離子交換柱層析法分離氨基酸ppt課件

1、離子交換柱層析法分別氨基酸離子交換柱層析法分別氨基酸張麗儀器設(shè)備簡介儀器設(shè)備簡介柱層析系統(tǒng)的銜接目的要求1學(xué)習(xí)采用離子交換樹脂分別氨基酸的根本原理。2掌握離子交換柱層析法的根本操作技術(shù)。一、原理一、原理離子交換層析是用離子交換劑具有離子交換層析是用離子交換劑具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進(jìn)展可利用它與流動相中的離子能進(jìn)展可逆的交換性質(zhì)來分分別子型化合物逆的交換性質(zhì)來分分別子型化合物的層析方法。的層析方法。 即溶液中的離子同離子交換劑上即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反響的過程。功能基團(tuán)交換反響的過程。 帶電荷量少，親和力小的先被帶電

2、荷量少，親和力小的先被洗脫下來，帶電荷量多，親和力大洗脫下來，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來。的后被洗脫下來。離子交換過程表示：離子交換過程表示：起始起始 吸附吸附 解吸解吸 完成完成 x+ : 起始緩沖離子起始緩沖離子 y+ ：待分分別子：待分分別子 z+ ：待分分別子：待分分別子 二、離子交換劑的種類二、離子交換劑的種類 在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離子交換劑。子交換劑。一按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同一按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑陽離子交換劑 帶負(fù)電荷，與陽離子交換帶負(fù)電荷，與陽離子交換陰離子交換劑陰離子交換劑 帶正電荷，與陰離

3、子交換帶正電荷，與陰離子交換二按載體種類不同二按載體種類不同1.離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯 聚苯乙烯聚苯乙烯 單體交聯(lián)劑單體交聯(lián)劑 二乙烯苯二乙烯苯交聯(lián)度交聯(lián)度 = 100% 苯乙烯苯乙烯 + 二乙烯苯二乙烯苯交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。在不影響分別的情況下，以采用交聯(lián)度較高在不影響分別的情況下，以采用交聯(lián)度較高的樹脂為好，這樣可以提高樹脂對離子的選的樹脂為好，這樣可以提高樹脂對離子的選擇性擇性 。目數(shù)：離子交換樹脂的顆粒直

4、徑大小目數(shù)：離子交換樹脂的顆粒直徑大小 Dowex 50 為為20-50目目Dowex 20 840m 50 297m 100 149m 代表二乙烯苯的百分含量代表二乙烯苯的百分含量樹脂樹脂resin據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂 強(qiáng)酸型強(qiáng)酸型 含磺酸基團(tuán)含磺酸基團(tuán) (R-SO3H) 中等酸型中等酸型 含磷酸基團(tuán)含磷酸基團(tuán) (-O-PO2H4) 弱酸型弱酸型 含酚基、羧基含酚基、羧基陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂 強(qiáng)堿強(qiáng)堿 含季胺基團(tuán)含季胺基團(tuán) -N+(CH3)3 弱堿弱堿 含叔胺、伯胺基團(tuán)含叔胺、伯胺基團(tuán)-N(CH3)2 陰離子交換樹脂對化學(xué)試劑及熱都

5、不如陽離陰離子交換樹脂對化學(xué)試劑及熱都不如陽離子交換樹脂穩(wěn)定。子交換樹脂穩(wěn)定。 2.離子交換纖維素離子交換纖維素陰離子交換纖維素陰離子交換纖維素 如如:DEAE-纖維素纖維素 pH8.6以下分別中性或酸性物質(zhì)以下分別中性或酸性物質(zhì),具二乙胺具二乙胺乙基乙基陽離子交換纖維素陽離子交換纖維素如如:CM-纖維素纖維素 普通普通pH4條件下運(yùn)用條件下運(yùn)用,具有羧甲基具有羧甲基 3.離子交換凝膠離子交換凝膠 分別大分子物質(zhì)分別大分子物質(zhì)如：葡聚糖如：葡聚糖Sephadex、 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺PAG、瓊脂糖、瓊脂糖Sepharose三、操作留意點(diǎn)三、操作留意點(diǎn)一離子交換劑的選擇一離子交換劑的選擇原那么

6、：根據(jù)被分別物質(zhì)的性質(zhì)選擇原那么：根據(jù)被分別物質(zhì)的性質(zhì)選擇同一性同一性質(zhì)離子交換劑中選用對被分別物質(zhì)各組分之質(zhì)離子交換劑中選用對被分別物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差別大的型號交換劑，以保證經(jīng)過間結(jié)合力差別大的型號交換劑，以保證經(jīng)過離子交換層析后能得到比較稱心的結(jié)果。離子交換層析后能得到比較稱心的結(jié)果。思索要素：思索要素：1.被分別物質(zhì)帶何種電荷被分別物質(zhì)帶何種電荷2.被分別物質(zhì)分子的大小被分別物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素3.被分別物質(zhì)所處的環(huán)境被分別物質(zhì)所處的環(huán)境4.被分別物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)被分別物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)5.被分別物質(zhì)的大約數(shù)量被分別物質(zhì)

7、的大約數(shù)量根據(jù)分別過程的實驗條件根據(jù)分別過程的實驗條件 強(qiáng)酸強(qiáng)堿強(qiáng)酸強(qiáng)堿運(yùn)用廣泛運(yùn)用廣泛 弱酸型弱酸型只能在堿性只能在堿性pH范圍內(nèi)運(yùn)用范圍內(nèi)運(yùn)用 弱堿型弱堿型只能在酸性只能在酸性pH范圍內(nèi)運(yùn)用范圍內(nèi)運(yùn)用二緩沖液的選擇二緩沖液的選擇原那么：不能發(fā)生化學(xué)反響，所帶電荷應(yīng)與樣原那么：不能發(fā)生化學(xué)反響，所帶電荷應(yīng)與樣品一致。防止使樣品變性品一致。防止使樣品變性(三三)洗脫劑洗脫劑 原那么：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活原那么：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離子或基團(tuán)潑的離子或基團(tuán)改動改動pH或離子強(qiáng)度或離子強(qiáng)度 加強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力加強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力降低分別物與離子交換劑的結(jié)合

8、力降低分別物與離子交換劑的結(jié)合力 洗脫方式：梯度洗脫洗脫方式：梯度洗脫四、運(yùn)用四、運(yùn)用分別多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他分別多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子帶電的生物分子離子交換層析法分別氨基酸及測定離子交換層析法分別氨基酸及測定 原理原理 所用樣品為天冬氨酸和賴氨酸的混合液，分別屬酸性氨基酸(pI2.77)、堿性氨基酸(pI9.74)，在緩沖溶液中分別帶正電荷和負(fù)電荷，與強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂Dowex50親和力有很大不同，在一定的洗脫條件下洗脫，將它們分別。利用氨基酸可與茚三酮反響生成有色化合物進(jìn)展氨基酸鑒定。紫色物質(zhì)，用于紫色物質(zhì)，用于氨基酸的比色測定和紙層析顯色氨基酸的比色測定和

9、紙層析顯色與水含茚三酮的反響：與水含茚三酮的反響：R CHNH2COOHOOOHOH+2H2OOOOONHCHRN CHCOOHRCO2OON CH2ROONH2HRCHO +OOOHOHOONHOOOONOOHH2O Asp LyspH4.2pH 10器材器材 1. 層析柱等2. 沸水浴試劑試劑 Dowex50 2mol/L NaOHpH5.3檸檬酸緩沖液檸檬酸緩沖液樣品液：氨基酸混合液樣品液：氨基酸混合液茚三酮混合液茚三酮混合液實驗步驟1樹脂的處置 將干的強(qiáng)酸型樹脂用蒸餾水浸泡過夜，使之充分溶脹。用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡1小時，傾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氫氧化鈉處置，

10、做法同上。最后用欲運(yùn)用的緩沖液浸泡。2裝柱 取直徑1cm,長度1012cm的層析柱。將柱垂直至于鐵架上。自頂部注入上述經(jīng)處置的樹脂懸浮液，封鎖層析柱出口，待樹脂沉降后，放出過量溶液，再參與一些樹脂，至樹脂沉降至8 10cm的高度即可。裝柱要求延續(xù)、均勻，無紋格、無氣泡，外表平整。液面不低于樹脂。 3平衡 將緩沖液瓶與恒流泵相連，恒流泵出口與層析柱入口相連，樹脂外表保管34cm液層，開動衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH與洗脫液一樣。 4. 加樣 揭去層析柱上口蓋子，待柱內(nèi)液面至樹脂外表12mm封鎖出口，沿管壁周圍小心參與0.5ml樣品，漸漸翻開出口，同時開場搜集流出液。當(dāng)樣品液彎月面接近樹脂頂端時，即刻參與少量檸檬酸緩沖液沖洗加樣品處數(shù)次，然后注入檸檬酸緩沖液至液面高34cm左右，接恒流泵。 5. 洗脫 以緩沖液洗脫，開場用試管搜集洗脫液，每管搜集1mL，共搜集6080管。 6洗脫及氨基酸的鑒定 向各管搜集液中加1mL水合茚三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min后冷卻至室溫，再參與3mL的0.1%硫酸銅溶液?；靹颍运鸭旱?管為空白，測定A5