他泳道內樣品影響都都受到其他泳道內樣品影響受到其他泳道內樣品影響60a140a100a100a傳統(tǒng) iefprotean i12 ief等電聚焦原理等電聚焦原理: 在第一向分離中蛋白質先按其等電點不同分開（isoelectric point pi值）。pi值就是使蛋白質不帶凈電荷，且在電場中不發(fā)生遷移的特定ph值。這項將蛋白質按其等電點分離的技術稱為等電聚焦。

12、 +ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 101-d electrophoresisthe 1st d: isoelectric focusingreadyprep ipg strips根據實驗流程介紹相關儀器根據實驗流程介紹相關儀器四、雙向電泳第二向四、雙向電泳第二向sds-pagesds-page+ph 3ph 7.5ph10ph 3ph 7.5ph10chargesizethe 2nd d: sds-pageproteins migrate through the gel at a rate propor

13、tional to their size.smallest proteins travel the furthest distancepim.wt.2-d electrophoresis根據實驗流程介紹相關儀器根據實驗流程介紹相關儀器五、染色五、染色gs-800densitometerpdquestimage analysis六、圖像的采集及分析六、圖像的采集及分析pdquest分分析流程：析流程：pdquestintuitive spot detection wizardexcision / digestion七、切膠七、切膠質譜前處理質譜前處理差異蛋白點的切取脫色膠內酶解肽片斷提取點樣質譜分析數據庫比對進行鑒定手工切膠的缺點：手工切膠的缺點： 低豐度蛋白無法準確切取非密閉系統(tǒng),污染無法避免角蛋白污染其它雜質污染工作時間長全自動蛋白切取儀可切取的范圍廣泛，速度快，精度高，避免污染。mass spectrometry5000750010000125001500002550751000255075100025507510002550751000255075100025507510050007500100001250