第六章外源目的基因表達與調控2

1、第四節(jié)第四節(jié) 目的基因表達產物檢測目的基因表達產物檢測與分離純化與分離純化一、外源目的基因表達產物的檢測一、外源目的基因表達產物的檢測 外源目的基因的表達包括轉錄和翻譯兩個階外源目的基因的表達包括轉錄和翻譯兩個階段。外源基因表達產物的檢測過程就是對特異段。外源基因表達產物的檢測過程就是對特異性性mrna或蛋白質的檢測?；虻鞍踪|的檢測。 特異性特異性mrna的檢測的檢測: northern雜交雜交 特異性蛋白質的檢測特異性蛋白質的檢測: elisa, western雜交雜交1.northern 印跡雜交印跡雜交(northern blot) 檢測檢測rna（主要是（主要是mrna）的方法）的方法

2、 與與southern雜交的區(qū)別雜交的區(qū)別 靶核酸：rna rna電泳: 在變性條件下進行,以去除rna中的二級結構,保證rna完全按分子大小分離。 變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。 轉膜：不需變性2.elisa2.elisa 1971年瑞典學者年瑞典學者 engvall 和和perlmann，荷蘭學者荷蘭學者van weeman和和 schuurs分別報道分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（驗（enzyme-linked immunoso

3、rbent assay, elisa）。）。 elisa原理原理 使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性其免疫活性 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性酶的活性 結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本

4、中受檢物質的量直接相關的量直接相關 elisa原理圖原理圖 固相的抗原或抗體（固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）免疫吸附劑） 酶標記的抗原或抗體（酶標記的抗原或抗體（標記物）標記物）酶作用的底物（酶作用的底物（顯色劑）顯色劑）elisa可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。直接法： 直接法是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原直接法是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原結合形成酶標抗原結合形成酶標抗原抗體復合物，加入酶反應底物，測定產物的吸抗體復合物，加入酶反應底物，測定產物的吸光值，計算出包被在酶標上的抗體或抗原的量。見圖光值，計算出

5、包被在酶標上的抗體或抗原的量。見圖a間接法： 是將酶標記在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結是將酶標記在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結合形成復合物后，再以酶標二抗和復合物結合，通過測定酶反應產合形成復合物后，再以酶標二抗和復合物結合，通過測定酶反應產物的顏色可以（間接）反應一抗和抗原的結合情況，進而計算出抗物的顏色可以（間接）反應一抗和抗原的結合情況，進而計算出抗原或抗體的量。見圖原或抗體的量。見圖b夾心法： 是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，再用酶標是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，再用酶標的抗體與抗原反應形成抗體的抗體與抗原反應形成抗體-

6、抗原抗原-酶標抗體復合物；也可以象間接酶標抗體復合物；也可以象間接法一樣應用酶標二抗和抗體法一樣應用酶標二抗和抗體-抗原抗原-抗體復合物結合，形成抗體抗體復合物結合，形成抗體-抗原抗原-抗體抗體-酶標二抗復合物，見圖酶標二抗復合物，見圖c。前者稱為直接夾心法，后者稱為。前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。間接夾心法。elisa基本的實驗過程基本的實驗過程 包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化體表面，使抗原或抗體固相化 抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結合物，抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結合物，使之與固相抗原或

7、抗體發(fā)生免疫反應而被結合固使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結合固定定 酶促反應：在反應體系中加入酶作用的底物，使酶促反應：在反應體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應而顯色發(fā)生酶促反應而顯色elisa基本的實驗過程基本的實驗過程3. western blot 要檢測一個基因的表達產物是否正確，或者比要檢測一個基因的表達產物是否正確，或者比較表達產物量的相對變化，首選方法是較表達產物量的相對變化，首選方法是western blot。 western blot 是生物學、生物化學、分子生物是生物學、生物化學、分子生物學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。 we

8、stern blot整個過程主要包括：整個過程主要包括：page電泳、電泳、轉膜及蛋白檢測轉膜及蛋白檢測3個階段。個階段。聚丙烯酰胺凝膠的組成及特點聚丙烯酰胺凝膠的組成及特點 組成：組成：主要由丙烯酰胺丙烯酰胺(acr)和交聯(lián)劑n,n-甲叉甲叉(亞甲基亞甲基) 雙丙烯酰胺雙丙烯酰胺(bis)聚合而成。 聚合：聚合：單獨或混合時穩(wěn)定，出現(xiàn)自由基團時會聚合。 化學法的引發(fā)劑：過硫酸銨過硫酸銨（aps or ap)， 催化劑：四甲基乙二胺四甲基乙二胺（temed) 特點：特點：凝膠濃度越大，交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小。 故根據分離蛋白質的大小選擇不同濃度的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）的原理 聚

9、丙烯酰胺凝膠的特點聚丙烯酰胺凝膠的特點 優(yōu)點：優(yōu)點：聚丙烯酰胺凝膠電泳具有機械強度好、彈性大、 透明、化學穩(wěn)定性高、無電滲作用、設備簡單、 用樣量少(1100g)和分辨率高等優(yōu)點。 用途：用途：蛋白質，核酸等物質的分離、定性和定量分析。 western blot 基本原理基本原理 經過經過pagepage分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變?；钚圆蛔?。 以固相載體上的蛋

10、白質或多肽作為抗原，與對應的抗以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測特定蛋白質的應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測特定蛋白質的表達情況。表達情況。western blot基本原理基本原理 figure 1a. in the direct detection method, labeled primary antibody binds to antigen on the membrane and reacts with substrate, creating a

11、detectable signal. 1b. in the indirect detection method, unlabeled primary antibody binds to the antigen. then, a labeled secondary antibody binds to the primary antibody and reacts with the substrate.a. direct detection b. indirect detectionwestern blot操作的過程操作的過程 蛋白樣品的制備 sds聚丙烯酰胺 凝膠電泳l轉膜l封閉l一抗雜交l二抗

12、雜交l底物顯色gel electrophoresistips: separate proteins by gel electrophoresis 1-d gels 2-d gelstransfer(wet tank transfer system and semi-dry transfer system)blocking and detectiontips: one step and two steps二、外源基因表達產物的分離純化二、外源基因表達產物的分離純化 （一）細胞收集 1.離心法收集細胞離心法收集細胞 2.過濾法收集細胞過濾法收集細胞 3.絮凝法收集細胞絮凝法收集細胞(二)細胞破碎

13、對于非分泌型表達的細胞，其表達產物需要先對于非分泌型表達的細胞，其表達產物需要先破碎細胞才可提純。破碎細胞才可提純。 破碎方法有變性劑裂解法、超聲波破碎法、機破碎方法有變性劑裂解法、超聲波破碎法、機械破碎法、酶裂解法。械破碎法、酶裂解法。 變性劑裂解法：變性劑裂解法：sds 超聲波破碎法：將電能通過換能器轉換為聲能，這種能超聲波破碎法：將電能通過換能器轉換為聲能，這種能量通過液體介質量通過液體介質(如水如水)而變成一個個密集的小氣泡，這些而變成一個個密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，產生的象小炸彈一樣的能量，從而起到小氣泡迅速炸裂，產生的象小炸彈一樣的能量，從而起到破碎細胞等物質的作用破碎細胞等物質的作用(俗稱俗稱“空化效應空化效應”)。 機械破碎法：液氮凍干細胞再研磨，高壓勻漿器機械破碎法：液氮凍干細胞再研磨，高壓勻漿器細胞漿細胞漿液通過止逆閥進入泵體內，在高壓下迫使其在排出閥的小液通過止逆閥進入泵體內，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速沖孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速沖擊，使細胞受到高的液相剪切力而破碎。擊，使細胞受到高的液相剪切力而破碎。 酶裂解法：