免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

1、第三章第三章 免疫酶組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)技術(shù) 免疫酶組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)技術(shù) 酶酶-辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶 酶標(biāo)記已知酶標(biāo)記已知Ab(Ab(或或Ag) + Ag) + 組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的Ag(Ag(或或Ab)Ab) 抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物( (酶標(biāo)酶標(biāo)) ) 底物底物 有色沉淀有色沉淀 定位；定位； 圖像分析儀半定量圖像分析儀半定量免疫組化方法免疫組化方法v酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué) 直接法直接法 間接法間接法v非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué) 酶橋法酶橋法 PAPPAP法、法、APAAPAPAAP法法 一

2、、酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法一、酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法（一）原理（一）原理 直接法和間接法。直接法和間接法。 直接法直接法- 是將酶標(biāo)記在第一抗體上是將酶標(biāo)記在第一抗體上, ,直接檢測細(xì)胞內(nèi)特異性抗原。直接檢測細(xì)胞內(nèi)特異性抗原。 間接法間接法-兩步法兩步法 一抗：是細(xì)胞組織內(nèi)抗原的特異性抗體；一抗：是細(xì)胞組織內(nèi)抗原的特異性抗體； 二抗：是抗一抗的抗體二抗：是抗一抗的抗體, ,并且已用酶標(biāo)記。并且已用酶標(biāo)記。 ( (注意注意: :第二抗體與第一抗體須是不同種屬動物制備的第二抗體與第一抗體須是不同種屬動物制備的, ,因因為第二抗體往往是用第一種動物的為第二抗體往往是用第一種動物的IgGIgG所

3、制備。所制備。) )原理：原理：將酶直接標(biāo)記在一抗上，將酶直接標(biāo)記在一抗上，然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成形成復(fù)合物，最后復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。用底物顯色劑顯色。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速、特異性強(qiáng)，簡便、快速、特異性強(qiáng)，非特異性背景反應(yīng)低。非特異性背景反應(yīng)低。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：浪費(fèi)抗體、敏感性極低。浪費(fèi)抗體、敏感性極低。依靠化學(xué)連接（共價鍵）對酶及依靠化學(xué)連接（共價鍵）對酶及抗體活性有影響。抗體活性有影響。每種抗原必須分別用其抗體的酶每種抗原必須分別用其抗體的酶標(biāo)記物。標(biāo)記物。酶標(biāo)抗體法酶標(biāo)抗體法- -直接法直接法酶標(biāo)抗體法酶標(biāo)抗體法- -間接法間接法原理

4、：原理：將酶標(biāo)記在二抗上，先將將酶標(biāo)記在二抗上，先將一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用二抗原抗體復(fù)合物，再用二抗( (酶標(biāo)抗酶標(biāo)抗體體) )與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成形成復(fù)合物，復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。最后用底物顯色劑顯色。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：只需一種酶標(biāo)抗體即可只需一種酶標(biāo)抗體即可 。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：敏感性低，但優(yōu)于直接法。敏感性低，但優(yōu)于直接法。依靠化學(xué)連接對酶及抗體活性有依靠化學(xué)連接對酶及抗體活性有影響。影響。v 免疫酶組織化學(xué)方法最終的生成物是帶有酶標(biāo)記免疫酶組織化學(xué)方法最終的生成物是帶有酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，再依據(jù)

5、酶與底物作用生成不溶的抗原抗體復(fù)合物，再依據(jù)酶與底物作用生成不溶性的有色產(chǎn)物沉積在抗原抗體反應(yīng)原位，并借此確性的有色產(chǎn)物沉積在抗原抗體反應(yīng)原位，并借此確定該抗原的性質(zhì)、存在的部位和含量。定該抗原的性質(zhì)、存在的部位和含量。v 酶酶 + + 底物底物=不溶性的色素不溶性的色素標(biāo)記酶標(biāo)記酶: : 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 (HRP)(HRP) 堿性磷酸酶堿性磷酸酶(ALP)(ALP) 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(GOD)(GOD) -D- -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶v 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) : 1 1 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 HRPHRP：顯色：顯色：產(chǎn)物棕褐色產(chǎn)物棕褐色 HRPHRP與與底物過

6、氧化氫和底物過氧化氫和DABDAB作用產(chǎn)物棕褐色，有嗜鋨性。作用產(chǎn)物棕褐色，有嗜鋨性。DABDAB性質(zhì)：性質(zhì)： 電子供體，較敏感，室溫時較穩(wěn)定，顯色后切片可長期電子供體，較敏感，室溫時較穩(wěn)定，顯色后切片可長期保存?？芍掳?，可將保存?？芍掳蓪ABDAB制成制成1010倍濃度儲存液，分裝后倍濃度儲存液，分裝后-20-20貯存。貯存。注意事項：注意事項：孵育時間和配置方式易產(chǎn)生背景著色孵育時間和配置方式易產(chǎn)生背景著色濃縮的濃縮的DABDAB按照說明書；注意校正蒸餾水的按照說明書；注意校正蒸餾水的PHPH值；值；粉劑粉劑DAB-DAB-溶解時濾去不溶性顆粒；溶解時濾去不溶性顆粒；現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配

7、-保存時可產(chǎn)生氧化物沉積在切片上，形成斑點(diǎn)。保存時可產(chǎn)生氧化物沉積在切片上，形成斑點(diǎn)。 臨用前加臨用前加H H2 2O O2 21 1 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 HRPHRP：v2 2 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 ALPALP：v顯色：產(chǎn)物藍(lán)色或紅色。顯色：產(chǎn)物藍(lán)色或紅色。v以磷酸萘酚以磷酸萘酚AS-MXAS-MX為底物，被為底物，被ALPALP水解后生成萘酚水解后生成萘酚AS-MXAS-MX，再與孵育液內(nèi)的堅牢藍(lán)，再與孵育液內(nèi)的堅牢藍(lán)B B鹽或堅牢紅鹽或堅牢紅TRTR鹽等鹽等偶聯(lián)生成不溶性染料偶聯(lián)生成不溶性染料( (堅牢藍(lán)或堅牢紅堅牢藍(lán)或堅牢紅) )而成。而成。v優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性

8、磷酸酶很容易被優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性磷酸酶很容易被抑制和破壞，而不會產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色，從而提高抑制和破壞，而不會產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色，從而提高特異性。特異性。v缺點(diǎn)：顯色彌散，不如過氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明缺點(diǎn)：顯色彌散，不如過氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明確。確。v2 2 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 ALPALP：v顯色：產(chǎn)物藍(lán)色或紅色。顯色：產(chǎn)物藍(lán)色或紅色。v以磷酸萘酚以磷酸萘酚AS-MXAS-MX為底物，被為底物，被ALPALP水解后生成萘酚水解后生成萘酚AS-MXAS-MX，再與孵育液內(nèi)的堅牢藍(lán)，再與孵育液內(nèi)的堅牢藍(lán)B B鹽或堅牢紅鹽或堅牢紅TRTR鹽等鹽等偶聯(lián)生成不溶性染料偶聯(lián)生成不溶性染料(

9、(堅牢藍(lán)或堅牢紅堅牢藍(lán)或堅牢紅) )而成。而成。v優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性磷酸酶很容易被優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性磷酸酶很容易被抑制和破壞，而不會產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色，從而提高抑制和破壞，而不會產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色，從而提高特異性。特異性。v缺點(diǎn)：顯色彌散，不如過氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明缺點(diǎn)：顯色彌散，不如過氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明確。確。3 GOD(3 GOD(葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶) )： 以以-D-D-葡萄糖底物葡萄糖底物，被，被GODGOD氧化生成的氧化生成的H H2 2O O2 2，又作為，又作為HRPHRP的催化底物，最后仍可用的催化底物，最后仍可用DABDAB顯色。顯色。 適用于

10、兩種酶的放大技術(shù)：適用于兩種酶的放大技術(shù)： 即用即用GODGOD和和HRPHRP分別標(biāo)記第二和第三抗體分別標(biāo)記第二和第三抗體( (如第一抗體是如第一抗體是小鼠小鼠mAbmAb，第二抗體為，第二抗體為GODGOD標(biāo)記的兔抗小鼠標(biāo)記的兔抗小鼠IgGIgG，第三抗，第三抗體為體為HRPHRP標(biāo)記的羊抗兔標(biāo)記的羊抗兔IgG)IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又，孵育液即含有葡萄糖，又含有含有DABDAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特異性。，此法可提高免疫染色的敏感性和特異性。呈色反應(yīng)注意要點(diǎn)：呈色反應(yīng)注意要點(diǎn)： 底物濃度：底物濃度： 應(yīng)夠高，保證最大反應(yīng)速度應(yīng)夠高，保證最大反應(yīng)速度; ; pH pH值：

11、值： 滿足酶活性的最適滿足酶活性的最適pHpH，常由緩沖液提供，常由緩沖液提供; ; 溫度：溫度： 室溫即室溫即18-2218-22，或，或3737； 時間時間： 顯色反應(yīng)時間應(yīng)在鏡下觀察來控制，顯色反應(yīng)時間應(yīng)在鏡下觀察來控制， 以特異性顯色清晰而背景又無非特異性著色時即可以特異性顯色清晰而背景又無非特異性著色時即可終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。（二）染色程序（二）染色程序1 1 直接法（冰凍切片）直接法（冰凍切片）1 1）新鮮組織切片）新鮮組織切片, ,冷丙酮固定冷丙酮固定10min,10min,干燥后干燥后, ,入入PBSPBS。2 2）0.3H H2 2O O2 2 - -甲醇液處理甲醇液處理30

12、30, ,封閉內(nèi)源性過氧化物酶封閉內(nèi)源性過氧化物酶; ;3 3）0.0l molmolLPBSLPBS洗洗3 3次。次。4) 54) 5-10-10正常羊血清室溫處理正常羊血清室溫處理30min30min。5) 1:50-1:100 HRP-5) 1:50-1:100 HRP-標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體, 37, 37孵育孵育6060或或44過夜。過夜。6) 6) 0.0l molmolL PBSL PBS洗洗3 3次。次。7) DAB7) DABH H2 2O O2 2顯色顯色( (新鮮配制新鮮配制) )。8) 8) 0.01molmolLPBSLPBS洗洗3 3次。次。9) 9) 梯度乙醇脫水，二甲

13、苯透明，封片。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。2 2 間接法間接法1) 1) 石蠟切片脫蠟至水；石蠟切片脫蠟至水； 冰凍切片冰凍切片 室溫干燥室溫干燥-丙酮固定丙酮固定-緩沖液漂洗溶去緩沖液漂洗溶去OCTOCT包埋劑包埋劑2) 2) 甲醇雙氧水室溫處理切片甲醇雙氧水室溫處理切片151530min,30min,封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。3) PBS3) PBS漂洗漂洗4) 4) 0.11 1牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA),(BSA),濕盒內(nèi)室溫孵育濕盒內(nèi)室溫孵育15152525, ,然后吸去孵育然后吸去孵育液液, ,不沖洗不沖洗. . 5% 5%1010正常兔血清正

14、常兔血清( (或山羊血清或山羊血清),),濕盒內(nèi)室溫孵育濕盒內(nèi)室溫孵育15152020然后吸去。然后吸去。5)5)滴加滴加PBSPBS適當(dāng)稀釋的第一抗體適當(dāng)稀釋的第一抗體, ,濕盒內(nèi)孵育濕盒內(nèi)孵育, ,或或44過夜過夜, ,或室溫或室溫2 24h4h。6) PBS6) PBS充分沖洗充分沖洗7) 7) 滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)第二抗體滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)第二抗體, ,濕盒孵育濕盒孵育45456060( (室溫或室溫或37)37)。8) PBS8) PBS漂洗漂洗(3(3次次, ,每次每次2-52-5) )。9)9)顯色：顯色： HRPHRP標(biāo)記抗體（標(biāo)記抗體（0.01- -0.1% H% H2 2O

15、O2 2 + + 0.01- -0.5DABDAB液）液） ALPALP標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體（2mg2mg磷酸萘酚磷酸萘酚AS-MX+AS-MX+0.2mlml二甲基甲酰胺，用前加堅牢紅二甲基甲酰胺，用前加堅牢紅TRTR鹽鹽) )。 切片入此液切片入此液, ,室溫室溫10101515。 GODGOD標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體（-D-D-葡萄糖葡萄糖67mg + 67mg + 硝基藍(lán)四唑硝基藍(lán)四唑6.7mg+6.7mg+吩嗪甲硫酸酯吩嗪甲硫酸酯0.107mgmg， 3737孵育孵育1h1h。10) 10) 流水中終止呈色反應(yīng)；流水中終止呈色反應(yīng)；11) 11) 復(fù)染細(xì)胞核（甲綠、蘇木精）；復(fù)染細(xì)胞核（甲綠、蘇

16、木精）；10s10s12) DAB12) DAB顯色標(biāo)本顯色標(biāo)本-樹膠封固。樹膠封固。 其它其它-水溶性介質(zhì)水溶性介質(zhì)( (如甘油明膠如甘油明膠) )封固。封固。13) 13) 鏡檢結(jié)果：按上法鏡檢結(jié)果：按上法HRPHRP陽性者呈棕色，陽性者呈棕色，ALPALP法陽性者呈紅法陽性者呈紅 色，色，GODGOD法陽性者呈藍(lán)色。法陽性者呈藍(lán)色。 二、非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法二、非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法 酶橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶法酶橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶法 PAPPAP( (一一) ) 酶橋法酶橋法1 1 原理：三種抗體原理：三種抗體一抗一抗二抗二抗-橋抗體橋抗體三抗三抗-抗酶抗酶

17、(HRP)(HRP)抗體抗體, , 酶酶(HRP)(HRP)與抗酶抗體結(jié)合與抗酶抗體結(jié)合, ,經(jīng)底物的顯色反應(yīng)將抗原顯示出來。經(jīng)底物的顯色反應(yīng)將抗原顯示出來。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：任何抗體均未被酶標(biāo)記任何抗體均未被酶標(biāo)記, ,酶是通過免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合酶是通過免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合, , 避免因避免因共價結(jié)合對抗體和酶活性的影響共價結(jié)合對抗體和酶活性的影響, ,敏感性高敏感性高, , 可節(jié)約一抗?？晒?jié)約一抗。需要同一種屬動物制備一抗和抗酶抗體。需要同一種屬動物制備一抗和抗酶抗體。非標(biāo)記抗體酶法非標(biāo)記抗體酶法 酶橋法酶橋法原理：原理：首先用酶免疫動物，制備首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強(qiáng)的抗

18、酶抗體；效價高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體；以二抗作橋，將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在以二抗作橋，將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在一抗上；一抗上； 再將酶結(jié)合在抗酶抗體再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，形成上，形成復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：任何抗體均未被酶標(biāo)記。任何抗體均未被酶標(biāo)記。酶是通過免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)酶是通過免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)合的。避免了共價連接對抗體和合的。避免了共價連接對抗體和酶活性的損害，提高了方法的敏酶活性的損害，提高了方法的敏感性，而且節(jié)省一抗的用量。感性，而且節(jié)省一抗的用量。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：敏感性低，抗酶抗體不易敏感性低，抗酶抗體不易純化。純化。2 2 酶橋法染色程序酶橋法

19、染色程序同上述酶標(biāo)抗體法。同上述酶標(biāo)抗體法。 滴加滴加第一抗體第一抗體, ,于濕盒內(nèi)于濕盒內(nèi)44孵育孵育161624h24h。 PBSPBS洗洗2 2次，每次次，每次5 5( (可振搖可振搖) )。 加加第二抗體第二抗體( (橋抗體橋抗體),),濕盒內(nèi)室溫孵育濕盒內(nèi)室溫孵育30306060。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。 加加抗酶抗酶(HRP)(HRP)抗體抗體, ,濕盒內(nèi)室溫孵育濕盒內(nèi)室溫孵育30306060。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。 加加過氧化物酶過氧化物酶(HRP)(HRP)溶液溶液(70(70100g100gm1),m1),濕盒內(nèi)室

20、溫濕盒內(nèi)室溫 孵育孵育3030。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。換。換TrisTris緩沖液洗緩沖液洗5 5。 顯色反應(yīng)及后處理同酶標(biāo)記法。顯色反應(yīng)及后處理同酶標(biāo)記法。 酶橋法的缺點(diǎn)：酶橋法的缺點(diǎn)： 抗酶抗體內(nèi)存在低親和力和高親和力兩類抗體；抗酶抗體內(nèi)存在低親和力和高親和力兩類抗體；低親和力抗酶抗體低親和力抗酶抗體-與酶結(jié)合力較弱，漂洗時易解離，與酶結(jié)合力較弱，漂洗時易解離，可使約可使約7070的酶丟失，因而降低了方法的敏感性；的酶丟失，因而降低了方法的敏感性；在抗酶抗體內(nèi)，也含有在抗酶抗體內(nèi)，也含有非特異性非特異性( (抗酶抗酶) )抗體抗體，因其抗，因其抗原性與抗酶抗

21、體相同，故也可與橋抗體結(jié)合，由于其未原性與抗酶抗體相同，故也可與橋抗體結(jié)合，由于其未與酶結(jié)合，也會影響細(xì)胞組織內(nèi)抗原的顯示。與酶結(jié)合，也會影響細(xì)胞組織內(nèi)抗原的顯示。( (二二) PAP) PAP法（過氧化物酶抗過氧化物酶法）法（過氧化物酶抗過氧化物酶法） PAPPAP復(fù)合物：復(fù)合物： 抗酶抗體抗酶抗體 + + 足量的酶足量的酶 = = 形成穩(wěn)定的五角形復(fù)合物形成穩(wěn)定的五角形復(fù)合物 ( (由三個過氧化物酶分子和二個抗酶抗體分子組成由三個過氧化物酶分子和二個抗酶抗體分子組成) ) 原理：三種抗體原理：三種抗體 PAPPAP復(fù)合物代替了酶橋法中的抗酶抗體。復(fù)合物代替了酶橋法中的抗酶抗體。 一抗一抗

22、二抗二抗-橋抗體橋抗體 PAPPAP復(fù)合物復(fù)合物 要求：要求： 抗酶抗體的動物種屬應(yīng)和制備第一抗體的動物相同。抗酶抗體的動物種屬應(yīng)和制備第一抗體的動物相同。 非標(biāo)記抗體酶法非標(biāo)記抗體酶法-PAP-PAP法法雙雙PAPPAP法法原理：原理：同酶橋法，只是把抗酶抗體同酶橋法，只是把抗酶抗體- -酶制成酶制成復(fù)合物（復(fù)合物（PAPPAP復(fù)合物），形成復(fù)合物），形成復(fù)合物。復(fù)合物。v優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： PAPPAP復(fù)合物結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，沖洗時酶分子不會脫落，靈敏度高，比酶橋法復(fù)合物結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，沖洗時酶分子不會脫落，靈敏度高，比酶橋法高高2020倍；倍； PAPPAP是一種復(fù)合物，無游離免疫球蛋白存在，不易引起非特異性染色；是一種復(fù)合物，無游離免疫球蛋白存在，不易引起非特異性染色； 雙雙PAPPAP法：通過兩次連接橋抗體和法：通過兩次連接橋抗體和PAPPAP復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了更多的酶分子，使敏感性大大增強(qiáng)，更適用于常規(guī)石蠟切片中微量和合了更多的酶分子，使敏感性大大增強(qiáng)，更適用于常規(guī)石蠟切片中微量和抗原性減弱的抗原檢測?？乖詼p弱的抗原檢測。v缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： PAPPAP復(fù)合物制備較復(fù)雜；復(fù)合物制備較復(fù)雜； 免疫染色步驟多、需時長；免疫染色步驟多、需時長； 由于由于PAPPAP復(fù)合物分子量較大，對