代謝工程課件課件

1、第三章 微生物的代謝調(diào)節(jié)和代謝工程n 第一節(jié) 微生物代謝的自我調(diào)節(jié)n 第二節(jié) 代謝調(diào)控n 第三節(jié) 次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要調(diào)控機(jī)制 n 第四節(jié) 代謝工程【教學(xué)目的與要求教學(xué)目的與要求】掌握微生物自身代謝和次級(jí)代謝的機(jī)理、有關(guān)概念及代謝調(diào)控，了解代謝工程設(shè)計(jì)的方向?！窘虒W(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)】教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)】微生物自身代謝和次級(jí)代謝的機(jī)理、有關(guān)概念及代謝調(diào)控。n微生物的生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝n代謝類型： 主要依賴兩種代謝途徑： 分解代謝 合成代謝n分解代謝:指復(fù)雜的有機(jī)物分子通過(guò)分解代謝酶系的催化，產(chǎn)生簡(jiǎn)單分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和還原力（或稱還原當(dāng)量，一般用H來(lái)表示）的作用。 微生物通過(guò)分解代謝從環(huán)境

2、中吸收的各種碳源、氮源等物質(zhì)降解，為生命活動(dòng)提供能源和小分子中間體。 包括：中心途徑如TCA、EMP、HMP及外圍途徑（指碳源、氮源通過(guò)分解進(jìn)入中心途徑） 合成代謝n與分解代謝正好相反，指在合成代謝酶系的催化下，由簡(jiǎn)單小分子、ATP形式的能量和H形式的還原力一起合成復(fù)雜的大分子的過(guò)程?；蚶梅纸獯x的能量和中間體合成氨基酸、核酸等單體物質(zhì)及蛋白質(zhì)、多糖等多聚物。n分解代謝與合成代謝是互相關(guān)聯(lián)、互相制約，是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。n正常微生物的小分子物質(zhì)的合成和降解是自身調(diào)節(jié)。研究微生物代謝調(diào)節(jié)的意義n十分重要，在工業(yè)上可通過(guò)對(duì)微生物的代謝途徑加以控制來(lái)滿足生產(chǎn)的需要。n如：谷氨酸發(fā)酵菌種：微生物的代謝

3、產(chǎn)物可分為：初級(jí)代謝產(chǎn)物定義：微生物通過(guò)代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的、自身生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)。舉例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。特征：不同的微生物初級(jí)代謝產(chǎn)物基本相同；初級(jí)代謝產(chǎn)物合成過(guò)程是連續(xù)不斷的，與菌體的生長(zhǎng)呈平行關(guān)系。 次級(jí)代謝產(chǎn)物定義：微生物生長(zhǎng)到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對(duì)該微生物無(wú)明顯生理功能，或并非是微生物生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)。舉例：抗生物、毒素、激素、色素等。特征：不同的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物不同；次級(jí)代謝產(chǎn)物的通常在菌體的生長(zhǎng)后期合成，發(fā)酵分兩個(gè)階段進(jìn)行，即營(yíng)養(yǎng)增殖期和生產(chǎn)期。在多數(shù)情況下，增加前體是有效的兩種代謝產(chǎn)物的不同：n1、次級(jí)代謝通常在生長(zhǎng)后期合成。不是微

4、生物生長(zhǎng)所必需的，不參與微生物的生長(zhǎng)和繁殖。 n2、次級(jí)代謝對(duì)環(huán)境條件的變化很敏感，其產(chǎn)物的合成往往會(huì)因環(huán)境條件的變化而停止。n3、不同微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物有很大區(qū)別?；诰N的特異性n4、催化次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的某些酶專一性不強(qiáng)。第一節(jié) 微生物代謝的自我調(diào)節(jié) 微生物有著一整套可塑性極強(qiáng)和極精確的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以保證上千種酶能正確無(wú)誤、有條不紊地進(jìn)行極其復(fù)雜的新陳代謝反應(yīng)。n微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)方式很多，例如可調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)透過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞的能力，通過(guò)酶的定位以限制它與相應(yīng)底物的接近，以及調(diào)節(jié)代謝流等。n其中以調(diào)節(jié)代謝流的方式最為重要，它包括兩個(gè)方面，一是“粗調(diào)”，即調(diào)節(jié)酶的合成量，二是“細(xì)調(diào)

5、”，即調(diào)節(jié)現(xiàn)成酶分子的催化活力，兩者往往密切配合和協(xié)調(diào)，以達(dá)到最佳調(diào)節(jié)效果。微生物自我調(diào)節(jié)部位n1養(yǎng)分的吸收和排泄 細(xì)胞膜n2限制基質(zhì)與酶的接近n3控制通量： 調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶量和改變酶分子的活性n都涉及到酶促反應(yīng)的調(diào)節(jié)包括酶活性的調(diào)節(jié)和和酶合成的調(diào)節(jié)一、酶活性的調(diào)節(jié) 酶活性的調(diào)節(jié)： 指在酶分子水平上的一種代謝調(diào)節(jié)，它是通過(guò)改變現(xiàn)成的酶分子活性來(lái)調(diào)節(jié)新陳代謝的速率。 酶活性的抑制 激活 是微生物代謝中存在的兩種矛盾的過(guò)程。n酶活性的激活系指在分解代謝途徑中，后面的反應(yīng)可被較前面的中間產(chǎn)物所促進(jìn)。n酶活性的抑制主要是反饋抑制，它主要表現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物（即終產(chǎn)物）過(guò)量時(shí)，這個(gè)產(chǎn)物可反過(guò)來(lái)直接抑制

6、該途徑中第一個(gè)酶的活性，促使整個(gè)反應(yīng)過(guò)程減慢或停止，從而避免了末端產(chǎn)物的過(guò)多累積。 圖：大腸桿菌代謝過(guò)程的抑制劑和激活劑（一）酶活性的激活（一）酶活性的激活n常見(jiàn)的酶活性的激活是前體激活，多發(fā)生在分支代謝途徑，即代謝途徑中的后面的反應(yīng)可被較前面的一種代謝中間產(chǎn)物所促進(jìn)。 如：粗糙脈胞酶的異檸檬酸脫氫酶的活性受到檸檬酸的激活。（二）酶活性的抑制（二）酶活性的抑制n酶活性的抑制包括： 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 反饋抑制 反饋抑制：指反應(yīng)途徑中某些中間產(chǎn)物或末端產(chǎn)物對(duì)該途徑中前面反應(yīng)的影響。 凡是反映加速地稱為正反饋； 凡是反應(yīng)減速的稱為負(fù)反饋。 末端產(chǎn)物的反饋抑制普遍存在于合成途徑中。 反饋抑制：直鏈?zhǔn)?分支代

7、謝途徑：兩種以上的末端產(chǎn)物 反饋抑制的類型反饋抑制的類型 n1直線式代謝途徑中的反饋抑制2分支代謝途徑中的反饋抑制。 反饋抑制的情況較為復(fù)雜。 為避免在一個(gè)分支上的產(chǎn)物過(guò)多時(shí)不致同時(shí)影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物已發(fā)展出多種調(diào)節(jié)方式。 n（1）同功酶調(diào)節(jié) n同功酶是指能催化相同的生化反應(yīng)，但酶蛋白分子結(jié)構(gòu)有差異的一類酶，它們雖同存于一個(gè)個(gè)體或同一組織中，但在生理、免疫和理化特性上卻存在著差別。n同功酶的主要功能在于其代謝調(diào)節(jié)。n在一個(gè)分支代謝途徑中，如果在分支點(diǎn)以前的一個(gè)較早的反應(yīng)是由幾個(gè)同功酶所催化時(shí)，則分支代謝的幾個(gè)最終產(chǎn)物往往分別對(duì)這幾個(gè)同功酶發(fā)生抑制作用。 如：大腸桿菌天冬氨族氨基酸

8、合成途徑中，有三個(gè)同工酶天冬氨酸激酶 分別受賴氨酸、蘇氨酸、硫氨酸反饋調(diào)節(jié)n（2）協(xié)同反饋抑制： n指分支代謝途徑中的幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)才能抑制共同途徑中的第一個(gè)酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。n如：谷氨酸棒桿菌合成天冬氨族氨基酸時(shí)，天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。n（3）累積反饋抑制： 催化分支合成途徑第一步反應(yīng)的酶有幾種末端產(chǎn)物抑制物，但每一種如過(guò)量，按一定百分率單獨(dú)抑制共同途徑中的第一個(gè)酶活性，總的抑制效果是累加的，各末端產(chǎn)物所起的抑制作用互不影響，只影響這個(gè)酶促反應(yīng)的速率。 n兩種末端產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，可以起著比一種末端產(chǎn)物大得多的反饋抑制作用。n（4）增效反饋抑制：代謝途徑中任何

9、一種末端產(chǎn)物過(guò)量時(shí)，僅部分抑制共同途徑中的第一個(gè)酶活性，但兩個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)，其抑制作用可超過(guò)各產(chǎn)物存在的抑制能力的總和。如6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸合成途徑。n（5）順序反饋抑制：每個(gè)分支末端產(chǎn)物抑制分支后的第一個(gè)酶，產(chǎn)生部分抑制作用。通過(guò)逐步有順序的方式達(dá)到的調(diào)節(jié)。 n如枯草芽孢桿菌的芳香族氨基酸合成途徑和球型紅假單胞菌的蘇氨酸合成途徑。n當(dāng)E過(guò)多時(shí)，可抑制CD，這時(shí)由于C的濃度過(guò)大而促使反應(yīng)向F、G方向進(jìn)行，結(jié)果又造成了另一末端產(chǎn)物G濃度的增高。由于G過(guò)多就抑制了CF，結(jié)果造成C的濃度進(jìn)一步增高。C過(guò)多又對(duì)AB間的酶發(fā)生抑制，從而達(dá)到了反饋抑制的效果。這種通過(guò)逐步有順序的

10、方式達(dá)到的調(diào)節(jié)，稱為順序反饋抑制。二、酶合成的調(diào)節(jié)（酶量）二、酶合成的調(diào)節(jié)（酶量） n酶合成的調(diào)節(jié)是一種通過(guò)調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而酶合成的調(diào)節(jié)是一種通過(guò)調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)微生物的代謝速率。調(diào)節(jié)微生物的代謝速率。 這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在轉(zhuǎn)錄水平上）的代謝調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄水平上）的代謝調(diào)節(jié)。 有誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和阻遏調(diào)節(jié)。有誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和阻遏調(diào)節(jié)。 根據(jù)酶的生成是否與環(huán)境中所存在的該酶底物或其有關(guān)物的關(guān)系，可把酶劃分成組成酶和誘導(dǎo)酶兩類。 n有些酶的合成不依賴于環(huán)境中物質(zhì)的存在（如有些酶的合成不依賴于環(huán)境中物質(zhì)的存在（如糖酵解途徑中的各種酶），稱為組合酶。糖

11、酵解途徑中的各種酶），稱為組合酶。n另一些酶只有在它們催化的底物（或底物的結(jié)另一些酶只有在它們催化的底物（或底物的結(jié)構(gòu)類似物）存在時(shí)才能合成，此種酶稱為誘導(dǎo)構(gòu)類似物）存在時(shí)才能合成，此種酶稱為誘導(dǎo)酶。酶。n凡能促進(jìn)酶生物合成的現(xiàn)象，稱為誘導(dǎo)。凡能促進(jìn)酶生物合成的現(xiàn)象，稱為誘導(dǎo)。n能阻礙酶生物合成的現(xiàn)象，則稱為阻遏。能阻礙酶生物合成的現(xiàn)象，則稱為阻遏。n與上述調(diào)節(jié)酶活性的反饋抑制等相比，調(diào)節(jié)酶的合成（即產(chǎn)酶量）而實(shí)現(xiàn)代謝調(diào)節(jié)的方式是一類較間接而緩慢的調(diào)節(jié)方式。n其優(yōu)點(diǎn)則是通過(guò)阻止酶的過(guò)量合成，有利于節(jié)約生物合成的原料和能量。n在正常代謝途徑中，酶活性調(diào)節(jié)和酶合成調(diào)節(jié)兩者是同時(shí)存在且密切配合、協(xié)調(diào)

12、進(jìn)行的。 （一）酶合成調(diào)節(jié)的類型（一）酶合成調(diào)節(jié)的類型 n1誘導(dǎo)n誘導(dǎo)酶：另一些酶只有在它們催化的底物（或底另一些酶只有在它們催化的底物（或底物的結(jié)構(gòu)類似物）存在時(shí)才能合成，此種酶稱為物的結(jié)構(gòu)類似物）存在時(shí)才能合成，此種酶稱為誘導(dǎo)酶。誘導(dǎo)酶。n誘導(dǎo)酶是細(xì)胞為適應(yīng)外來(lái)底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的一類酶。n能促進(jìn)誘導(dǎo)酶產(chǎn)生的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)物，它可以是該酶的底物，也可以是難以代謝的底物類似物或是底物的前體物質(zhì)。n外源誘導(dǎo)物：外源加入的。n內(nèi)源誘導(dǎo)物：菌體代謝途徑的某些中間產(chǎn)物也能誘導(dǎo)該途徑的某些酶系的合成，這些中間產(chǎn)物稱為內(nèi)源誘導(dǎo)物。酶的誘導(dǎo)合成類型酶的誘導(dǎo)合成類型n同時(shí)誘導(dǎo)同時(shí)誘導(dǎo):當(dāng)誘導(dǎo)物加入后

13、，微生物能同時(shí)或幾乎同時(shí)誘導(dǎo)幾種酶的合成，它主要存在于短的代謝途徑中。例如，將乳糖加入到Ecoli培養(yǎng)基中后，即可同時(shí)誘導(dǎo)出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶和半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶的合成；n順序誘導(dǎo)順序誘導(dǎo):先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達(dá)到對(duì)較復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。n2阻遏 在微生物的代謝過(guò)程中，當(dāng)代謝途徑中某末端產(chǎn)物過(guò)量時(shí)，除用反饋抑制的方式來(lái)抑制該途徑中關(guān)鍵酶的活性以減少末端產(chǎn)物的生成外， 通過(guò)阻遏作用來(lái)阻礙代謝途徑中包括關(guān)通過(guò)阻遏作用來(lái)阻礙代謝途徑中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的生物合成，從而更鍵酶在內(nèi)的一系列酶的生物合成，從而更徹底地控制代謝和減少末端產(chǎn)物的合成。徹底

14、地控制代謝和減少末端產(chǎn)物的合成。n反饋?zhàn)瓒簦褐复x的終產(chǎn)物達(dá)到一定濃度時(shí)，反饋?zhàn)瓒粼摯x途徑的一種或幾種酶的生物合成。n阻遏作用有利于生物體節(jié)省有限的養(yǎng)料和能量。n阻遏的類型主要有兩種: 末端代謝產(chǎn)物阻遏 分解代謝產(chǎn)物阻遏。（1 1）末端產(chǎn)物阻遏）末端產(chǎn)物阻遏定義：指由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過(guò)量累積而引起的阻遏。n對(duì)直線式反應(yīng)途徑 ，末端產(chǎn)物阻遏的情況較為簡(jiǎn)單，即產(chǎn)物作用于代謝途徑中的各種酶，使之合成受阻遏。 n對(duì)分支代謝途徑來(lái)說(shuō)，情況就較復(fù)雜。 每種末端產(chǎn)物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。n多價(jià)阻遏多價(jià)阻遏：有兩種或兩種以上的末端產(chǎn)物的分支代謝途徑中，當(dāng)分支代謝途徑中的幾種末端產(chǎn)物同時(shí)過(guò)

15、量就反饋?zhàn)瓒羝浞种c(diǎn)以前的共同途徑的“公共酶”的合成，僅一種產(chǎn)物過(guò)量無(wú)阻遏作用。n末端產(chǎn)物阻遏在代謝調(diào)節(jié)中有著重要的作用，它可保證細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)維持適當(dāng)?shù)臐舛取＃?）分解代謝產(chǎn)物阻遏）分解代謝產(chǎn)物阻遏定義：指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）或其分解產(chǎn)物存在時(shí)，被菌體迅速利用的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。n分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過(guò)碳源（或氮源等）在其分解過(guò)程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。n因此，分解代謝物的阻遏作用，就是指代謝反應(yīng)鏈中，某些中間代謝物或末端代謝物的過(guò)量累積而阻遏代謝途徑中一些酶合成的現(xiàn)象。 兩種調(diào)

16、節(jié)的對(duì)比酶合成的調(diào)節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)不同點(diǎn)不同點(diǎn)調(diào)節(jié)對(duì)象調(diào)節(jié)對(duì)象通過(guò)酶量的變化通過(guò)酶量的變化控制代謝速率控制代謝速率控制酶活性，不涉控制酶活性，不涉及酶量變化及酶量變化調(diào)節(jié)效果調(diào)節(jié)效果相對(duì)緩慢相對(duì)緩慢快速、精細(xì)快速、精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)制基因水平調(diào)節(jié)，基因水平調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)控制酶合成調(diào)節(jié)控制酶合成酶分子水平調(diào)節(jié)，酶分子水平調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)酶活性相同相同點(diǎn)點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)兩種方式同時(shí)存在，密切配合，高效、準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)兩種方式同時(shí)存在，密切配合，高效、準(zhǔn)確控制代謝的正常進(jìn)行。確控制代謝的正常進(jìn)行。三、能荷的調(diào)節(jié)三、能荷的調(diào)節(jié) n能荷指細(xì)胞中ATP、ADP、AMP系統(tǒng)中可供利用的高能磷酸鍵的量

17、度。n能荷調(diào)節(jié)（或稱腺苷酸調(diào)節(jié)）：指細(xì)胞通過(guò)改變ATP、ADP、AMP三者的比例來(lái)調(diào)節(jié)其代謝活動(dòng)。n細(xì)胞內(nèi)3種腺苷酸含量不同，細(xì)胞的能荷狀態(tài)不同。能荷狀態(tài)用“能荷”表示 12能 荷100%ATPADPATPADPAMPn當(dāng)細(xì)胞內(nèi)全部為ATP，能荷為100%n當(dāng)細(xì)胞內(nèi)全部為ADP，能荷為50%nATP可以認(rèn)為是糖分解代謝的末端產(chǎn)物，當(dāng)ATP過(guò)量就對(duì)糖分解代謝產(chǎn)生反饋抑制，當(dāng)ATP降解為ADP，能量釋放于其他的生化反應(yīng)，反饋抑制被解除。 12能 荷100%ATPADPATPADPAMPR R曲線合成系統(tǒng)，如磷酸果糖激曲線合成系統(tǒng)，如磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶等。酶、檸檬酸合成酶等。U U曲線消耗曲

18、線消耗ATPATP的酶系，檸檬酸的酶系，檸檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶成酶(PRPP)(PRPP)等。等。 當(dāng)能荷當(dāng)能荷0.750.75，合成受到抑制，合成受到抑制，酶活性急速下降，消耗酶活性急速下降，消耗ATPATP的的酶活性急速上升。兩系統(tǒng)在酶活性急速上升。兩系統(tǒng)在0.850.85處交叉，酶系達(dá)到平衡。處交叉，酶系達(dá)到平衡。這種現(xiàn)象存在于許多生長(zhǎng)狀態(tài)這種現(xiàn)象存在于許多生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞中。細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)腺的細(xì)胞中。細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)腺苷酸的比例，來(lái)協(xié)調(diào)分解代苷酸的比例，來(lái)協(xié)調(diào)分解代謝與合成代謝的代謝速率。謝與合成代謝的代謝速率。 第二節(jié) 代謝調(diào)控n微生物在正常生長(zhǎng)條件下，可

19、以通過(guò)自我調(diào)節(jié)使機(jī)體內(nèi)的代謝途徑與代謝類型互相協(xié)調(diào)與平衡，通常不會(huì)過(guò)量積累初級(jí)代謝產(chǎn)物。在某種條件下，過(guò)量積累的中間代謝產(chǎn)物也能夠被誘導(dǎo)酶轉(zhuǎn)化為次級(jí)代謝產(chǎn)物。但在人為條件的控制下，可以使微生物過(guò)量產(chǎn)生各種初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物。 n初級(jí)代謝產(chǎn)物控制比較簡(jiǎn)單。它的形成一般只需要營(yíng)養(yǎng)條件即可生成。 通過(guò)改變發(fā)酵工藝條件如pH、溫度、培養(yǎng)基組成和微生物遺傳特性等，達(dá)到改變菌體內(nèi)的代謝平衡，過(guò)量產(chǎn)生所需要產(chǎn)物的目的。 n可通過(guò)發(fā)酵條件控制n改變細(xì)胞的滲透性 n改變菌種的遺傳特性 一、發(fā)酵條件的控制n1 各種發(fā)酵條件對(duì)微生物代謝的影響n同一種微生物在同樣的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，只要控制不同的發(fā)酵條件。

20、就可能獲得不同的代謝產(chǎn)物。 n如：啤酒酵母在中性和酸性條件下培養(yǎng)，可將葡萄糖氧化生成乙醇和二氧化碳；當(dāng)在培養(yǎng)基中加入亞硫酸氫鈉或在堿性條件下培養(yǎng)時(shí)，則并不產(chǎn)生乙醇，而是產(chǎn)生甘油。 n控制不同的發(fā)酵條件，實(shí)際上是影響微生物自身的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而改變其代謝方向，使之按人們所需要的方向進(jìn)行，進(jìn)而達(dá)到獲得高濃度積累所需要產(chǎn)物獲得高濃度積累所需要產(chǎn)物的目標(biāo)。 2 使用誘導(dǎo)物n許多與蛋白質(zhì)、糖類或其他物質(zhì)降解有關(guān)的酶類都是誘導(dǎo)酶，在發(fā)酵過(guò)程中加入相應(yīng)的底物作為誘導(dǎo)物，可以有效地增加這些酶的產(chǎn)量。n如：在木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶中，加入槐糖可以誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生；木糖可以誘導(dǎo)半纖維素酶的生成。青霉素?；缚捎帽?/p>

21、乙酸為誘導(dǎo)物。乙內(nèi)酰胺酶發(fā)酵時(shí)，可以底物類似物為誘導(dǎo)物增加酶的產(chǎn)量。 3 添加生物合成的前體僅參與色氨酸的最后階段的合成，如果在發(fā)酵中加入鄰氨基苯甲酸，雖然色氨酸對(duì)第一個(gè)酶的反饋抑制仍然存在，但對(duì)由鄰氨基苯甲酸合成色氨酸并無(wú)影響，使色氨酸的合成可以不斷進(jìn)行，從而大幅度提高了發(fā)酵產(chǎn)量。色氨酸生物合成途徑色氨酸生物合成途徑4 培養(yǎng)基成分和濃度的控制 n培養(yǎng)基即要保證微生物機(jī)體生長(zhǎng)需要，又要利于代謝產(chǎn)物的合成，須考慮其的組成和濃度，盡量避免培養(yǎng)基使用不當(dāng)引起的分解代謝阻遏。n在發(fā)酵培養(yǎng)基中通常采用適量的速效和遲效碳源、氮源的配比，來(lái)滿足機(jī)體生長(zhǎng)的需要和避免速效碳、氮源可能引起的分解代謝阻遏。例如，用

22、甘油代替果糖作為碳源培養(yǎng)嗜熱脂肪酵母，可以使淀粉酶的產(chǎn)量提高25倍以上； 用甘露糖代替乳糖作為培養(yǎng)熒光假單胞菌的碳源，使纖維素酶產(chǎn)量提高1500倍以上。 改變細(xì)胞透性n在發(fā)酵過(guò)程中，可以控制使用那些影響細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)作為培養(yǎng)基的成分，有利于代謝產(chǎn)物分泌出來(lái)，避免了末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。n例如，利用棒狀桿菌的-酮戊二酸脫氫酶缺失突變株，在葡萄糖培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，當(dāng)谷氨酸濃度達(dá)到50mg/g(干細(xì)胞)時(shí)，由于反饋調(diào)節(jié)作用，谷氨酸的合成便終止。若將細(xì)胞中的谷氨酸釋放出細(xì)胞，而使胞內(nèi)谷氨酸濃度降低，就可以解除反饋抑制，使谷氨酸繼續(xù)合成。 改變細(xì)胞的通透性的方法：1、限制培養(yǎng)基中生物素濃度在15

23、mg/L，控制細(xì)胞膜中脂質(zhì)的合成；2、加入青霉素，抑制細(xì)胞壁肽聚糖合成中肽鏈的交聯(lián)；3、還可加入表面活性劑如吐溫80或陽(yáng)離子表面活性劑，將脂類從細(xì)胞壁中溶解出來(lái)，使細(xì)胞壁疏松，通透性增加；4、控制MnMn2+、ZnZn2+的濃度，干擾細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的形成。 另外，還可以通過(guò)誘變育種的方法，篩選細(xì)胞透性突變株。 n同樣增加細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性，對(duì)某些胞外酶的分泌也有一定作用。如在里氏木霉發(fā)酵過(guò)程中加入吐溫80，可提高纖維素酶的產(chǎn)量。 改變菌種的遺傳特性 反饋調(diào)節(jié)是微生物防止合成代謝產(chǎn)物過(guò)量產(chǎn)生的重要機(jī)制，解除反饋調(diào)節(jié)作用可以保證高水平積累各種代謝產(chǎn)物，除上所述外，改變微生物的遺傳特性，即改變酶

24、的活性或酶的合成系統(tǒng)，使之對(duì)反饋調(diào)節(jié)不敏感，也能夠達(dá)到過(guò)量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的目的。 篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株： 通過(guò)誘變育種的方法獲得。包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株、抗反饋調(diào)節(jié)突變株、組成型突變株、抗性突變株等的應(yīng)用。 例如，在分支合成途徑中，利用黃色短桿菌抗-氨基-羥戊酸(蘇氨酸的一種結(jié)構(gòu)類似物)的突變株發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸，由于該菌株的同型絲氨酸脫氫酶對(duì)蘇氨酸的反饋抑制不敏感，可以使發(fā)酵液中蘇氨酸的濃度高達(dá)14g/L。 n在分支合成途徑中可以利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株生產(chǎn)其中的一個(gè)末端產(chǎn)物。n選擇高絲氨酸脫氫酶營(yíng)養(yǎng)缺陷型。大量生產(chǎn)賴氨酸。n在直鏈?zhǔn)胶铣赏緩街?，不能利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株生產(chǎn)該途徑中的

25、末端產(chǎn)物，但可以利用這種菌株生產(chǎn)中間產(chǎn)物。例如，利用谷氨酸棒狀桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型(轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺陷)可以大量積累鳥(niǎo)氨酸。 n分支合成途徑中，也可以利用雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷型生產(chǎn)某種代謝產(chǎn)物。例如利用谷氨酸棒狀桿菌的蘇氨酸、甲硫氨酸雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行發(fā)酵，可以過(guò)量合成賴氨酸，賴氨酸濃度可達(dá)50g/L。 A B C D En除了利用抗反饋調(diào)節(jié)突變株和營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生產(chǎn)外，還可以利用既是抗反饋調(diào)節(jié)突變株，又是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的雙重突變株進(jìn)行氨基酸發(fā)酵。n例如，利用甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型和抗-氨基-羥戊酸的黃色短桿菌過(guò)量合成蘇氨酸；n利用酪氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型和抗對(duì)氨基苯丙氨酸的谷氨酸棒桿菌高水平積累苯丙氨酸。 人工控制黃色短

26、桿菌的代謝過(guò)程生產(chǎn)賴氨酸？營(yíng)養(yǎng)缺陷第三節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要調(diào)控機(jī)制 n次級(jí)代謝是存在于某些生物如植物和某些微生物中一類特殊的代謝類型，次級(jí)代謝產(chǎn)物與人類的生活和健康長(zhǎng)壽有著密切的關(guān)系，因此對(duì)其的研究受到了廣泛地重視。研究最多、最著名的是抗生素，其他包括生長(zhǎng)刺激素、生物堿、維生素、色素、毒素等。 一、次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)類型n因?yàn)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物的種類在不同的微生物中非常不同，所以次級(jí)代謝途徑遠(yuǎn)比初級(jí)代謝復(fù)雜，其代謝調(diào)節(jié)類型的多樣亦可想而知。已知抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控類型包括誘導(dǎo)調(diào)節(jié)、碳分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)、氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)、磷酸鹽調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)速度調(diào)節(jié)等。 酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)n在次級(jí)代謝途徑中，某

27、些酶也是誘導(dǎo)酶，在底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物存在時(shí)才會(huì)產(chǎn)生。例如，卡那霉素-乙酰轉(zhuǎn)移酶是在6-氨基葡萄糖-2-脫氧鏈霉胺（底物）的誘導(dǎo)下才能合成。參與展開(kāi)青霉的棒曲霉素合成的酶是被生物合成中的中間產(chǎn)物6-氨基水楊酸、龍膽酰醇和龍膽酰醛順序誘導(dǎo)合成。反饋調(diào)節(jié) 反饋調(diào)節(jié)在次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成中有著重要的作用，包括n次級(jí)代謝產(chǎn)物的自身反饋調(diào)節(jié)、n分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)、n初級(jí)代謝產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。 1、次級(jí)代謝產(chǎn)物的自身反饋抑制和反饋?zhàn)瓒鬾在多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵中，如青霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、嘌呤霉素、霉酚酸、殺真菌素、麥角堿等的生物合成途徑中，都發(fā)現(xiàn)了末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用。 n例如：嘌呤霉素合成

28、途徑中，嘌呤霉素可以反饋抑制其生物合成途徑中催化最后一步反應(yīng)的酶甲基轉(zhuǎn)移酶的活性；n卡那霉素合成途徑中，卡那霉素能夠反饋抑制其合成途徑中催化最后一步反應(yīng)的酶N-乙?？敲顾剞D(zhuǎn)移酶的活性；n麥角堿合成途徑中，麥角堿能抑制合成途徑中的二甲基丙烯色氨酸合成酶和裸麥素堿環(huán)化酶的活性；n氯霉素合成途徑中，氯霉素能反饋?zhàn)瓒羝浜铣赏緩街械谝粋€(gè)酶芳香胺合成酶的活性，但不影響產(chǎn)生菌體內(nèi)其他芳香化酶的活性。 n抗生素生產(chǎn)菌的生產(chǎn)能力與自身抑制所需抗生素濃度呈正相關(guān)性，生產(chǎn)能力越高的菌株，反饋抑制所需抗生素濃度也越高。n如產(chǎn)黃青霉Q176的生產(chǎn)能力為420g/ml，受到抑制的濃度為2mg/ml ；n產(chǎn)黃青霉菌株RL

29、1951的生產(chǎn)能力為125g/ml，受到抑制的濃度為200g/ml 。 2分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)定義：指易被菌體迅速利用的碳源和氮源及其分解產(chǎn)物對(duì)其他代謝途徑的酶類的調(diào)節(jié)作用。n在許多抗生素發(fā)酵中，都發(fā)現(xiàn)了葡萄糖的抑制作用，如青霉素、鹽霉素、春日霉素、吲哚霉素、放線菌素、卡那霉素、新霉素、桿菌肽等。次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，一般是在葡萄糖等速效碳源耗至一定濃度才開(kāi)始。除了葡萄糖外，凡能促進(jìn)產(chǎn)生菌生長(zhǎng)速度的碳源，對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成都表現(xiàn)出抑制作用。次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成速率與產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)速率呈相反關(guān)系。 n例如，在放線菌素生物合成中的氧化酚嗯嗪合成酶，受葡萄糖的阻遏。短桿菌肽合成中，葡萄糖分解生成的乙酸

30、和丙酸，在低pH條件下對(duì)短桿菌肽的合成產(chǎn)生阻遏作用。 n氮分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)也存在于次級(jí)代謝中。n例如，以銨鹽作為鏈霉素產(chǎn)生菌的唯一氮源時(shí)，可以抑制鏈霉素的合成；n在利用煙曲霉生產(chǎn)三羥甲苯中，無(wú)機(jī)氮源有利于菌體生長(zhǎng)，但不利于三羥甲苯的合成；n氮分解代謝產(chǎn)物的阻遏作用也存在于頭孢霉素生物合成中。 3初級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)某些初級(jí)代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，有兩種情況：1初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成有一條共同的合成途徑，當(dāng)初級(jí)代謝產(chǎn)物積累時(shí)，反饋抑制了某一步反應(yīng)的進(jìn)行，而最終抑制了次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。2初級(jí)代謝產(chǎn)物直接參與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，即初級(jí)代謝產(chǎn)物是次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成的前體，

31、當(dāng)此種初級(jí)代謝產(chǎn)物因?yàn)榉e累，反饋抑制了它自身的合成時(shí)，必然也同時(shí)影響了次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。 如：青霉素合成中，賴氨酸的過(guò)量抑制了同型(高異)檸檬酸的合成，進(jìn)而抑制了-氨基己二酸的形成，這樣即抑制了賴氨酸的合成，也抑制了青霉素的合成，因?yàn)橘嚢彼崤c青霉素的合成有一段共同的合成途徑 (三)磷酸鹽的調(diào)節(jié)n在抗生素等多種次級(jí)代謝產(chǎn)物合成中，高濃度磷酸鹽表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)。磷是微生物生長(zhǎng)繁殖的必需元素，濃度為0.3300mmol/L時(shí)，能支持微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)，但當(dāng)濃度超過(guò)10mmol/L時(shí)，就能抑制許多抗生素的生物合成。因此，磷酸鹽是一些次級(jí)代謝的限制因素。n微生物合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物途徑

32、的不同，磷酸鹽表現(xiàn)的調(diào)節(jié)機(jī)制也不同 。1、磷酸鹽能促進(jìn)初級(jí)代謝，抑制菌體的次級(jí)代謝 在微生物的代謝中，磷酸鹽除影響糖代謝、細(xì)胞呼吸及細(xì)胞內(nèi)ATP水平外，還控制著產(chǎn)生菌的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。如：向正在合成殺假絲菌素的灰色鏈霉菌培養(yǎng)液中添加5mmol的磷酸鹽，產(chǎn)生菌對(duì)氧的需要量顯著增加，抗生素的合成立即停止，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的RNA、DNA和蛋白質(zhì)的合成速率恢復(fù)到菌體生長(zhǎng)時(shí)期的速率。當(dāng)磷酸鹽被耗盡時(shí)，菌體的呼吸強(qiáng)度，DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成速率又降至抗生素合成期的狀態(tài)，抗生素重新開(kāi)始合成。 2過(guò)量磷酸鹽抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物前體的生物合成n在鏈霉素合成中，肌醇是合成鏈霉胍的前體(鏈

33、霉胍是組成鏈霉素的亞單位)，是由葡萄糖衍生來(lái)的。過(guò)量的磷酸鹽能引起菌體內(nèi)焦磷酸濃度增高，焦磷酸是催化6-磷酸葡萄糖向1-磷酸肌醇轉(zhuǎn)化的6-磷酸葡萄糖環(huán)化醛縮酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。因此，培養(yǎng)液中磷酸鹽濃度高時(shí)就抑制肌醇的形成，則必然影響鏈霉素產(chǎn)量。 3磷酸鹽阻抑次級(jí)代謝中的磷酸酯酶 在鏈霉素等的生物合成途徑的最后一個(gè)中間體，是無(wú)生物活性的磷酸化產(chǎn)物鏈霉素磷酸酯。此酯在磷酸酯酶的作用下生成相應(yīng)的鏈霉素和磷酸。另外在鏈霉素生物合成中有三步是在磷酸酯酶作用下的去磷酸反應(yīng)。上述的磷酸酯酶受到無(wú)機(jī)磷酸鹽的調(diào)節(jié)。所以在鏈霉素等氨基糖苷類抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，要很好控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽濃度。 (四)ATP的調(diào)節(jié)

34、作用 n在研究四環(huán)素的生物合成過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生菌體內(nèi)的ATP水平調(diào)節(jié)著四環(huán)素的合成。 n丙二酰CoA是四環(huán)素合成的前體。在菌體生長(zhǎng)旺盛期，乙酰CoA羧化酶活性高，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和羧基轉(zhuǎn)移酶的活力很低，在四環(huán)素合成期與其相反。 菌體生長(zhǎng)時(shí)期，過(guò)量的無(wú)機(jī)磷和ATP對(duì)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶抑制作用沿左側(cè)途徑進(jìn)行， 合成時(shí)期沿綠色途徑進(jìn)行。(五)產(chǎn)生菌生長(zhǎng)速率的調(diào)節(jié) 在豐富培養(yǎng)基中進(jìn)行的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究表明，大多數(shù)發(fā)酵過(guò)程都分為生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期。在生長(zhǎng)期次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶受到阻抑作用，次級(jí)代謝產(chǎn)物不被合成。主要是一些抗生素合成酶受到抑制或阻遏。 用恒化器培養(yǎng)法研究短桿菌肽S合成酶的合成時(shí)發(fā)現(xiàn)，調(diào)

35、節(jié)短桿菌肽S合成酶合成的是菌體的生長(zhǎng)速率。當(dāng)稀釋率高時(shí)(0.450.5/h)，合成的酶量很少，降低稀釋率，酶量就增加。限制不同營(yíng)養(yǎng)成分，出現(xiàn)最高酶活的稀釋率是不同的。限碳源時(shí)，酶的比活最高。由此提出調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的因子是菌體的比生長(zhǎng)速率，而不是某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在青霉素、四環(huán)素等的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，控制菌體的比生長(zhǎng)速率，能提高發(fā)酵水平，可能與調(diào)節(jié)菌體比生長(zhǎng)速率有關(guān)。 次級(jí)代謝調(diào)節(jié)：1酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)2反饋調(diào)節(jié)：次級(jí)代謝產(chǎn)物自身， 分解代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié) 初級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)3磷酸鹽的調(diào)節(jié)：促進(jìn)初級(jí)代謝，抑制次級(jí)代謝； 過(guò)量抑制次級(jí)代謝的前體； 阻抑次級(jí)代謝的磷酸酯酶。4ATP調(diào)節(jié)5產(chǎn)生菌生長(zhǎng)速率的調(diào)節(jié) 第四節(jié) 代謝工程n代謝工程系指利用基因工程技術(shù)，定向地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，以改變微生物的代謝特性，并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)領(lǐng)域。n在代謝工程設(shè)計(jì)中，主要有改變代謝流、擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑三種. 一、改變代謝途徑n改變代謝途徑是指改變分支代謝途徑的流向，阻斷其他代謝產(chǎn)物的合成，以達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物的目的。n改變代謝途徑有各種方法，如加速限速反應(yīng)、