愈傷組織誘導(dǎo)及觀察

1、實驗二 愈傷組織誘導(dǎo)及觀察一.實驗?zāi)康耐ㄟ^愈傷組織誘導(dǎo)的操作，使同學(xué)們了解進行植物組織培養(yǎng)時的一些關(guān)鍵操作技術(shù)和方法，如外植體的選擇、培養(yǎng)基母液配制、使用液配制、分裝滅菌、外植體表面消毒、接種、培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)原理和方法以及接種后污染率，愈傷組織誘導(dǎo)率的統(tǒng)計與觀察。使同學(xué)們能夠親身體會、了解激素對外植體的作用，還使同學(xué)們了解無菌培養(yǎng)的無菌操作，清楚植物體的帶菌部位等。二.實驗內(nèi)容（一）、實驗原理植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，對離體植物組織（器官或細胞）分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長，甚至分化發(fā)育成一完整的植株的一門實驗技術(shù)。組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細胞的全能性，即植物體的每個細胞攜帶

2、著一套完整的基因組，因此具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。植物組織當中原本已經(jīng)分化的細胞，一旦脫離原有的機體環(huán)境，成為離體狀態(tài)，在適宜的營養(yǎng)和外界條件下，就會表現(xiàn)出全能性，從已經(jīng)分化定型的細胞，脫分化，成為恢復(fù)分裂能力的細胞，并能重新生長發(fā)育成完整的植株。愈傷組織就是指一個離體的細胞、一塊組織或一個器官的細胞，通過脫分化不斷分裂、增生子細胞，這些細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，逐漸形成了無序結(jié)構(gòu)的一團細胞。在植物組織培養(yǎng)中，主要目標是誘導(dǎo)愈傷組織形成和形態(tài)發(fā)生，使一個離體的細胞、一塊組織或一個器官的細胞，通過脫分化形成愈傷組織，并由愈傷組織再分化形成植物體。愈傷組織的形成 從一塊外植體形成典型

3、的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個時期：起動期、分裂期和形成期。推薦精選起動期是指細胞準備進行分裂的時期。用于接種的外植體的細胞，通常都是成熟細胞，處在靜止狀態(tài)。起動期是通過一些刺激因素(如機械損傷、改變光照強度、增加氧等)和激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細胞的合成代謝活動加強，迅速進行蛋白質(zhì)和核酸的合成。機械損傷能誘導(dǎo)植物體細胞開始分裂，如傷口上會出現(xiàn)愈傷組織。在植物組織培養(yǎng)中沿用了愈傷組織這一名詞，但是植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)外植體細胞分裂形成的愈傷組織，大都不是損傷的結(jié)果。外源的生長素類物質(zhì)對誘導(dǎo)細胞開始分裂效果很好，因此生長素類物質(zhì)在植物組織培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙

4、酸和細胞分裂素等。分裂期是指外植體細胞經(jīng)過誘導(dǎo)以后脫分化，不斷分裂、增生子細胞的過程。處于分裂期的愈傷組織的特點是：細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明。外植體的脫分化因植物種類、器官來源及其生理狀況的不同而有很大差別。例如，煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本科植物的脫分化比較難；花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難；幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比較難。分化期是指在分裂期的末期，細胞內(nèi)開始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細胞。這些細胞類型有薄壁細胞、分生細胞、色素細胞、纖維細胞，等等。外植體的細胞經(jīng)過起動、分裂和分化等一系列變化，形成了

5、無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織。如果在原來的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)愈傷組織，會由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)不足或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組織停止生長，甚至老化變黑、死亡。如果要讓愈傷組織繼續(xù)生長增殖，必須定期地(如24周)將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，這樣愈傷組織就可以長期保持旺盛的生長。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式 經(jīng)過起動、分裂和分化期產(chǎn)生的愈傷組織，其中雖然發(fā)生了細胞分化，但是并沒有器官發(fā)生。只有滿足某些條件，愈傷組織的細胞才會發(fā)生再分化，產(chǎn)生芽和根，進而發(fā)育成完整植株。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式主要有不定芽方式和胚狀體方式兩種。不定芽方式是在某些條件下，愈傷組織中的分生細胞發(fā)生分化，形成不同的器官原基，再逐漸形成芽

6、和根。胚狀體方式是由愈傷組織細胞誘導(dǎo)分化出具有胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進而長成完整植株。這種由愈傷組織中的薄壁細胞不經(jīng)過有性生殖過程，直接產(chǎn)生類似于胚的結(jié)構(gòu)，叫做胚狀體。在植物組織培養(yǎng)中，不定芽方式和胚狀體方式是愈傷組織形態(tài)發(fā)生的兩種最常見和最重要的方式。胚狀體方式比不定芽方式有更多的優(yōu)點，如胚狀體產(chǎn)生的數(shù)量比不定芽多，胚狀體可以制成人工種子，等等。推薦精選（二）實驗材料和用具1植物材料銀杏種子2實驗儀器和試劑1）儀器設(shè)備 超凈工作臺、高壓滅菌鍋、微波爐、人工氣候箱、電子天平、移液器、恒溫磁力攪拌器、酸度計、手術(shù)刀、手術(shù)剪、稱量紙、皮筋、封口膜、三角瓶、量筒、燒杯（1000ml）、試劑瓶（

7、1000ml、100ml）、長鑷子、記號筆（或標簽紙）、培養(yǎng)皿、酒精燈等。2）試劑 75% 酒精、氯化汞、植物生長激素（NAA、BA1）、蔗糖、瓊脂粉、HCl、NaOH、WS母液配方見表1。（三）實驗方法1 培養(yǎng)基配制1）. 培養(yǎng)基的選擇 植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用的培養(yǎng)基，一般由無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)劑和有機附加物等五類物質(zhì)組成。無機營養(yǎng)物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般為蔗糖。 維生素中只有硫胺素是必需的，而煙酸、維生素B6和肌醇對生長之起促進作用。常用的生長調(diào)節(jié)劑有IAA （吲哚乙

8、酸）、IBA（吲哚-3-丁酸）、 NAA（萘乙酸）、NOA（萘氧乙酸）、 P-CPA（對氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）、2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）；BA P（芐氨基嘌呤）、6-BA（芐基腺嘌呤）、2-Zi（異戊烯氨基嘌呤）、 KT（激動素推薦精選）等。有機附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促進分化，但如培養(yǎng)基配方適當，則大多數(shù)組織是不需要的。培養(yǎng)基的種類、成份直接影響到培養(yǎng)材料的生長發(fā)育，故應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)植物的種類和部位，選擇適宜的培養(yǎng)基。 2）. 培養(yǎng)基的配制 先按表1配制WS培養(yǎng)基貯液。再將貯液與其他成分按比例混合。加入3%的蔗糖作為碳源，起支持作用的瓊脂粉8 g/L，愈

9、傷組織培養(yǎng)基配方為WS培養(yǎng)基+NAA1 mg/L +BA1 mg/L。 將上述培養(yǎng)基加熱溶解后，加蒸餾水使培養(yǎng)基達到終體積。 再用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至56-5.8。 分裝至三角瓶內(nèi)，封口膜封口，等待滅菌后使用。2滅菌1）培養(yǎng)基及器具滅菌 培養(yǎng)基、無菌水需要在高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌作用取決于溫度，常用的滅菌溫度為121，所需時間20分鐘，滅菌結(jié)束后待溫度下降到50以下，才能取出已滅菌的培養(yǎng)基。 可用同樣方法對器具同時進行滅菌，包括：培養(yǎng)皿、解剖刀、剪子、濾紙、鑷子等。2）工作環(huán)境滅菌 接種前1打開超凈工作臺和棚面的紫外燈照射40min。殺菌

10、結(jié)束后，先關(guān)掉棚面的紫外燈，再打開風(fēng)機，最后關(guān)掉超凈工作臺上的紫外燈。在接種后休息時，要先打開臺面的紫外燈，再關(guān)風(fēng)機，最后打開棚面紫外燈。不能將風(fēng)機與臺面上的紫外燈同時關(guān)閉或先關(guān)閉風(fēng)機再開紫外燈。3） . 植物材料的滅菌 植株各部分的表面攜帶著各種微生物，他們是植物組培的污染源，所以在接種培養(yǎng)前必須進行徹底的表面消毒；組織內(nèi)部侵染的真菌或細菌很難消除，這些組織一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用無菌潔凈濾紙吸干水分。推薦精選 植物材料的滅菌需在超凈工作臺內(nèi)進行，可選擇不同的滅菌劑進行植物組織表面消毒。同時注意，表面消毒劑對植物組織也是有毒的。因此，應(yīng)當選擇消毒劑的濃度和時間，

11、盡量減少組織的死亡。滅菌后，需用無菌水反復(fù)沖洗，徹底洗去表面消毒劑。如：銀杏種子消毒：將銀杏種子去外種皮。進超凈工作臺后，在0.1%氯化汞中浸泡10分鐘，用無菌水沖洗3-5次，無菌濾紙吸干，在無菌濾紙上，用解剖刀取出種胚。準備工作就緒后，可以進行接種。3接種1）. 進臺 工作人員進入接種室前，需要洗凈手和手腕。進入超凈工作臺內(nèi)需用75%酒精紗布擦拭手、手腕，再擦培養(yǎng)基瓶和超凈工作臺。2）. 接種(1) 剪、鑷消毒：接種前剪、鑷、解剖刀應(yīng)插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精燈外焰上徹底灼燒，灼燒時應(yīng)將鑷口張開，燒至剪、鑷上火焰熄滅為止，冷卻后方可進行接種。接種后仍需灼燒并插回75%酒精的磨口瓶待用

12、。注意每次取出時鑷子不可接觸瓶口和其它器皿。(2) 插植外植體：左手拿三角瓶，解開封口膜，將三角瓶幾乎水平拿著，靠近酒精燈焰，將瓶口外部在酒精燈火焰上燎數(shù)秒鐘，使瓶口的水氣散發(fā)掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒過的鑷子夾一塊外植體（銀杏種胚）送入瓶內(nèi)輕輕的插入培養(yǎng)基上，再把封口膜在酒精燈火焰上燎數(shù)秒，灼燎時應(yīng)旋轉(zhuǎn)，避免燒壞，蓋好封口膜，扎緊皮筋，便完成了第一瓶的操作，接著再做第二瓶，如此直到外植體全部接完。3） 注意事項(1) 操作人員的頭、胳膊等不得進入臺內(nèi)。(2) 操作人員不得隨意談話、說笑，以免造成污染。(3) 用酒精對雙手消毒時，務(wù)必待酒精徹底揮發(fā)后再靠近酒精燈火焰，以免火焰?zhèn)帧?4)

13、 臺外人員走動要輕、動作要小。 推薦精選4.培養(yǎng)接種后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度232，適當光照強度和光周期。10天計算愈傷組織誘導(dǎo)率和污染率。培養(yǎng)過程如果有的培養(yǎng)物被微生物污染，應(yīng)當馬上將其清理，以免影響其它培養(yǎng)物，并做好記錄。WS培養(yǎng)基MS 1：20*（20倍濃）g/LKNO3 ：38； NH4NO3：33MS2：100* g/LCaCl2.2H2O：44（CaCl2：33.2）W3：100* g/LMgSO47H2O：37；甘油磷酸鈉：27MS4：100* g/LH3BO3：0.62； MnS044H20：2.23 （MnS04H20：1.69）；ZnSO47H20：0.86MS5：1000* g/LNa2MoO42H20：0.2