(完整word版)蛋白純化AKTA操作說明

1、AKTA pure 操作說明分子篩層析操作步驟：1. 開機(jī)：打開 AKTA pure 開關(guān)，看指示燈，泵同步（泵內(nèi)有注入液體的聲音）。2. 打開系統(tǒng)：打開電腦：雙擊Unicorn 7.0 打開系統(tǒng)，進(jìn)入 log on 界面，用戶名默認(rèn)為Default ，輸入密碼： default ，點(diǎn) ok 鍵，出現(xiàn)提示對話框，繼續(xù)點(diǎn)確定，進(jìn)入系統(tǒng)。注 意 ： 進(jìn)入系 統(tǒng) 時(shí) 會(huì)彈出 三 個(gè)界 面： SystemControl 界 面， Evaluation 界 面 和Administration 界面。其中 system Control 界面為主操作窗口，所有的設(shè)置選項(xiàng)都是在該界面下完成： Manual-E

2、xecute Manual instructions-. ； Evaluation界面為結(jié)果數(shù)據(jù)查看及處理窗口； Administration 界面為 Unicorn 7.0 系統(tǒng)設(shè)置界面。3.洗泵：把 A1 泵頭從 20%乙醇中取出，用去離子水沖洗，放入分子篩緩沖液中，在SystemControl 界面下，點(diǎn)擊 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開 inlet ，選擇 A1-Excuse 。4.設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置柱壓 -Execut

3、e ；設(shè)流速： Pumps-System flow -設(shè)置 system flow （1mL/min ） -Execute 。注意： 流速和柱壓設(shè)置參照“GE 蛋白純化柱表” ，不要超出最高限制。5. 裝柱子 (先上后下 )：接柱子的上面：擰下連接進(jìn)樣閥和檢測器之間的線，等進(jìn)樣閥出口有液體流出時(shí)，擰開柱上面線頭的螺帽，將它連到進(jìn)樣閥出口；接柱子的下面：去掉柱下端連接的注射器，連上接頭，連上一段線，待液體滴出滴出液體滴到檢測器上的連接口的洞里，滴滿，將接頭連到檢測器的連接口里。6.平衡柱子：分子篩 buffer 平衡柱子，一般要兩個(gè)小時(shí)左右，鹽離子濃度達(dá)到5.5%左右。7.設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命

4、 名：先 end-Manual instructions ，點(diǎn)擊 browse，彈出 select result name&location面，點(diǎn)開文件夾“defaultHome ”，找到文件夾“l(fā)abdata”，點(diǎn)開，選擇自己名字首字母縮寫文件夾(已創(chuàng)建 )，在界面下方“name”指令框進(jìn)行命名。注意： 命名時(shí)要標(biāo)明日期，柱子型號(hào) ，樣品名稱 。設(shè)流速： Pumps-System flow- 設(shè)流速（ 1 mL/min ） -Execute ；設(shè)柱壓： Alams- alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置柱壓 -點(diǎn)擊 Execute；界洗 A 泵： Pumps

5、-Pump A wash- 點(diǎn)開 inlet ，選擇 A1-Excuse ；紫外調(diào)零： Monitors-Auto zero UV-Execute ；設(shè)置收集體積：Fracton collection-peakfractionation-fractionsize-設(shè)置收集體積-Execute；一般設(shè)為1 mL( 可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整)。設(shè)置收集水平：Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level-設(shè)置起始收集水平 - Execute 。注意： 對于初次純化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可設(shè)低些，如 10 mAU, 避免

6、損失蛋白。8.上樣：沖洗 Loop 環(huán)：取 5mL 注射器，吸取5 mL 分子篩（不能有氣泡） ，從進(jìn)樣口注射2 倍Loop 體積的分子篩來清洗Loop 環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白樣品（ 2 mL ），12000 rpm 離心 3 min，把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管管，重復(fù)一次，以去除沉淀，避免堵塞系統(tǒng)；手動(dòng)蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop 環(huán)內(nèi)；注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作，首先彈出注射器內(nèi)的氣泡，隨后稍推注射器，使注射器出口處懸掛一樣品液滴（別太用力，導(dǎo)致液滴滴落），然后把注射器插入進(jìn)樣口，把蛋白樣品推入Loop 環(huán)中。Inject: 點(diǎn)擊 Flow path-inj

7、ection valve-點(diǎn)開 position 選項(xiàng) -inject-Execute- 走 2 倍 Loop體積的分子篩緩沖液；Load:點(diǎn)擊 Flow path-injection valve-點(diǎn)開 position 選項(xiàng) -manual load-Execute ，調(diào)回Load 狀態(tài)。9.收集目標(biāo)蛋白：參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線， 估計(jì)樣品出峰位置， 收集蛋白樣品， 做好標(biāo)記，過完后，peak fracstop900 停止收集。10. 20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出來，離子濃度平衡后，點(diǎn)擊 pause，進(jìn)分子篩的 buffer 的泵頭用去離子水洗，放入 20%的乙醇中， continue- 洗泵

8、（ A1 泵），平衡柱子。 20% 的乙醇平衡柱子，一般要兩小時(shí)左右，鹽離子濃度達(dá)到0%。11.收柱子（先下后上）：調(diào)節(jié)流速至0.5 mL/min ，擰下柱下面的接頭，連上注射器，再調(diào)流速至1 mL/min ，注射器內(nèi)吸入3-5 mL 20%乙醇，取下柱上面的接頭看是不是往外流液體，因?yàn)樽⑸淦鲀?nèi)有壓力，液體會(huì)倒流，蓋子內(nèi)滴滿液體，立即擰上蓋子，防止進(jìn)氣泡，將進(jìn)樣閥的線接到檢測器上。12.關(guān)閉系統(tǒng)：點(diǎn)擊 End 關(guān)閉系統(tǒng)界面，關(guān)閉AKTA pure 電源，關(guān)電腦。2018-09-01AKTA pure 操作說明離子交換蛋白純化步驟（RESOURCE Q/S ）1. 開機(jī)：打開 AKTA pure

9、 開關(guān)，看指示燈，泵同步（泵內(nèi)有注入液體的聲音）。2. 打開系統(tǒng)：打開電腦：雙擊 Unicorn 7.0 打開系統(tǒng) ,進(jìn)入 log on 界面，用戶名默認(rèn)為 Default, 輸入密碼： default,點(diǎn) ok 鍵，出現(xiàn)提示對話框，繼續(xù)點(diǎn)確定，進(jìn)入系統(tǒng)。注意：進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)會(huì)彈出三個(gè)界面： System Control 界面 , Evaluation 界面和 Administration 界面。其中 system Control 界面為主操作窗口，所有的設(shè)置選項(xiàng)都是在該界面下完成： Manual-Execute Manual instructions-. ； Evaluation 界面為結(jié)果數(shù)據(jù)

10、查看及處理窗口； Administration 界面為 Unicorn 7.0 系統(tǒng)設(shè)置界面。3. 洗泵：點(diǎn)擊 pause暫停系統(tǒng) - 去離子水沖洗A1,B1 進(jìn)液泵頭 - 分別放入A ， B 液中；洗 B 泵：選擇 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump洗 A 泵： 選擇 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-PumpA wash- 點(diǎn)開 inlet, 選擇 A1-Excuse, 洗泵結(jié)束后調(diào)B 至 100%，0min-Exe

11、cute 。4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置最高柱壓-Execute 。設(shè)流速： Pumps-System flow- 設(shè)置 system flow （1 mL/min ） -execute；注意： 流速和柱壓設(shè)置參照“GE 蛋白純化柱表” ，不要超出最高限制。5. 安裝 RESOURCE 柱（先上后下）：裝離子柱時(shí)先擰開離子柱上面， 連上來自進(jìn)樣閥的線， 邊擰緊上面邊擰松柱下面， 在離子柱子下端出口連上轉(zhuǎn)接頭， 接上一根較短的先并連到檢測器上 （流出液體， 滴滿檢測器上的連接口的洞里，再擰緊） 。6. 平衡 RE

12、SOURCE 柱：等 B 液平衡后， 點(diǎn)擊 Pumps-gradient-Target- 調(diào) B 至 0%，0min-Execute 。等平衡后，記錄最高和最低鹽離子濃度：離子交換 B 液鹽離子濃度約為 84%，離子交換 A 液鹽離子濃度約為 1.7%。7.設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命 名：先 end-Manual instructions ，點(diǎn)擊 browse，彈出 select result name&location 界面，點(diǎn)開文件夾“ defaultHome ”，找到文件夾“ labdata”，點(diǎn)開，選擇自己名字首字母縮寫文件夾 (已創(chuàng)建 )，在界面下方“ name”指令框進(jìn)行命名。注意：

13、命名時(shí)要標(biāo)明日期，柱子型號(hào) ，樣品名稱 。設(shè)流速： Pumps-System flow- 設(shè)流速（ 1 mL/min ） -Execute;設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置柱壓 -點(diǎn)擊 Execute；紫外調(diào)零： Monitors-Auto zero UV-Execute；設(shè)置收集體積：Fracton collection-peakfractionation-fractionsize- 設(shè)置收集體積-Execute；一般設(shè)為1 mL (可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整) 。設(shè)置收集水平：Fracton collection-peak fractio

14、nation parameters-Start level-設(shè)置起始收集水平 - Execute 。注意： 對于初次純化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可設(shè)低些，如 10 mAU ，避免損失蛋白。8.上樣：沖洗 Loop 環(huán)：取 5 mL 注射器，吸取5 mL 分子篩（不能有氣泡） ，從進(jìn)樣口注射2 倍Loop 體積的分子篩來清洗Loop 環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白樣品（ 2 mL ），12000 rpm 離心 3 min，把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管管，重復(fù)一次，以去除沉淀，避免堵塞系統(tǒng)；手動(dòng)蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop 環(huán)內(nèi)；注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作，首先彈出

15、注射器內(nèi)的氣泡，隨后稍推注射器，使注射器出口處懸掛一樣品液滴（別太用力，導(dǎo)致液滴滴落），然后把注射器插入進(jìn)樣口，把蛋白樣品推入Loop 環(huán)中。Inject: 點(diǎn)擊 Flow path-injectionvalve- 點(diǎn)開 position 選項(xiàng) -inject-execute- 走 2 倍Loop 體積的分子篩緩沖液；Load: 等流穿峰出來后，點(diǎn)擊Flow path-injectionvalve- 點(diǎn)開 position 選項(xiàng) -manualload-Execute ，調(diào)回 Load 狀態(tài)。注意： 流穿峰蛋白先別丟棄，它有可能是樣品沒有掛上柱子而直接流出來的目標(biāo)蛋白。9. 洗脫目的蛋白：Pumps-Gradient target 50% ， length 50 min ( 可調(diào) )-Execute ，自離子柱上洗脫結(jié)合的蛋白10. 收集目標(biāo)蛋白：收集洗脫下來的蛋白樣品，做好標(biāo)記，過完后，peak fracstop 900 停止收集。11. B 液平衡離子柱：Pumps-Gradient target 50% ， length 0 min- Execute ，至鹽離子濃度達(dá)到最高且平衡。如繼續(xù)純化其他蛋白樣品：要用 A 液再平衡后再上樣，步驟同上1-11。如不再純化其他蛋白樣品：點(diǎn)擊 pause 暫停系統(tǒng) -去離子水沖洗