第十五章DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組

1、Chapter 15 DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組的復(fù)制、修復(fù)和重組 1. 掌握遺傳信息傳遞的中心法則。掌握遺傳信息傳遞的中心法則。 2. 掌握掌握DNA復(fù)制的一般規(guī)律：復(fù)制的一般規(guī)律：DNA的半保留復(fù)制、的半保留復(fù)制、DNA的半不連續(xù)復(fù)制的概念。的半不連續(xù)復(fù)制的概念。 3.了解三種大腸桿菌了解三種大腸桿菌DNA聚合酶的催化特性及其功聚合酶的催化特性及其功 用；了解原核生物用；了解原核生物DNA的復(fù)制過程。的復(fù)制過程。 4.了解使了解使DNA損傷的因素；損傷的因素；DNA損傷的修復(fù)機(jī)制：損傷的修復(fù)機(jī)制： 錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、直接修錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、直接修

2、復(fù)、重組修復(fù)及傾向差錯(cuò)的修復(fù)的過程及過程所需要復(fù)、重組修復(fù)及傾向差錯(cuò)的修復(fù)的過程及過程所需要 的酶類；了解的酶類；了解DNA損傷修復(fù)的意義。損傷修復(fù)的意義。目的要求目的要求 19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick提出中心法則：遺傳信息的提出中心法則：遺傳信息的單向流動(dòng)。單向流動(dòng)。 1964-1970 1964-1970發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉(zhuǎn)錄及逆轉(zhuǎn)錄及RNARNA的復(fù)制存在于的復(fù)制存在于RNARNA病毒病毒 中 心 法 則中 心 法 則病毒（復(fù)制）病毒（復(fù)制）復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯

3、逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 復(fù)制：復(fù)制：以親代以親代DNADNA或或RNARNA為模板，根據(jù)為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則堿基配對(duì)的原則，在一，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNADNA或或RNARNA的過程。的過程。 轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄：以以DNADNA為模板，按照堿基配對(duì)原則合成為模板，按照堿基配對(duì)原則合成RNARNA，即將即將DNADNA所所含的遺傳信息傳給含的遺傳信息傳給RNARNA，形成一條形成一條與與DNADNA鏈互補(bǔ)的鏈互補(bǔ)的RNARNA的過程。的過程。 翻譯：翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNAmRNA為模板，將為模板，將mRNAmRNA的密碼解讀成蛋白的

4、密碼解讀成蛋白質(zhì)的質(zhì)的氨基酸順序氨基酸順序的過程。的過程。 逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄：以以RNARNA為模板，在為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，生成作用下，生成DNADNA的過程。的過程。幾個(gè)基本概念幾個(gè)基本概念Reverse transcription1 DNA的代謝的代謝一、一、DNA代謝包括代謝包括DNA復(fù)制、修復(fù)和重組復(fù)制、修復(fù)和重組二、大腸桿菌遺傳圖二、大腸桿菌遺傳圖 遺傳圖：遺傳圖：通過遺傳學(xué)方法測(cè)定的一物種各基因通過遺傳學(xué)方法測(cè)定的一物種各基因沿著染色體相對(duì)順序和位置的排列圖。沿著染色體相對(duì)順序和位置的排列圖。 一、關(guān)于模板的概念一、關(guān)于模板的概念二、二、DNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制

5、1. 定義定義 以以親代親代DNA雙鏈雙鏈為模板以為模板以堿基互補(bǔ)堿基互補(bǔ)方式合成子代方式合成子代DNA，這樣新形成的子代這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制半保留復(fù)制。 2. 半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù)半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù) 1958年年Meselson和和Stahl用用15N標(biāo)記標(biāo)記大腸桿菌大腸桿菌DNA，首先證明了，首先證明了DNA的半保留復(fù)制。的半保留復(fù)制。全保留與全保留與全新復(fù)制全新復(fù)制分散復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制半保留復(fù)制DNADNA半保半保留復(fù)留復(fù)制圖制圖示示半 保 留 復(fù)

6、制 的 證 明半 保 留 復(fù) 制 的 證 明 Meselson和和Stahl將將15N標(biāo)記的標(biāo)記的15NH4Cl加入大腸桿菌加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌代，使大腸桿菌DNA都帶上都帶上15N標(biāo)記，標(biāo)記，然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,分離分離子一代、子二代、子三代、子四代子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進(jìn)行進(jìn)行氯氯化銫化銫密度梯度離心，實(shí)驗(yàn)證明了密度梯度離心，實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制。的半保留復(fù)制。親代親代DNADNA（1515N N1515N N）子一代子一代DNADNA（1515N N1414N

7、 N）子二代子二代DNA(DNA(1515N N1414N,N,1414N N1414N 1N 1:1)1)子三代子三代DNA(DNA(1515N N1414N,N,1414N N1414N 1N 1:3)3)子四代子四代DNA(DNA(1515N N1414N,N,1414N N1414N 1N 1:7 7) )親代親代DNADNA與子二代與子二代DNADNA的混合物的混合物親代親代DNADNA與子四代與子四代DNADNA的混合物的混合物D N AD N A 半 保 留 復(fù) 制 的 生 物 學(xué) 意 義半 保 留 復(fù) 制 的 生 物 學(xué) 意 義 DNA的半保留復(fù)制表明的半保留復(fù)制表明DNA在代

8、謝上的在代謝上的穩(wěn)定性穩(wěn)定性，是保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代必要措施。是保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代必要措施。 DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物。是一種惰性物。雙向復(fù)制雙向復(fù)制單向復(fù)制單向復(fù)制復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉DNADNA復(fù)制的主要方式復(fù)制的主要方式 大腸桿菌雙鏈大腸桿菌雙鏈環(huán)狀環(huán)狀DNADNA的復(fù)制（的復(fù)制（一個(gè)一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制） 真核細(xì)胞真核細(xì)胞線狀染色體線狀染色體DNADNA的復(fù)制方式（的復(fù)制方式（多個(gè)多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙復(fù)制起點(diǎn)，雙 向復(fù)制）向復(fù)制） 單向單向滾環(huán)式滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體復(fù)制（噬菌體 X174D

9、NA X174DNA 單鏈環(huán)狀）單鏈環(huán)狀）3 不同位置不同位置D-D-環(huán)式環(huán)式復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNADNA：兩條鏈兩條鏈 的的復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)不同位置，且復(fù)制不同步）不同位置，且復(fù)制不同步）前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈滯后鏈滯后鏈岡崎片段岡崎片段前導(dǎo)鏈：前導(dǎo)鏈：以以3 5 方向的方向的親代鏈為模板連續(xù)合成的子代親代鏈為模板連續(xù)合成的子代鏈。鏈。滯后鏈：滯后鏈：以以5 3方向方向的親代鏈為模板的子代鏈先的親代鏈為模板的子代鏈先逆復(fù)制叉移動(dòng)方向合成岡崎逆復(fù)制叉移動(dòng)方向合成岡崎片片段，再連接成滯后鏈。段，再連接成滯后鏈。半 不 連 續(xù) 復(fù) 制 的 發(fā) 現(xiàn)半 不 連 續(xù) 復(fù) 制 的 發(fā)

10、 現(xiàn) 日本學(xué)者岡崎（日本學(xué)者岡崎（1968 1968 ）：）：用用3 3H H dTdT標(biāo)記標(biāo)記T T4 4噬菌體感染大腸桿噬菌體感染大腸桿菌菌 短時(shí)間內(nèi)分離的短時(shí)間內(nèi)分離的DNADNA均為均為DNADNA小片段小片段 一段時(shí)間后一段時(shí)間后 檢測(cè)到檢測(cè)到 DNADNA大片段。當(dāng)用大片段。當(dāng)用DNADNA連接酶缺失的變異株時(shí)，檢測(cè)到連接酶缺失的變異株時(shí)，檢測(cè)到大量大量DNADNA小小片段的積累。證明片段的積累。證明DNADNA復(fù)制中有小片段合成。復(fù)制中有小片段合成。 一、一、DNA是由是由DNA聚合酶催化合成的聚合酶催化合成的n 原料：原料：四種脫氧核苷三磷酸（四種脫氧核苷三磷酸（dNTPdNT

11、P）n 需要需要模板：模板：以以DNADNA為模板鏈，合成子代為模板鏈，合成子代DNADNA，模板可以是雙鏈模板可以是雙鏈, , 也可以是單鏈也可以是單鏈DNADNA。合成產(chǎn)物與模板互補(bǔ)。合成產(chǎn)物與模板互補(bǔ)。n 需要需要引物：引物：一小段一小段RNA(RNA(或或DNADNA）為引物，在大腸桿菌中，為引物，在大腸桿菌中，DNADNA 的合成需要一段的合成需要一段RNARNA鏈作為引物鏈作為引物，引物含，引物含33- -OHOH。 n 合成方向：合成方向：5 5 3 3 DNA聚合酶聚合酶 1956年，年，Kornberg等在大腸桿菌中首先發(fā)現(xiàn)等在大腸桿菌中首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，聚合酶，其后發(fā)現(xiàn)

12、該酶在許多生物中廣泛存在。其后發(fā)現(xiàn)該酶在許多生物中廣泛存在。該酶的催化性質(zhì)如下：該酶的催化性質(zhì)如下：二、二、DNADNA復(fù)制的精確性（高保真復(fù)制）復(fù)制的精確性（高保真復(fù)制） DNA復(fù)制必須具有復(fù)制必須具有高度精確性高度精確性，在大腸桿菌的細(xì)胞，在大腸桿菌的細(xì)胞DNA復(fù)制復(fù)制中其中其錯(cuò)誤率約為錯(cuò)誤率約為1/1091/1010，即每即每1091010個(gè)核苷酸才出現(xiàn)一個(gè)核苷酸才出現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)誤，也就是大腸桿菌染色體個(gè)錯(cuò)誤，也就是大腸桿菌染色體DNA復(fù)制復(fù)制100010000次才出現(xiàn)次才出現(xiàn)一個(gè)核苷酸的錯(cuò)誤。這么高的精確性的保證主要與下列因素有關(guān)：一個(gè)核苷酸的錯(cuò)誤。這么高的精確性的保證主要與下列因素有關(guān)：

13、 （1）堿基的配對(duì)規(guī)律：）堿基的配對(duì)規(guī)律：摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對(duì)保證摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對(duì)保證堿基配錯(cuò)幾率約為堿基配錯(cuò)幾率約為1/1041/105。 （2）DNA聚合酶的聚合酶的35外切酶活性的校對(duì)功能，外切酶活性的校對(duì)功能，使堿基使堿基的錯(cuò)配幾率又降低的錯(cuò)配幾率又降低1001000倍。倍。 （3）DNA的損傷修復(fù)系統(tǒng)。的損傷修復(fù)系統(tǒng)。三、大腸桿菌三種三、大腸桿菌三種DNADNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 1956年年Kornberg首先從首先從大腸桿菌大腸桿菌中分離。該中分離。該酶為單體酶，含一個(gè)鋅原子。為酶為單體酶，含一個(gè)鋅原子。為多功能酶多功能酶，具有，具有: （1）5

14、 3 聚合酶聚合酶功能（但持續(xù)合成功能（但持續(xù)合成DNA的能力差）；的能力差）； （2）3 5外切酶外切酶活性（校對(duì)功能）；活性（校對(duì)功能）； （3）還具有）還具有5 3外切酶外切酶活性（雙鏈有效）；活性（雙鏈有效）； 該酶缺失時(shí)大腸桿菌仍具有該酶缺失時(shí)大腸桿菌仍具有DNA合成酶活性，只是對(duì)合成酶活性，只是對(duì)DNA損損傷的修復(fù)能力傷的修復(fù)能力下降，容易導(dǎo)致變異和死亡。推測(cè)該酶主要是對(duì)下降，容易導(dǎo)致變異和死亡。推測(cè)該酶主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)，以及在損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時(shí)復(fù)制時(shí)RNA引物切除及其缺口引物切除及其缺口的填補(bǔ)。的填補(bǔ)。 Arthur Kornberg Arthur Kornb

15、erg 1918 Stanford University Stanford University Stanford, CA, USAStanford, CA, USA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acidDNADNA聚合酶聚合酶 多亞基酶，聚合作用，聚合活力比多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNADNA聚合酶聚合酶高；高；

16、持續(xù)合成持續(xù)合成DNADNA的能力差。該酶缺失時(shí)大腸桿菌仍具有的能力差。該酶缺失時(shí)大腸桿菌仍具有DNADNA合成能力，推測(cè)該酶仍然不是真正的合成能力，推測(cè)該酶仍然不是真正的DNADNA聚合酶。聚合酶。該酶該酶具有具有33 5 5外切酶活性外切酶活性。其功能可能其功能可能在在修復(fù)紫外光引起的修復(fù)紫外光引起的DNADNA損傷損傷中起作用。中起作用。DNADNA聚合酶聚合酶 含含十種亞基十種亞基: ()，其中其中()稱為稱為核心酶核心酶，2稱稱為夾子，（為夾子，（2）組成）組成復(fù)合物復(fù)合物，其主要功能是幫助，其主要功能是幫助亞基亞基夾住夾住DNA，故稱為故稱為夾子裝配器夾子裝配器，該酶，該酶DNA合

17、成的合成的持續(xù)能力強(qiáng)持續(xù)能力強(qiáng)，主要與該結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外，該酶合成主要與該結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外，該酶合成速度大，活性高，速度大，活性高，缺失缺失時(shí) 大 腸 桿 菌 因時(shí) 大 腸 桿 菌 因 D N A 復(fù) 制 抑 制 而 致 死 。復(fù) 制 抑 制 而 致 死 。因此認(rèn)為該酶因此認(rèn)為該酶DNA的真正復(fù)制酶的真正復(fù)制酶。亞基亞基相對(duì)分子相對(duì)分子量量亞基亞基數(shù)目數(shù)目基因基因亞基功能亞基功能1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadXholAholBholCholDdnaN聚合作用聚合作用3

18、5外切酶的校對(duì)功能外切酶的校對(duì)功能組建核心酶組建核心酶使核心酶二聚化使核心酶二聚化依賴依賴DNADNA的的ATPATP酶，形成酶，形成復(fù)合物復(fù)合物與與亞基結(jié)合，形成亞基結(jié)合，形成復(fù)合物復(fù)合物形成形成復(fù)合物復(fù)合物形成形成復(fù)合物復(fù)合物形成形成復(fù)合物復(fù)合物兩個(gè)兩個(gè)亞基形成滑動(dòng)夾子，以提高酶亞基形成滑動(dòng)夾子，以提高酶的持續(xù)合成能力。的持續(xù)合成能力。DNADNA聚合酶聚合酶全酶的亞基組成全酶的亞基組成前導(dǎo)鏈的合成前導(dǎo)鏈的合成滯后鏈的合成滯后鏈的合成DNA雙螺旋雙螺旋 DNA PolDNA Pol DNA Pol 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因不同種類的亞基數(shù)目不同種類的亞基數(shù)目相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量35外切酶外切酶

19、53外切酶外切酶聚合速度（核苷酸聚合速度（核苷酸/分）分）持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力功能功能Pol A1103,0001,000-1,2003-200切除引物，修復(fù)Pol B788,0002,4001,500修復(fù)Pol C10830,00015,000-60,000500,000復(fù)制大腸桿菌三種大腸桿菌三種DNA聚合酶比較聚合酶比較蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)功能功能相對(duì)分子量相對(duì)分子量（10103 3）分子分子/ /細(xì)胞細(xì)胞DNADNA旋轉(zhuǎn)酶旋轉(zhuǎn)酶（或拓?fù)洚悩?gòu)酶）（或拓?fù)洚悩?gòu)酶）DNADNA解鏈酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白引物合成酶引物合成酶DNADNA聚合酶聚合酶引入或松開超螺旋引入或松開超螺旋使雙鏈?zhǔn)?/p>

20、雙鏈DNADNA解鏈解鏈穩(wěn)定單鏈區(qū)穩(wěn)定單鏈區(qū)合成合成RNARNA引物引物除去引物并填滿缺口除去引物并填滿缺口4004006565747460601091095050300300100100300300四、四、DNADNA復(fù)制許多酶和蛋白因子復(fù)制許多酶和蛋白因子 拓?fù)洚悩?gòu)酶：拓?fù)洚悩?gòu)酶：催化催化DNADNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶, ,在在DNADNA重組修復(fù)和其重組修復(fù)和其它它轉(zhuǎn)變方面起重要作用。轉(zhuǎn)變方面起重要作用。 除連環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的除連環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的DNADNA分子稱為分子稱為拓拓?fù)洚悩?gòu)體撲異構(gòu)體，催化拓?fù)洚悩?gòu)體之間互變的酶稱為，催化拓?fù)洚悩?gòu)

21、體之間互變的酶稱為拓?fù)渫負(fù)洚悩?gòu)酶異構(gòu)酶。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 使使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負(fù)超螺旋，反應(yīng)不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，松解負(fù)超螺旋，反應(yīng)不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 使使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入負(fù)超螺旋時(shí)需要由負(fù)超螺旋時(shí)需要由ATP提供能量，同復(fù)制有關(guān)。提供能量，同復(fù)制有關(guān)。 二者共同控制二者共同控制DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。兩 類 拓 撲 異 構(gòu) 酶 作 用 特 點(diǎn)兩 類 拓 撲 異 構(gòu) 酶 作 用 特 點(diǎn) 解螺旋酶（解鏈酶）解

22、螺旋酶（解鏈酶） 通過水解通過水解ATP將將DNA兩條鏈打兩條鏈打開。開。E.coli中中rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開一對(duì)堿基需要水解每解開一對(duì)堿基需要水解2 ATP分子。分子。 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白 穩(wěn)定穩(wěn)定DNA解開的單鏈，防止復(fù)性和保解開的單鏈，防止復(fù)性和保護(hù)單鏈部分不被核酸酶水解。護(hù)單鏈部分不被核酸酶水解。 引物合成酶引物合成酶 催化引物催化引物RNA的生成。的生成。 引發(fā)前體引發(fā)前體 它由多種蛋白質(zhì)它由多種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n和和 i 組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。組成。引發(fā)前體再

23、與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。 引發(fā)體可以沿模板鏈引發(fā)體可以沿模板鏈5 3方向移動(dòng)，具有方向移動(dòng)，具有識(shí)別合成識(shí)別合成起始位點(diǎn)起始位點(diǎn)的功能，移動(dòng)到一定位置上即可引發(fā)的功能，移動(dòng)到一定位置上即可引發(fā)RNA引物合成。引物合成。移動(dòng)和引發(fā)均需要移動(dòng)和引發(fā)均需要ATP提供能量，提供能量，n蛋白具有蛋白具有ATP酶活力。酶活力。引發(fā)體的移動(dòng)與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同，與引發(fā)體的移動(dòng)與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同，與岡崎片段岡崎片段的合成的合成方向相反。方向相反。細(xì)胞細(xì)胞DNA復(fù)制的階段性（以大腸桿菌為例）復(fù)制的階段性（以大腸桿菌為例）一、復(fù)制的起始階段一、復(fù)制的起始階段1 1、起始復(fù)合物的形成：稱為引發(fā)、起始復(fù)合物的

24、形成：稱為引發(fā)2 2、RNARNA引物的合成引物的合成二、二、復(fù)制的延長階段復(fù)制的延長階段三、復(fù)制的終止階段三、復(fù)制的終止階段復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)oriC和原點(diǎn)的識(shí)別和原點(diǎn)的識(shí)別 DNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)，常用，常用ori C（或（或o）表示。大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)表示。大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)ori C由由245 bp構(gòu)成，含兩構(gòu)成，含兩組保守的重復(fù)序列：三個(gè)組保守的重復(fù)序列：三個(gè)13 bp的序列（富含的序列（富含A、T的序列）和的序列）和四個(gè)四個(gè)9 bp的序列；許多生物的復(fù)制原點(diǎn)也都的序列；許多生物的復(fù)制原點(diǎn)也都富含富含A、T區(qū)段區(qū)段。 復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制

25、原點(diǎn)由由DnaA蛋白識(shí)別，在原點(diǎn)由蛋白識(shí)別，在原點(diǎn)由DnaB蛋白（解螺旋酶）蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補(bǔ)鏈將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補(bǔ)鏈（DNA雙鏈的解開還需雙鏈的解開還需DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶、SSB），在原點(diǎn)處），在原點(diǎn)處形成一個(gè)眼狀結(jié)構(gòu)，叫形成一個(gè)眼狀結(jié)構(gòu)，叫復(fù)制眼復(fù)制眼。 從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位復(fù)制單位，叫，叫復(fù)制子復(fù)制子（基因組（基因組獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位）。獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位）。1 1. . 拓?fù)洚悩?gòu)酶解開超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶解開超螺旋。2 2. . DnaDna A A蛋白識(shí)別并在蛋白識(shí)

26、別并在ATPATP存在下存在下結(jié)合于四個(gè)結(jié)合于四個(gè)9 9 bpbp重復(fù)序列。重復(fù)序列。3 3. . 在類組蛋白（在類組蛋白（HUHU）、）、ATPATP參與參與下下, , Dan ADan A蛋白變性蛋白變性13 13 bpbp的重復(fù)的重復(fù)序列，形成開鏈復(fù)合物。序列，形成開鏈復(fù)合物。4 4. . DnaDna B B借助于水解借助于水解ATPATP產(chǎn)生的能產(chǎn)生的能量在量在DnaDna C C的幫助下沿的幫助下沿5 5 3 3 方向移動(dòng)，解開方向移動(dòng)，解開DNADNA雙鏈，形成前雙鏈，形成前引引發(fā)復(fù)合物。發(fā)復(fù)合物。5 5. . 單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6 6. . 引物合

27、成酶（引物合成酶（DnaDna G G蛋白）開蛋白）開始合成始合成RNARNA引物。引物。一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始 真核生物真核生物的岡崎片段為：的岡崎片段為：100 - 200 100 - 200 bpbp 原核生物原核生物的岡崎片段為：的岡崎片段為：1000-2000 1000-2000 bpbpD N AD N A 鏈 的 延 伸鏈 的 延 伸 在在DNADNA聚合酶聚合酶催化下，以四催化下，以四種種5-5-脫氧核苷三磷酸為底物，脫氧核苷三磷酸為底物，在在RNARNA引物的引物的33端以磷酸二酯鍵端以磷酸二酯鍵連接脫氧核糖核苷酸并釋放出焦連接脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。磷酸。DNA

28、DNA鏈延伸的同時(shí)進(jìn)行前鏈延伸的同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和滯后鏈合成。兩條鏈方向?qū)ф満蜏箧満铣?。兩條鏈方向相反。相反。 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈 滯后鏈滯后鏈 岡崎片段岡崎片段 半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型岡崎模型 前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成（前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成（DNADNA聚合酶的異二聚體催化）聚合酶的異二聚體催化）DNADNA連接酶：連接連接酶：連接DNADNA雙鏈中的單鏈切口雙鏈中的單鏈切口作用特點(diǎn)作用特點(diǎn) 大腸桿菌和其它細(xì)菌的大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶連接酶要求要求NAD+提供能量；提供能量；在高等生物和噬菌體中，則要求在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。提供能量。T4噬菌體噬菌體DNA連接

29、酶不僅能連接雙鏈連接酶不僅能連接雙鏈DNA的粘性切口，而且能連的粘性切口，而且能連接無粘性末端的平頭雙鏈接無粘性末端的平頭雙鏈DNA。 DNA連接酶在連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重等過程中起重要作用。要作用。順時(shí)針終止陷阱順時(shí)針終止陷阱逆時(shí)針終止陷阱逆時(shí)針終止陷阱 TerTer: :終止陷阱，引起復(fù)制終止的特定區(qū)域，終止陷阱，引起復(fù)制終止的特定區(qū)域，2020bpbp的序列，終止的序列，終止利用物質(zhì)利用物質(zhì)TusTus可識(shí)別并結(jié)合，從而導(dǎo)致可識(shí)別并結(jié)合，從而導(dǎo)致DNADNA復(fù)制的終止。復(fù)制的終止。連環(huán)、解連環(huán)連環(huán)、解連環(huán)四、真核生物四、真核生物DNADNA復(fù)制

30、復(fù)制的特點(diǎn)的特點(diǎn) 1. 真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，稱真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，稱自主復(fù)制序列自主復(fù)制序列(ARS)或復(fù)制基因或復(fù)制基因(replicator)；多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。；多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。 2. 岡崎片段長約岡崎片段長約200 bp，相當(dāng)于核小體長度相當(dāng)于核小體長度。 3. 真核生物真核生物DNA復(fù)制速度復(fù)制速度比原核比原核慢慢，速度為，速度為10003000 bp/ Min（僅為原核生物的（僅為原核生物的1/201/50）。）。 4. 真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點(diǎn)不再重新開始復(fù)制；真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點(diǎn)不再重新開始復(fù)制；而在快速

31、生長的原核生物染色體而在快速生長的原核生物染色體DNA復(fù)制中，起點(diǎn)可以連續(xù)復(fù)制中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物快速生長時(shí)，往往采用發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物快速生長時(shí)，往往采用更多復(fù)制起點(diǎn)更多復(fù)制起點(diǎn)。5. 真核生物有真核生物有多種多種DNA聚合酶聚合酶，DNA聚合酶聚合酶（）是真正）是真正的復(fù)制酶，在的復(fù)制酶，在增殖細(xì)胞核抗原增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）存在下有持續(xù)合成）存在下有持續(xù)合成能力。能力。PCNA相當(dāng)于大腸桿菌相當(dāng)于大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶的的-夾子，夾子，RFC蛋白相當(dāng)于夾子裝配器。蛋白相當(dāng)于夾子裝配器。6. 真核生物線性染色體兩端有真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)端粒結(jié)構(gòu)，它是由許多

32、成串的，它是由許多成串的短重復(fù)序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，防止染短重復(fù)序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接，并可補(bǔ)償滯后鏈色體間的末端連接，并可補(bǔ)償滯后鏈5-末段在消除末段在消除RNA引引物后造成的空缺，使染色體物后造成的空缺，使染色體保持保持一定長度一定長度。端粒酶端粒酶是含一段是含一段RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶。的逆轉(zhuǎn)錄酶。 7. RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白；真核生物的單鏈結(jié)合蛋白；RNaseH1和和MF-1切除切除RNA引物，引物，DNA聚合酶聚合酶填補(bǔ)缺口。填補(bǔ)缺口。DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA

33、聚合酶聚合酶DNADNA聚合聚合酶酶定位定位亞基數(shù)目亞基數(shù)目外切酶活性外切酶活性引物合成酶活性引物合成酶活性持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力抑制劑抑制劑功能功能細(xì)胞核細(xì)胞核4中等中等蚜腸霉素蚜腸霉素引物合成引物合成細(xì)胞核細(xì)胞核1低低雙脫氧雙脫氧TTP修復(fù)修復(fù)線粒體線粒體235外切酶外切酶高高雙脫氧雙脫氧TTP線粒體線粒體DNA合成合成細(xì)胞核細(xì)胞核2 35外切酶外切酶有有PCNA時(shí)高時(shí)高蚜腸霉素蚜腸霉素核核DNA合成合成細(xì)胞核細(xì)胞核153 外切酶外切酶高高蚜腸霉素蚜腸霉素修復(fù)修復(fù) (POL )真核細(xì)胞內(nèi)有五種真核細(xì)胞內(nèi)有五種DNADNA聚合酶聚合酶細(xì)菌和真核生物復(fù)制體的組成細(xì)菌和真核生物復(fù)制體的組成 組

34、 成 細(xì) 菌 真 核 生 物復(fù)制酶POL全酶POL/POL進(jìn)行性因子夾子增殖細(xì)胞核抗原定位因子復(fù)合物RF-C(夾子裝配器)引物合成酶Dna GPOL除去引物RNase H和POLRNase H和MF-1滯后鏈修復(fù)POL和DNA連接酶POL和DNA連接酶解螺旋酶Dna B（旋轉(zhuǎn)酶）T抗原消除螺旋張力旋轉(zhuǎn)酶TOP單鏈結(jié)合SSBRP-A六、逆轉(zhuǎn)錄（六、逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription reverse transcription ） 定義定義: 以以RNA為模板，按照為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成中的核苷酸順序合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行。的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄，由

35、逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行。 1970年年Temin等和等和Baltimore分別從分別從勞氏肉瘤病毒勞氏肉瘤病毒和小鼠和小鼠白白血病病毒血病病毒等致病等致病RNA病毒中分離出病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的，迄今已知的致致癌癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。 用用DNA復(fù)制的復(fù)制的特異抑制物特異抑制物（放線菌素（放線菌素D）能抑制致癌能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，而對(duì)一般病毒的復(fù)制，而對(duì)一般RNA病毒的復(fù)制無影響，可見病毒的復(fù)制無影響，可見致癌致癌RNA病毒的復(fù)制過程必然涉及到病毒的復(fù)制過程必然涉及到DNA。所以所以Temin于于1964年年提出提出前病毒前病毒的假說。的假說。 以

36、前病毒形式整合到宿主細(xì)胞以前病毒形式整合到宿主細(xì)胞DNADNA中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。單鏈病毒單鏈病毒RNA RNA RNA-DNARNA-DNA雜交分子雜交分子 雙鏈雙鏈DNADNA（前病毒）前病毒） 逆轉(zhuǎn)錄酶也和逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNADNA聚合酶一樣，沿聚合酶一樣，沿5 5 33方向合成方向合成DNADNA，底物為四種底物為四種dNTPdNTP, ,并要求短鏈并要求短鏈RNARNA作引物。作引物。+RNA+RNA+DNA-DNA-RNA+RNA+DNA-DNA-DNA+DNA+致癌致癌RNARNA病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程 逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有

37、3種酶的活性種酶的活性 RNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；聚合酶活性； DNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；聚合酶活性； 核糖核酸酶核糖核酸酶H的活性，專一水解的活性，專一水解RNA-DNA雜交分雜交分子中的子中的RNA，可沿可沿5 3方向起核酸外切酶的作方向起核酸外切酶的作用用; 無校對(duì)功能，錯(cuò)誤率高，易產(chǎn)生變異。無校對(duì)功能，錯(cuò)誤率高，易產(chǎn)生變異。 cDNA：反義反義DNA 幾乎所有真核生物幾乎所有真核生物mRNA分子的分子的3末端都有一末端都有一段段polyA，當(dāng)加入寡聚，當(dāng)加入寡聚dT作為引物時(shí)，作為引物時(shí)，mRNA就可作為模板，在逆就可作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與該轉(zhuǎn)錄酶催

38、化下在體外合成與該mRNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的DNA，稱稱cDNA。 逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論與實(shí)踐意義：逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論與實(shí)踐意義：不能把不能把“中心法則中心法則”絕對(duì)化，絕對(duì)化，遺傳信息也可以從遺傳信息也可以從RNA傳遞到傳遞到DNA。促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，為腫瘤防治提供了新的線索。目前，逆轉(zhuǎn)錄酶已和病毒學(xué)的研究，為腫瘤防治提供了新的線索。目前，逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)經(jīng)成為研究工具。成為研究工具。 1983年，年，發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（human immune deficience virus），感染），感染T淋巴細(xì)胞后即殺死細(xì)胞，造成宿主機(jī)體

39、免疫系統(tǒng)損淋巴細(xì)胞后即殺死細(xì)胞，造成宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷，引起艾滋?。▊?，引起艾滋?。╝cquired immunodeficiency syndrome，AIDS），該病毒為），該病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒。 端粒（端粒（telomere）是真核染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，它一般含許多是真核染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，它一般含許多串聯(lián)重復(fù)的寡聚核苷酸序列，通常是串聯(lián)重復(fù)的寡聚核苷酸序列，通常是TxGy的形式，的形式，x、y常為常為1-4。 端粒結(jié)構(gòu)端粒結(jié)構(gòu)提出了一個(gè)特別的生物學(xué)問題。提出了一個(gè)特別的生物學(xué)問題。DNA復(fù)制需要引物，但復(fù)制需要引物，但在線形在線形DNA分子中，分子中，DNA復(fù)制結(jié)束后，引

40、物去除留下的鏈的短缺無復(fù)制結(jié)束后，引物去除留下的鏈的短缺無法進(jìn)行補(bǔ)缺，若沒有特殊的機(jī)制解決末端復(fù)制，法進(jìn)行補(bǔ)缺，若沒有特殊的機(jī)制解決末端復(fù)制，DNA就會(huì)因?yàn)閺?fù)制就會(huì)因?yàn)閺?fù)制而不斷變短。這個(gè)問題是由一種特殊的酶而不斷變短。這個(gè)問題是由一種特殊的酶 端粒酶（端粒酶（telomerase）解決的。解決的。 端粒酶，端粒的合成酶端粒酶，端粒的合成酶，含有一段，含有一段RNA和蛋白質(zhì)，其中的和蛋白質(zhì)，其中的RNA成成分為分為150個(gè)核苷酸，并含個(gè)核苷酸，并含1.5個(gè)拷貝的與端?；パa(bǔ)的重復(fù)序列個(gè)拷貝的與端?；パa(bǔ)的重復(fù)序列CyAx，這是端粒這是端粒 TxGy合成的模板。端粒酶是以該段合成的模板。端粒酶是以該

41、段RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄為模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，端粒合成時(shí)以該段酶，端粒合成時(shí)以該段RNA為引物和模板，合成因引物切除而產(chǎn)生為引物和模板，合成因引物切除而產(chǎn)生的的DNA末端缺口，使染色體的端粒達(dá)到正常的長度。末端缺口，使染色體的端粒達(dá)到正常的長度。端 粒 酶 是 一 種 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶端 粒 酶 是 一 種 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶端粒的合成端粒的合成 DNA的損傷與的損傷與DNA突變突變 DNA在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)配，病毒基因整合，某些物化在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，都可能使因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，都可能使DNA的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變。從

42、而引起生物突變，甚至導(dǎo)致。從而引起生物突變，甚至導(dǎo)致死亡。死亡。5 DNA修 復(fù)修 復(fù) DNA突變突變 DNA的的核苷酸順序核苷酸順序永久性的改變稱為永久性的改變稱為DNA的突變。其主要形式有：的突變。其主要形式有：1. 點(diǎn)突變點(diǎn)突變 DNA分子中一個(gè)堿基對(duì)替代另一個(gè)堿基對(duì)稱為點(diǎn)的突變。分子中一個(gè)堿基對(duì)替代另一個(gè)堿基對(duì)稱為點(diǎn)的突變。2. 插入作用插入作用 DNA分子中插入一個(gè)或幾個(gè)堿基稱為插入作用。分子中插入一個(gè)或幾個(gè)堿基稱為插入作用。3. 缺失作用缺失作用 DNA分子中缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)稱為缺失作用。分子中缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)稱為缺失作用。 沉默突變：沉默突變：突變影響非必需的突變影響非必需的DNA或突變對(duì)一個(gè)基因的功能的影或突變對(duì)一個(gè)基因的功能的影響可忽略，稱為沉默突變。響可忽略，稱為沉默突變。 回復(fù)突變：回復(fù)突變：一些突變可以克服第一次突變?cè)斐傻挠绊?，這類突變一些突變可以克服第一次突變?cè)斐傻挠绊?，這類突變稱為回復(fù)突變。稱為回復(fù)突變。 缺失、插入和移框突變；5.G C A G U A C A U G U C.3 丙 纈 組 纈