蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

1、第4章 蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)通論（一）蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類（二）蛋白質(zhì)的形狀和大?。ㄈ┑鞍踪|(zhì)分子的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)層次（四）蛋白質(zhì)功能的多樣性（一）蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類 1、化學(xué)組成、化學(xué)組成(元素組成元素組成)(proteins element composing) 元素 百分含量 平均(%) c 50-55 52 h 6.9-7.7 7 o 21-24 23 n 15.0-17.6 16 s 0.3-2.3 2 p 0.4-0.9 0.6 凱氏定氮：粗蛋白質(zhì)含量=蛋白氮6.25 2.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成 (proteins building-block un

2、its) 蛋白質(zhì)(pr)分子量很大，可水解成簡單有機化合物氨基酸（amino acids)，氨基酸按固定的排列順序以共價鍵的形式連接形成長的不分支的鏈。 蛋白質(zhì)是由多肽組成的。 蛋白質(zhì)：分子量6000時，有完整的生物學(xué)功能，至少40個aa。 多肽：分子量6000時，不完全有生物學(xué)功能。 3、蛋白質(zhì)的水解、蛋白質(zhì)的水解 (hydrolysis of proteins)酸水解：酸水解：堿水解堿水解: :酶水解：酶水解：4、蛋白質(zhì)的分類、蛋白質(zhì)的分類 (classification of proteins)根據(jù)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成根據(jù)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成 簡單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性和組成根據(jù)蛋

3、白質(zhì)的溶解性和組成根據(jù)蛋白質(zhì)分子形狀根據(jù)蛋白質(zhì)分子形狀 球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)生物功能根據(jù)蛋白質(zhì)生物功能 活性蛋白質(zhì)和非活性蛋白質(zhì)按分子組成分類按分子組成分類 1.單純蛋白質(zhì) 完全由氨基酸組成，不含非蛋白成分。根據(jù)溶解性的不同，可將簡單蛋白分為以下7類。 2.結(jié)合蛋白（又稱綴合蛋白） 由蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成，后者稱為輔基。根據(jù)輔基的不同，可將結(jié)合蛋白分為以下7類。按分子形狀分類按分子形狀分類 1.球狀蛋白 外形近似球體，多溶于水，大都具有活性，如酶、轉(zhuǎn)運蛋白、蛋白激素、抗體等。球狀蛋白的長度與直徑之比一般小于10。 2.纖維狀蛋白 外形細(xì)長，分子量大，大都是結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白，

4、彈性蛋白，角蛋白等。纖維蛋白按溶解性可分為可溶性纖維蛋白與不溶性纖維蛋白。前者如血液中的纖維蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白。按結(jié)構(gòu)與功能分類按結(jié)構(gòu)與功能分類 （p158頁表頁表4-3） 1 1、酶、酶 2 2、調(diào)節(jié)蛋白：、調(diào)節(jié)蛋白：某些激素、一切激素受體和許多其他調(diào)節(jié)因子都是蛋白質(zhì)3 3、轉(zhuǎn)運蛋白：、轉(zhuǎn)運蛋白：血紅蛋白4 4、貯存蛋白：、貯存蛋白：蛋類中的卵清蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多余的鐵儲存起來，供缺鐵時使用5 5、收縮和游動蛋白：、收縮和游動蛋白：肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白，它們構(gòu)象的改變引起肌肉的收

5、縮；細(xì)菌中的鞭毛蛋白有類似的作用6 6、結(jié)構(gòu)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白 7 7、支架蛋白：、支架蛋白：能同時結(jié)合兩個或多個蛋白質(zhì). 保證了信號傳遞的特異和高效. 錨定蛋白8 8、保護和進攻蛋白：抗體、保護和進攻蛋白：抗體 毒蛋白毒蛋白 9 9、異常蛋白：應(yīng)樂果甜蛋白、異常蛋白：應(yīng)樂果甜蛋白 節(jié)肢彈性蛋白（昆蟲）節(jié)肢彈性蛋白（昆蟲）（二）蛋白質(zhì)的形狀和大小（二）蛋白質(zhì)的形狀和大小蛋白質(zhì)分子的形狀： 球狀蛋白 纖維狀蛋白 膜蛋白蛋白質(zhì)分子的大?。?000-106 表4-4 （三）蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)層次（三）蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)層次 二、肽二、肽(peptides) （一）肽和肽鍵及結(jié)構(gòu) （二）肽的理化性

6、質(zhì) （三）自然界中存在的小肽（一）肽和肽鍵及結(jié)構(gòu)（一）肽和肽鍵及結(jié)構(gòu)1、蛋白質(zhì)通過肽鍵連接、蛋白質(zhì)通過肽鍵連接蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)學(xué)說的證據(jù)：肽鍵是一個酰胺鍵。 （1）蛋白質(zhì)水解前后的結(jié)果分析。 （2）人工合成的多肽和天然蛋白質(zhì)，都可被蛋白水解酶水解，人工合成多肽中氨基酸是肽鍵連接的。 （3）天然蛋白質(zhì)有雙縮脲反應(yīng)。 （4）人工合成的聚合aa的x-光衍射譜和紅外光譜與天然纖維蛋白相似。（5）結(jié)晶牛胰島素的成功，完全證明了蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)學(xué)說的正確性。 2、肽的定義與結(jié)構(gòu)、肽的定義與結(jié)構(gòu) 一分子氨基酸的-羧基與另一分子氨基酸-氨基脫水縮合的化合物叫做肽，氨基酸之間通過酰胺鍵（蛋白質(zhì)化學(xué)中將這類酰胺鍵專稱

7、為肽鍵）連接。肽是一大類物質(zhì)，即： 1）兩個氨基酸組成的肽叫二肽； 2）三個氨基酸組成的肽叫三肽； 3）多個氨基酸組成的肽叫多肽； 4）氨基酸借肽鍵連成長鏈，稱為肽鏈，肽鏈兩端有自由-nh2和-cooh，自由-nh2端稱為n-末端（氨基末端），自由-cooh端稱為c-末端（羧基末端）； 5）構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基酸殘基； 6）肽鏈中的氨基酸的排列順序，一般-nh2端開始，由n指 向c，即多肽鏈有方向性，n端為頭，c端為尾。 3、肽的結(jié)構(gòu)分析、肽的結(jié)構(gòu)分析4、肽的書寫、肽的書寫寫法：從左右，從n末端c末端。 三字母用連線，也有用單字母的。 讀法：酰 酰 酸。 例：ser-gly-t

8、ry-ala-leu 或sgtal， 絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸 結(jié)構(gòu)式： 5、肽鍵的特點、肽鍵的特點 a pure double bond between c and o would permit free rotation around the c n bond. the other extreme would prohibit c n bond rotation but would place too great a charge on o and n. the true electron density is intermediate. the barrier to c n

9、 bond rotation of about 88 kj/mol is enough to keep the amide group planar. 肽鍵的特點肽鍵的特點（1）肽鍵雖是單鍵卻有雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn) （2）肽鍵周圍六個原子在同一平面（酰氨平面）上 （3）相鄰兩個氨基酸的-carbon 在對角(trans)，反式 （4）肽鍵亞氨基在ph 0-14內(nèi)不解離。 6、pro形成的肽鍵形成的肽鍵pro形成的肽鏈肽平面是可以反式也可以順式多肽鏈可以看成由多肽鏈可以看成由c串聯(lián)起來的數(shù)個酰胺平面組成串聯(lián)起來的數(shù)個酰胺平面組成（二）肽的物理化學(xué)性質(zhì)（二）肽的物理化學(xué)性質(zhì)1 1、 旋光性旋光性

10、 一般短肽的旋光度等于其各個氨基酸的旋光度的總和，但較大的肽或蛋白質(zhì)的旋光度不等于其組成氨基酸的旋光度的簡單加和。 2 2、 肽的酸堿性質(zhì)肽的酸堿性質(zhì) 短肽在晶體和水溶液中是以偶極離子形式存在。 肽的酸堿性質(zhì)主要取決于n端-nh和c端-cooh 以及側(cè)鏈r上可解離的基團。在長肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團主要是側(cè)鏈基團。肽的滴定曲線和氨基酸的很相似。3 3、肽的等電點、肽的等電點 可以根據(jù)它的pk值確定 4 4、肽的化學(xué)反應(yīng)、肽的化學(xué)反應(yīng) （1）肽的肽的-羧基，羧基，-氨基和側(cè)鏈氨基和側(cè)鏈r r基上基上的活性基團的活性基團都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。 （2）雙縮

11、脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)，是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)。是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)。 （雙縮脲），能與（雙縮脲），能與 cuso4-naohcuso4-naoh產(chǎn)產(chǎn)生顏色反應(yīng)。生顏色反應(yīng)。 一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都能與一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都能與cuso4cuso4堿性溶液發(fā)生雙縮脲反應(yīng)而生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物。堿性溶液發(fā)生雙縮脲反應(yīng)而生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物。利用這個反應(yīng)可以定量分析蛋白質(zhì)的含量。利用這個反應(yīng)可以定量分析蛋白質(zhì)的含量。 游離氨基酸無此反應(yīng)。游離氨基酸無此反應(yīng)。 （三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽1 1、 谷胱甘肽谷胱甘肽（gsh） p168 三肽（gl

12、u-cys-gly），廣泛存在于生物細(xì)胞中，含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。 gsh和gs-sg 2.2.促甲狀腺素釋放激素促甲狀腺素釋放激素：三肽（焦谷氨酰組氨酰脯氨酸），可促進甲狀腺素的釋放。 3.3.短桿菌素短桿菌素s：環(huán)十肽，含有d-苯丙氨酸、鳥氨酸，對革蘭氏陰性細(xì)菌有破壞作用，主要作用于細(xì)胞膜。 4.4.青霉素青霉素：含有d半胱氨酸和d纈氨酸的二肽衍生物 。主要破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁粘肽的合成引起溶菌。 5.5.牛催產(chǎn)素與加壓素牛催產(chǎn)素與加壓素：均為九肽 6.6.舒緩激肽舒緩激肽：促進血管舒張，促進水、鈉離

13、子的排出。 7.7.腦啡肽腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用。 8.8.蕈（mushrooms）產(chǎn)生的毒素-鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿 腦啡與其受體結(jié)合后可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果腦啡與其受體結(jié)合后可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果 麻啡可以模擬腦啡的作用，因此有類似的效用鵝膏蕈堿 鬼筆鵝膏，又名毒鵝膏菌，此菌極毒，目前尚無有效解毒辦法，鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿（鵝膏毒肽）是鵝膏蕈所含的最重要致死毒素，為雙環(huán)八肽，食入后，可迅速被消化道吸收進入肝臟，并能迅速與肝細(xì)胞rna聚合酶結(jié)合，抑制mrna的生成，造成肝細(xì)胞壞死，導(dǎo)致急性肝功能衰竭為主的多器官衰竭。圖圖4-6 -4-6 -鵝膏蕈堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)鵝膏蕈堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定三、蛋白

14、質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的定義（二）n末端分析（三） c末端分析（四）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離（五）肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定（六）肽鏈的部分水解和肽段的分離（七）多肽鏈中氨基酸順序的測定（八）二硫鍵位置的確定（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的定義（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的定義 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指肽鏈的氨基酸組成及其排列順序和二硫鍵的位置。 氨基酸序列是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，它決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)可用氨基酸的三字母符號或單字母符號表示，從n-末端向c-末端書寫。采用三字母符號時，氨基酸之間用連字符“”隔開。（二）測定步驟（二）測定步驟 測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，要求樣品必須是均一的（

15、純度大于97）而且是已知分子量的蛋白質(zhì)。一般的測定步驟是： 通過末端分析確定蛋白質(zhì)分子由幾條肽鏈構(gòu)成 將每條肽鏈分開，并分離提純。 肽鏈的一部分樣品進行完全水解，測定其氨基酸組成和比例。 肽鏈的另一部分樣品進行n末端和c末端的鑒定。 拆開肽鏈內(nèi)部的二硫鍵。 一部分肽鏈用部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并將各個肽段分離出來。測定每個肽段的氨基酸順序。 另一部分肽鏈樣品再用另一種部分水解方法水解成另一套肽段，其斷裂點與第一種方法不同。分離肽段并測序。比較兩套肽段的氨基酸順序，根據(jù)其重疊部分拼湊出整個肽鏈的氨基酸順序。 測定原來的多肽鏈中二硫鍵和酰胺基的位置。1、n末端分析末端分析 （1 1）

16、蛋白質(zhì)的末端氨基與蛋白質(zhì)的末端氨基與2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(dnfb) (dnfb) （sangersanger試劑）在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白試劑）在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白質(zhì)（質(zhì)（dnp-dnp-蛋白質(zhì)），產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性蛋白質(zhì)），產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性100100高溫。高溫。水解時，肽鏈斷開，水解時，肽鏈斷開，dnp-dnp-氨基酸氨基酸能溶于有機溶劑（如乙醚）能溶于有機溶劑（如乙醚）中，這樣可與其他氨基酸和中，這樣可與其他氨基酸和-dnp-dnp賴氨酸分開。賴氨酸分開。 經(jīng)雙向濾紙層析或柱層析，可以鑒定黃色的經(jīng)雙向濾紙層析或柱層析，可以鑒定黃色的dn

17、pdnp氨基氨基酸。酸。1、n末端分析末端分析 （2）蛋白質(zhì)的末端氨基與丹磺酰氯蛋白質(zhì)的末端氨基與丹磺酰氯(dns-cl)反應(yīng)，生成dns-蛋白質(zhì)。dns-氨基酸有強熒光，激發(fā)波長在360nm左右，比dnfb法靈敏100倍。 肽水解后的dns-氨基酸不需要提取。1、n末端分析末端分析 （3 3）末端氨基與）末端氨基與異硫氰酸苯酯（異硫氰酸苯酯（pitcpitc）在弱堿性條在弱堿性條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物而從與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物而從肽鏈上掉下來。產(chǎn)

18、物可用氣肽鏈上掉下來。產(chǎn)物可用氣- -液色譜法進行鑒定。液色譜法進行鑒定。 edmanedman法法 此法是目前應(yīng)用最廣泛方法。此法是目前應(yīng)用最廣泛方法。 優(yōu)點優(yōu)點是剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重復(fù)測定是剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重復(fù)測定新生的新生的n n末端氨基酸?，F(xiàn)在已經(jīng)有全自動的氨基酸順序分末端氨基酸?，F(xiàn)在已經(jīng)有全自動的氨基酸順序分析儀，可測定含析儀，可測定含2020個以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。個以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。 缺點缺點是不如丹磺酰氯靈敏，可與之結(jié)合使用。是不如丹磺酰氯靈敏，可與之結(jié)合使用。 （4 4）n n末端氨基酸也可用酶學(xué)方法即末端氨基酸也可用酶學(xué)方法

19、即氨肽酶氨肽酶法測定。法測定。n-末端分析末端分析 常見問題及處理方法： 經(jīng)常碰到n-末端殘基的氨基被封閉。因此不能與edman降解試劑發(fā)生作用。 焦谷氨?；⒁阴；约澳承┉h(huán)狀肽。2、 c末端分析末端分析 （1）c末端氨基酸可用硼氫化鋰末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的還原生成相應(yīng)的氨氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。有斷裂干擾?；?。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。有斷裂干擾。 （2）多肽與肼在無水條件下加熱）多肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的，可以斷裂所有的肽鍵，除肽鍵，除c末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼解下來的肼化合物

20、。肼解下來的c末端氨基酸可用紙層析鑒定。精末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。壞。 （3）羧肽酶法）羧肽酶法 將蛋白質(zhì)在將蛋白質(zhì)在ph 8.0, 30與羧肽酶一起與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道c末端末端氨基酸的排列順序。羧肽酶氨基酸的排列順序。羧肽酶a水解除精氨酸、賴氨酸和脯水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，羧肽酶氨酸外所有肽

21、鍵，羧肽酶b水解精氨酸和賴氨酸。水解精氨酸和賴氨酸。3、二硫鍵的拆開和肽鏈的分離、二硫鍵的拆開和肽鏈的分離 肽鏈之間肽鏈之間不是共價交聯(lián)不是共價交聯(lián)的，可用酸、堿、高濃度的鹽的，可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理蛋白質(zhì)，把肽鏈分開?；蚱渌冃詣┨幚淼鞍踪|(zhì)，把肽鏈分開。 如果肽鏈之間以如果肽鏈之間以二硫鍵二硫鍵交聯(lián)，或肽鏈中含有鏈內(nèi)二硫交聯(lián)，或肽鏈中含有鏈內(nèi)二硫鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開。鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開。 最普遍的方法是用過量的最普遍的方法是用過量的巰基乙醇巰基乙醇處理，然后用處理，然后用碘乙碘乙酸酸保護生成的半胱氨酸的巰基，防止重新氧化。保護生成的半

22、胱氨酸的巰基，防止重新氧化。 二硫鍵拆開后形成的肽鏈，可用紙層析、離子交換柱二硫鍵拆開后形成的肽鏈，可用紙層析、離子交換柱層析、電泳等方法進行分離。層析、電泳等方法進行分離。4、肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定、肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定 在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，2 24 4小時即可完成。小時即可完成。 蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的蛋白質(zhì)

23、的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相氨基酸分子數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相差很大。差很大。5、肽鏈的部分水解和肽段的分離、肽鏈的部分水解和肽段的分離 胰蛋白酶：胰蛋白酶：專門水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵，所以生成的肽段之一的c末端是賴氨酸或精氨酸。 胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘基的羧基形成的肽鍵。其他疏水殘基反應(yīng)較慢。 以上方法中，酶不能水解脯氨酸參與形成的肽鍵 肽段的分離：肽段的分離：多肽部分水解后，降解成長短不一的小肽段，可用層析或電泳加以分離提純。經(jīng)常用雙向

24、層析或電泳分離，再用茚三酮顯色，所得的圖譜稱為肽指紋譜。酶法裂解總結(jié)酶法裂解總結(jié)胰蛋白酶 lys x, arg x (x pro) 胰凝乳蛋白酶 tyrx，trpx, phex (x pro) 胃蛋白酶 phe(trp、try、leu)phe(trp、try、leu)嗜熱菌蛋白酶 x-phe, trp, tyr, leu, ile, val, met （pro） glu蛋白酶 gluxarg蛋白酶 argx6、多肽鏈中氨基酸順序的測定、多肽鏈中氨基酸順序的測定 從多肽鏈中部分水解得到的肽段可用edman化學(xué)法、酶法、質(zhì)譜法或氣譜-質(zhì)譜連用法測序，然后用小肽段重疊原理拼湊出整個多肽鏈的氨基酸順序

25、。7、二硫鍵位置的確定、二硫鍵位置的確定 一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，從部分水解一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，從部分水解產(chǎn)物中分離出含二硫鍵的肽段，再拆開二硫鍵，將兩個肽產(chǎn)物中分離出含二硫鍵的肽段，再拆開二硫鍵，將兩個肽段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位置。置。 常用胃蛋白酶，因其專一性低，生成的肽段小，容常用胃蛋白酶，因其專一性低，生成的肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用（易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用（ph2ph2），此時），此時二硫鍵穩(wěn)定。二硫鍵穩(wěn)定。 肽段的分離可用肽段的分離可用對角線電泳

26、對角線電泳 ph6.5 ph6.5 過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對含半胱氨磺酸的肽段。對含半胱氨磺酸的肽段。四、蛋白質(zhì)氨基酸序列與生物功能四、蛋白質(zhì)氨基酸序列與生物功能 1.同源蛋白質(zhì)同源蛋白質(zhì) 在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)同源蛋白質(zhì)。 同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（序列）的特點：同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（序列）的特點： （1 1）同源蛋白質(zhì)氨基酸序列具有明顯的相似性（同源性）。）同源蛋白質(zhì)氨基酸序列具有明顯的相似性（同源性）。 （2 2）多肽鏈長度相同或相近有）多肽鏈長度相同或相近有

27、 （3 3）許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱）許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對不同的種屬有很大變化，稱對不同的種屬有很大變化，稱可變殘基可變殘基，可變殘基中個別氨基酸的變，可變殘基中個別氨基酸的變化化 不影響蛋白質(zhì)的功能。不影響蛋白質(zhì)的功能。 例如各種脊椎動物中血紅蛋白和胰島素。例如各種脊椎動物中血紅蛋白和胰島素。胰島素胰島素 由51個aa組成，a、b兩條鏈（21+30），2個鏈間二硫鍵，1 個鏈內(nèi)二硫鍵 有24個氨基酸殘基位置始終

28、不變：6 個cys不變，其余18個氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。 豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。 氧合肌紅素蛋白氧合肌紅素蛋白 p184 肌肉內(nèi)的氧合肌紅素蛋白-肌紅蛋白分子由一條肽鏈組成，含153 個氨基酸殘基。每個肌紅蛋白分子含有一個血紅素輔基。 紅細(xì)胞的血紅蛋白分子有兩個和兩個亞基, 亞基含141個氨基酸殘基,亞基含146個氨基酸殘基。血紅蛋白的每個亞基都有一個血紅素輔基。 肌紅蛋白的一級結(jié)構(gòu)與血紅蛋白的亞基或亞基極為相似。因此推想，它們是從同一個分子進化而來。圖4-18 絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶 絲氨酸蛋白酶是一個絲氨酸蛋白酶

29、是一個蛋白酶家族蛋白酶家族，它們的作用是斷裂大分子蛋白，它們的作用是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)。其激活是通過活性中心一組氨質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)。其激活是通過活性中心一組氨基酸殘基變化實現(xiàn)的基酸殘基變化實現(xiàn)的 胰分泌的酶里面有三種是絲氨酸蛋白酶胰分泌的酶里面有三種是絲氨酸蛋白酶： 糜蛋白酶糜蛋白酶，又稱為胰凝乳蛋白酶，由胰以糜蛋白酶原的形式分泌，又稱為胰凝乳蛋白酶，由胰以糜蛋白酶原的形式分泌，在小腸內(nèi)經(jīng)胰蛋白酶作用而激活。在小腸內(nèi)經(jīng)胰蛋白酶作用而激活。 胰蛋白酶胰蛋白酶屬水解酶類，以酶原形式由胰釋出，在小腸中轉(zhuǎn)化為活屬水解酶類，以酶原形式由胰釋出，在小腸中轉(zhuǎn)化為活

30、性形式。性形式。 彈性蛋白酶彈性蛋白酶，對丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸等，對丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸等的多肽鍵起催化水解的作用的多肽鍵起催化水解的作用 這三種酶的一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)相似。它們的活性絲氨酸殘基都這三種酶的一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)相似。它們的活性絲氨酸殘基都是在同一位置是在同一位置(ser-195)(ser-195)。 通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進化。同物種間的親源關(guān)系和進化。 親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。 進化

31、論有了分子水平上的直接證據(jù)。進化論有了分子水平上的直接證據(jù)。 2 .同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化2 .同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化 細(xì)胞色素細(xì)胞色素c c，通過分子中的半胱氨酸巰基與血紅素共價結(jié)合通過分子中的半胱氨酸巰基與血紅素共價結(jié)合 分子量：12500左右 氨基酸殘基：100個左右，單鏈。 25種生物中，細(xì)胞色素c的不變殘基35個。 60種生物中，細(xì)胞色素c的不變殘基27個。 親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素c的差異越小。 親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素c的差異越大。 細(xì)胞色素c的氨基酸順序分析資料已經(jīng)用來核對各個物種之間的分類學(xué)關(guān)系，以及繪制進化樹。根據(jù)進化樹不僅可以研究從單細(xì)胞到多細(xì)胞的生物進化過程，還可以粗略估計各種生物的分化時間。 五、肽與蛋白質(zhì)的人工合成五、肽與蛋白質(zhì)的人工合成 多肽的人工合成有兩種類型，一種是由不同氨基酸按多肽的人工合成有兩種類型，一種是由不同氨基酸按照一定順序排列的控制合成，另一種是由一種或兩種氨基照一定順序排列的控制合成，另一種是由一種或兩種氨基酸聚合或共聚合?？刂坪铣傻囊粋€困難是進行接肽反應(yīng)所酸聚合或共聚合?？刂坪铣傻囊粋€困難