2基因工程制藥PPT課件

1、2.4 2.4 基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)一、 比生長(zhǎng)速率(h-1) 細(xì)胞生長(zhǎng)速率rX ：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的變化（ g/Lh） 。 X為細(xì)胞濃度，通常用單位體積培養(yǎng)液中所含細(xì)胞（或稱(chēng)菌體）的干燥質(zhì)量（dry cell weight，DCW）表示（g/L, g DCW /L ）。 培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比。XdtdXrx第1頁(yè)/共40頁(yè)2g/L4g/L10g/L20g/L生長(zhǎng)速率rX ：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的變化（ g/Lh） 2 g/Lh 10 g/Lh 1 h-1 1 h-11h第2頁(yè)/共40頁(yè)為比生長(zhǎng)速率(h-1) ，表示單位濃度細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。二、

2、 乙酸的產(chǎn)生 大腸桿菌在較高的比生長(zhǎng)速率下會(huì)產(chǎn)生乙酸，高濃度的乙酸會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。 控制菌體生長(zhǎng)可控制乙酸產(chǎn)生。XdtdXXrx第3頁(yè)/共40頁(yè)2.2.5 5 基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的穩(wěn)定性一、 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（1）分裂不穩(wěn)定性 工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌。 相關(guān)因素： 質(zhì)粒的丟失率（宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件） 含質(zhì)粒菌與不含質(zhì)粒菌的生長(zhǎng)速度差異（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 DNA從質(zhì)粒上丟失、質(zhì)粒上序列發(fā)生重排等。第4頁(yè)/共40頁(yè)二、 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1. 選擇合適的宿主菌株2. 選擇合適的載體 低拷貝數(shù)質(zhì)粒丟失的頻率較大 含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的菌比生長(zhǎng)速度明顯低于不含質(zhì)粒

3、菌。3. 加入抗生素第5頁(yè)/共40頁(yè)二、 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法4. 分階段培養(yǎng) 表達(dá)水平越高，重組質(zhì)粒越不穩(wěn)定。 二階段培養(yǎng)： 第一階段 菌體生長(zhǎng) 第二階段 誘導(dǎo)表達(dá)5. 控制培養(yǎng)條件 高比生長(zhǎng)速率下質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加。 培養(yǎng)基成分、溫度等培養(yǎng)條件對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性也有影響。6. 固定化 固定化適用于分泌表達(dá)的蛋白，對(duì)非分泌表達(dá)蛋白難以大規(guī)模采用。第6頁(yè)/共40頁(yè)2.2.6 6 基因工程菌的發(fā)酵基因工程菌的發(fā)酵一、 基因工程菌的培養(yǎng)方式1、分批培養(yǎng)（batch culture） 培養(yǎng)基和細(xì)胞一次性加入反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。 細(xì)胞所處的培養(yǎng)環(huán)境時(shí)刻變化，細(xì)胞不是處在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。 操作簡(jiǎn)單。2、流加

4、培養(yǎng)（補(bǔ)料分批培養(yǎng)，fed-batch culture） 在細(xì)胞分批培養(yǎng)的過(guò)程中補(bǔ)加培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式，培養(yǎng)結(jié)束后一齊取出。 可采用不同補(bǔ)料方式，如恒速流加、變速流加、指數(shù)流加等。第7頁(yè)/共40頁(yè)第8頁(yè)/共40頁(yè)3、 連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture） 培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基同時(shí)排出等量培養(yǎng)液。 一定時(shí)間后，細(xì)胞濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變。 基因工程菌不穩(wěn)定，很難連續(xù)培養(yǎng)。4、透析培養(yǎng)（dialysis culture） 通過(guò)透析除去乙酸。 E.coli HB101(pPAKS2)生產(chǎn)青霉素?；柑岣?1倍。第9頁(yè)/共4

5、0頁(yè)第10頁(yè)/共40頁(yè)5、 固定化培養(yǎng)（immobilized culture） 質(zhì)粒穩(wěn)定，便于連續(xù)，適用于分泌表達(dá)。第11頁(yè)/共40頁(yè)二、二、 基因工程菌的培養(yǎng)工藝基因工程菌的培養(yǎng)工藝1、培養(yǎng)基的影響 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。 氮源、無(wú)機(jī)鹽等其他成分。 通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)、正交設(shè)計(jì)等方法優(yōu)化培養(yǎng)基組成，提高蛋白表達(dá)水平。2、接種量的影響 接種量小，延遲期長(zhǎng)，菌容易老化，不利于蛋白表達(dá)。 較大的接種量延遲期短，適于蛋白表達(dá)。 接種量一般為515。第12頁(yè)/共40頁(yè)3、溫度的影響 溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理很復(fù)雜，對(duì)不同蛋白，最佳的誘導(dǎo)表達(dá)溫度不同。4、溶氧（dissolved oxygen

6、，DO ）的影響 較高水平的DO（大于1030）的有利于蛋白表達(dá)，供氧不足，產(chǎn)生乙酸。 加大攪拌、增加氣流、提高氧分壓、提高罐壓。 控制糖源的流加速度。 恒溶氧發(fā)酵：通過(guò)以上手段控制DO在一恒定值。第13頁(yè)/共40頁(yè)5、pH的影響 流加酸、堿調(diào)節(jié)pH。 pH一般控制在6.87.6，少數(shù)例外。6、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響 一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。第14頁(yè)/共40頁(yè)分批發(fā)酵不同生長(zhǎng)階段加1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的生長(zhǎng)曲線(xiàn)正三角（對(duì)數(shù)早期） 倒三角（對(duì)數(shù)中期） 菱形（對(duì)數(shù)晚期） 圓形（不加誘導(dǎo)）第15頁(yè)/共40頁(yè)三、高密度發(fā)酵三、高密度發(fā)酵 理論上計(jì)算大腸桿菌發(fā)酵所能達(dá)到的最高菌體密度（干重）為400

7、g/L，一般認(rèn)為最高的發(fā)酵密度（干重）為200g/L。 目前培養(yǎng)所達(dá)到的最高密度是175 g/L 。 高密度發(fā)酵的成功關(guān)鍵是補(bǔ)料策略。 乙酸的積累是高密度培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的一個(gè)主要問(wèn)題是。 第16頁(yè)/共40頁(yè)三、高密度發(fā)酵三、高密度發(fā)酵 工藝上對(duì)策： 在發(fā)酵工藝上常通過(guò)改變培養(yǎng)基組成（以甘油為初始碳源） 降低培養(yǎng)溫度 限制性流加葡萄糖 提高供氧能力（加強(qiáng)攪拌、提高氧分壓、提高罐壓）第17頁(yè)/共40頁(yè)三、高密度發(fā)酵三、高密度發(fā)酵 菌種上對(duì)策： 阻斷E. coli乙酸產(chǎn)生：敲除磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（ack）的基因； 改變代謝流方法：導(dǎo)入丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶adh

8、2，丙酮酸生成乙醇； 限制葡萄糖攝取主要途徑（磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)），同時(shí)還需加強(qiáng)其他葡萄糖攝取途徑； 引入血紅蛋白基因第18頁(yè)/共40頁(yè)2.2.7 7 基因工程藥物的分離純化基因工程藥物的分離純化一、 分離純化的基本過(guò)程發(fā)酵液細(xì)胞固-液分離溶液細(xì)胞破碎包涵體溶解復(fù)性濃縮粗分離純化與精制制劑產(chǎn)品胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物固-液分離 溶液 細(xì)胞碎片第19頁(yè)/共40頁(yè)2.2.7 7 基因工程藥物的分離純基因工程藥物的分離純化化二、 建立分離純化工藝需了解的因素1、起始物料的特點(diǎn) 菌種類(lèi)型、蛋白的表達(dá)部位、 產(chǎn)物濃度等。2、目的產(chǎn)物特性（各種物理化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性）3、雜質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì)4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求 準(zhǔn)許存在的雜質(zhì)

9、種類(lèi)和最低含量、純度、比活等。第20頁(yè)/共40頁(yè)三、 細(xì)胞破碎 物理方法 珠磨、高壓勻漿、超聲波破碎、勻漿、凍融、低滲裂解、研磨等 化學(xué)方法 有機(jī)溶劑（甲苯、丙酮等）、表面活性劑等。 生物方法 酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等； 自溶：一定pH和溫度；一般采用加熱法，自溶時(shí)間較長(zhǎng)。第21頁(yè)/共40頁(yè) 第22頁(yè)/共40頁(yè) 5070MPa450m/s第23頁(yè)/共40頁(yè)四、 固液分離 胞外蛋白：離心 包含體：離心、低速離心 胞內(nèi)蛋白：去除細(xì)胞碎片 高速離心、微濾（0.110um）、 雙水相萃?。≒EG-Dextran、 PEG-鹽系統(tǒng)）、絮凝、膨脹床吸附 第24頁(yè)/共40頁(yè) 五、分離純化方法 主要為

10、各種層析方法： 離子交換層析、凝膠過(guò)濾、疏水層析、親和層析 超濾 六、非蛋白類(lèi)雜質(zhì)的去除 DNA（離子交換、疏水層析等） 熱原（脂多糖，超濾、陰離子交換、疏水層析、多黏菌素B親和層析） 病毒（紫外線(xiàn)照射、40nm膜過(guò)濾）第25頁(yè)/共40頁(yè) 七、選擇分離純化方法的依據(jù) 根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇 分泌表達(dá)（超濾、沉淀） 胞內(nèi)可溶表達(dá)（親和層析、離子交換） 周質(zhì)腔表達(dá)（溶菌酶處理后滲透壓休克） 包含體（離心回收）第26頁(yè)/共40頁(yè) 七、選擇分離純化方法的依據(jù) 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 初步純化（超濾、沉淀；濃縮、去主要雜質(zhì)） 高分辯率純化（親和層析、離子交換等色譜方式） 色譜之間的分離次序： 鹽析沉

11、淀、離子交換后可直接采用疏水色譜 親和層析通常放在第二步純化之后 凝膠過(guò)濾通常放在最后（容量小、可更換緩沖） 根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇 具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性 純化步驟盡可能少，時(shí)間盡可能短等。第27頁(yè)/共40頁(yè)2.8、包含體的復(fù)性 外源基因在大腸桿菌中高水平表達(dá)時(shí)通常會(huì)形成一種由目的蛋白構(gòu)成的不溶的、無(wú)活性的蛋白聚集體即包含體（Inclusion Body） 包含體內(nèi)約90%的成分是蛋白質(zhì)，目的蛋白占50以上。一、包含體表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)一、包含體表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) 表達(dá)量高 密度高（1.2-1.4g/mL之間 ），容易分離 抗蛋白酶 對(duì)宿主毒性小第28頁(yè)/共40頁(yè)二、包含體蛋白處理過(guò)程細(xì)胞破碎包涵體

12、分離包涵體溶解目的產(chǎn)物的復(fù)性變性條件下純化包涵體洗滌第29頁(yè)/共40頁(yè)三、包含體的復(fù)性方法方法： 1. 稀釋復(fù)性 2. 透析復(fù)性 3. 層析復(fù)性影響復(fù)性的操作參數(shù)：蛋白濃度、溫度、pH、離子強(qiáng)度。提高蛋白復(fù)性率的策略： 復(fù)性添加劑如PEG、表面活性劑 分子伴侶第30頁(yè)/共40頁(yè)常用半胱氨酸之間形成二硫鍵方法： 1. 空氣氧化法 在堿性條件下通空氣，氧化時(shí)可以加入二價(jià)銅離子加快反應(yīng)速度，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢(shì)，而且二硫鍵的氧化形成速度慢； 2.氧化還原對(duì)重排體系 常用氧化還原對(duì)有氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通過(guò)調(diào)整氧化還原兩種物質(zhì)的比例可以控制較精確

13、的氧化還原電勢(shì)，對(duì)二硫鍵反應(yīng)進(jìn)行控制，其二硫鍵形成速率快于空氣氧化法。第31頁(yè)/共40頁(yè)2.9 基因工程藥物的質(zhì)量控制 生物材料、培養(yǎng)過(guò)程、純化過(guò)程、產(chǎn)品的質(zhì)量控制。 目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致性。1.生物活性測(cè)定 活性、比活2.產(chǎn)品的鑒定（1）相對(duì)分子量 SDS-PAGE、凝膠過(guò)濾，允許10%誤差。 必要時(shí)采用質(zhì)譜準(zhǔn)確測(cè)定。第32頁(yè)/共40頁(yè)（2）等電點(diǎn) 等電聚焦測(cè)定，等電點(diǎn)常不均一，每批測(cè)定結(jié)果應(yīng)一致。（3）紫外吸收光譜 特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列測(cè)定 送檢中試頭三批產(chǎn)品，N端15個(gè)氨基酸序列，C端13個(gè)氨基酸殘基。（5）氨基酸組成分析（6）

14、免疫印跡（western blot）（7）圓二色光譜第33頁(yè)/共40頁(yè)（8）肽圖 一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS-PAGE分析第34頁(yè)/共40頁(yè)（9）二硫鍵分析3.蛋白純度分析 必須采用非還原SDS-PAGE和HPLC進(jìn)行檢定，其他檢測(cè)方法包括CE（毛細(xì)管電泳）等。4.雜質(zhì)檢測(cè)（1）內(nèi)毒素 家兔法、鱟試劑法（2）宿主細(xì)胞蛋白 免疫分析（3）宿主細(xì)胞殘余DNA 核酸雜交，100pg/劑量第35頁(yè)/共40頁(yè)（4）細(xì)菌、酵母、真菌、支原體、病毒 微生物學(xué)方法（5）其他物質(zhì) 抗生素 牛血清 采用了抗體親和層析，檢測(cè)小鼠IgG含量。5.穩(wěn)定性檢測(cè) 在不同溫度下保存，定期取樣檢測(cè)生物活性及其他特性的變化。6.一致性 各批次產(chǎn)品均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格。第36頁(yè)/共40頁(yè)產(chǎn)品的保存： 液態(tài)保存 低溫： -20、 -80和液氮、短期4 穩(wěn)定的pH 高濃度 加保護(hù)劑：糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白類(lèi)、還原劑（二硫蘇糖醇）等 固體保存 含水量5%以下， 4長(zhǎng)期保存 冷凍干燥 凍干過(guò)程中加保護(hù)劑：低分子化合物（葡萄糖、蔗糖等）、高分子物質(zhì)（糊精、血清）第37頁(yè)/共40頁(yè)基因工程藥物制造實(shí)例 自學(xué)第38頁(yè)/共40頁(yè)第二章 基因工程制藥1.