Ⅳ 酶的提取與分離純化

1、1.1.預(yù)處理預(yù)處理2.2.細(xì)胞過(guò)濾分離細(xì)胞過(guò)濾分離3.3.酶提取酶提取4.4.酶分離純化酶分離純化5.5.酶濃縮、結(jié)晶、干燥酶濃縮、結(jié)晶、干燥6.6.酶保存酶保存7.7.酶制劑成型酶制劑成型酶工程下游技術(shù)操作條件酶工程下游技術(shù)操作條件1.1.加熱：加熱：使溫度達(dá)到最適溫度使溫度達(dá)到最適溫度2.2.凝聚，絮凝凝聚，絮凝3.3.加酸堿：加酸堿：達(dá)到最適達(dá)到最適phph1.1.細(xì)胞破碎法細(xì)胞破碎法機(jī)械破碎法：機(jī)械破碎法：研磨、攪拌、勻漿研磨、攪拌、勻漿物理破碎法：物理破碎法：溫度差法、壓力差法、超聲溫度差法、壓力差法、超聲 波波空穴效應(yīng)空穴效應(yīng)化學(xué)破碎法：化學(xué)破碎法：酸堿，有機(jī)溶劑破壞細(xì)胞壁、膜酸

2、堿，有機(jī)溶劑破壞細(xì)胞壁、膜酶破碎法：酶破碎法：加酶破壞細(xì)胞壁、膜；最適條件培加酶破壞細(xì)胞壁、膜；最適條件培 養(yǎng)，使溶酶體破裂自溶養(yǎng)，使溶酶體破裂自溶2.2.過(guò)濾方法：過(guò)濾方法：加壓、常壓、減壓過(guò)濾法加壓、常壓、減壓過(guò)濾法空穴效應(yīng)：空穴效應(yīng)：超聲波使發(fā)酵液中產(chǎn)生許多小氣泡，超聲波使發(fā)酵液中產(chǎn)生許多小氣泡， 氣泡破裂產(chǎn)生內(nèi)爆力使細(xì)胞破碎氣泡破裂產(chǎn)生內(nèi)爆力使細(xì)胞破碎1.1.本質(zhì)：本質(zhì)：使胞內(nèi)酶溶解到發(fā)酵液中，使酶出使胞內(nèi)酶溶解到發(fā)酵液中，使酶出 細(xì)胞細(xì)胞2.2.方法：方法：鹽溶法，有機(jī)溶劑溶解法，鹽溶法，有機(jī)溶劑溶解法，phph遠(yuǎn)離遠(yuǎn)離 pipi3.3.條件：條件：t t：0 0o oc-10c-1

3、0o oc c ph ph：酶活力范圍內(nèi)，遠(yuǎn)離酶活力范圍內(nèi)，遠(yuǎn)離pipi 提取液體積：提取液體積：酶液體積的酶液體積的2-52-5倍倍t t：0-100-10o oc c低溫低溫phph：根據(jù)要求根據(jù)要求, ,遠(yuǎn)離或趨近遠(yuǎn)離或趨近pipi加酶活保護(hù)劑：加酶活保護(hù)劑：有機(jī)溶劑提取、沉淀分離時(shí)有機(jī)溶劑提取、沉淀分離時(shí)防酶失活防酶失活沉淀分離沉淀分離膜分離膜分離離心分離離心分離層析分離層析分離電泳分離電泳分離等電點(diǎn)分離等電點(diǎn)分離一一 鹽析法鹽析法1.1.原理原理: :高濃度高濃度(nh4)(nh4)2 2so4so4中和蛋白質(zhì)表面電中和蛋白質(zhì)表面電 荷荷, ,使同電相斥作用減小使同電相斥作用減小凝聚

4、凝聚沉淀沉淀2.2.1.1.原理原理: :ph=piph=pi時(shí)時(shí), ,帶電量為零帶電量為零, ,同電相斥作用同電相斥作用 最小最小, ,凝聚凝聚沉淀沉淀2.2.注意：注意：等電點(diǎn)法不破壞水膜，不一定沉等電點(diǎn)法不破壞水膜，不一定沉 淀，須與其他方法聯(lián)合使用淀，須與其他方法聯(lián)合使用1.1.原理原理: :有機(jī)溶劑破壞蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)有機(jī)溶劑破壞蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu), ,使非使非 極性基團(tuán)外露極性基團(tuán)外露, ,極性基團(tuán)內(nèi)藏極性基團(tuán)內(nèi)藏, ,使使水膜水膜 破壞破壞, ,凝聚沉淀凝聚沉淀. .一一 壓差膜法壓差膜法1.1.納濾：納濾：2.2.微濾：微濾：3.3.超濾：超濾：1.1.定義：定義：用用兩塊膜兩塊膜把

5、水槽分為把水槽分為三個(gè)室三個(gè)室，加空，加空 間電場(chǎng)，使中間室中待分離液中正、間電場(chǎng)，使中間室中待分離液中正、 負(fù)離子分別電滲到兩邊的兩室負(fù)離子分別電滲到兩邊的兩室2.2.注意：注意：正離子正離子向向靠近負(fù)極的室靠近負(fù)極的室電滲電滲 負(fù)離子負(fù)離子向向靠近正極的室靠近正極的室電滲電滲1.1.定義：定義：將待分離液裝入膜袋中，膜袋外為將待分離液裝入膜袋中，膜袋外為 濃度濃度大于大于或或小于小于待分離液的溶液。待分離液的溶液。 利用濃度差使待分離液中利用濃度差使待分離液中水水、雜質(zhì)雜質(zhì) 通過(guò)滲透或滲析而與通過(guò)滲透或滲析而與需要的組分需要的組分分分 離離2.2.滲透與滲析滲透與滲析滲透：滲透：只有溶劑透

6、過(guò)膜只有溶劑透過(guò)膜滲析：滲析：有溶質(zhì)透過(guò)膜有溶質(zhì)透過(guò)膜四四 膜的選擇膜的選擇1.1.透水率：透水率：2.2.截留率：截留率：3.3.截留物相對(duì)分子量：截留物相對(duì)分子量：離心分離離心分離一一 離心機(jī)的選擇離心機(jī)的選擇1.1.常速離心機(jī)：常速離心機(jī)：vmax8000r/minvmax8000r/min； 用于：用于：2.2.高速離心機(jī)：高速離心機(jī)：vmaxvmax（1-2.51-2.5）10104 4r/minr/min； 用于：用于：3.3.超速離心機(jī)：超速離心機(jī)：vmaxvmax（2.5-122.5-12）10104 4r/minr/min； 用于：用于：生物大分子、生物大分子、二二 離心方法

7、離心方法1.1.差速離心法：差速離心法：利用密度（質(zhì)量數(shù)）不同的利用密度（質(zhì)量數(shù)）不同的 物質(zhì)離心速度不同而分離物質(zhì)離心速度不同而分離 密度大的物質(zhì)在離心瓶底部密度大的物質(zhì)在離心瓶底部 ，密度小的在上部，密度小的在上部2.2.密度梯度離心法：密度梯度離心法：3.3.等密度離心法：等密度離心法：層析分離層析分離一一 吸附層析吸附層析1.1.原理：原理：利用各物質(zhì)在同種吸附劑中擴(kuò)散速利用各物質(zhì)在同種吸附劑中擴(kuò)散速 度不同而分離度不同而分離2.2.常用吸附劑：常用吸附劑：二二 分配層析分配層析1.1.原理：原理：利用吸附劑與載體的共同作用，各利用吸附劑與載體的共同作用，各 物質(zhì)擴(kuò)散速度不同而分離，物

8、質(zhì)擴(kuò)散速度不同而分離，比吸附比吸附 層析效果好層析效果好2.2.三類：三類：濾紙層析濾紙層析 三三 離子交換層析離子交換層析1.1.原理：原理：利用離子交換劑上柱，以利用離子交換劑上柱，以離子鍵離子鍵與待分離與待分離物結(jié)合，再水洗掉雜質(zhì)，洗脫劑洗脫待分離物，物結(jié)合，再水洗掉雜質(zhì)，洗脫劑洗脫待分離物，從而得到待分離物從而得到待分離物，離子鍵結(jié)合穩(wěn)，效果好，離子鍵結(jié)合穩(wěn)，效果好2.2.幾個(gè)重要的離子交換劑：幾個(gè)重要的離子交換劑：3.3.幾個(gè)重要的洗脫劑：幾個(gè)重要的洗脫劑：離子交換劑：離子交換劑：陰離子交換劑：陰離子交換劑：帶正電的物質(zhì)，可吸附陰離子帶正電的物質(zhì)，可吸附陰離子陽(yáng)離子交換劑：陽(yáng)離子交換

9、劑：帶負(fù)電的物質(zhì)，可吸附陽(yáng)離子帶負(fù)電的物質(zhì)，可吸附陽(yáng)離子層析基本操作過(guò)程層析基本操作過(guò)程層析柱層析柱的準(zhǔn)備的準(zhǔn)備固定相材固定相材料的準(zhǔn)備料的準(zhǔn)備裝柱裝柱平衡平衡上樣上樣（洗滌和）（洗滌和） 洗脫洗脫收集洗收集洗脫液脫液洗脫液檢測(cè)，洗脫液檢測(cè)，繪制洗脫曲線繪制洗脫曲線（柱再生）（柱再生）四四 凝膠層析凝膠層析1.1.原理：原理：待分離液與凝膠溶液混合上柱，利待分離液與凝膠溶液混合上柱，利 用用大分子太大，不從凝膠網(wǎng)孔通過(guò)大分子太大，不從凝膠網(wǎng)孔通過(guò) ，而是從凝膠粒子間通過(guò)，而是從凝膠粒子間通過(guò)，受阻力受阻力 小，沉降快小，沉降快，而，而小分子小，可從凝小分子小，可從凝 膠網(wǎng)孔通過(guò)，在凝膠中膠網(wǎng)孔

10、通過(guò)，在凝膠中受阻力大受阻力大， 沉降慢沉降慢而分離而分離分子大小差距大的物分子大小差距大的物 質(zhì)質(zhì)2.2.幾種常用凝膠：幾種常用凝膠：五五 親和層析親和層析1.1.原理：原理：固定相上柱成母體，再用固定相上柱成母體，再用母體活化劑為母母體活化劑為母 體引入活潑基團(tuán)，體引入活潑基團(tuán)，使母體以使母體以共價(jià)鍵共價(jià)鍵與待分與待分 離物結(jié)合，再水洗、洗脫得待分離物，離物結(jié)合，再水洗、洗脫得待分離物，母母 體與待分離物結(jié)合穩(wěn)，效果好體與待分離物結(jié)合穩(wěn)，效果好2.2.固定相：固定相：3.3.母體活化劑：母體活化劑：母體：母體：上柱的載體上柱的載體 配體：配體：待分離物待分離物 固定相：固定相：同母體同母體

11、 親和層析操作過(guò)程親和層析操作過(guò)程 固定相選擇固定相選擇 固定相活化固定相活化 層析過(guò)程層析過(guò)程層析柱層析柱的準(zhǔn)備的準(zhǔn)備固定相材固定相材料的準(zhǔn)備料的準(zhǔn)備裝柱裝柱平衡平衡上樣上樣（洗滌和）（洗滌和） 洗脫洗脫收集洗收集洗脫液脫液洗脫液檢測(cè)，洗脫液檢測(cè)，繪制洗脫曲線繪制洗脫曲線（柱再生）（柱再生）下一輪下一輪上樣上樣電泳分離電泳分離 原理原理 電泳速率只與電泳速率只與q q、r r有關(guān)（有關(guān)（電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)、分子分子篩效應(yīng)篩效應(yīng)），而），而q q與與phph有關(guān)（有關(guān)（phph趨近趨近pipi時(shí)時(shí)q q最最小，反之同理小，反之同理），），r r與與m m有關(guān)（有關(guān)（m m大則大則r r大，大，反

12、之同理反之同理） 支持物要求支持物要求均勻、阻力小均勻、阻力小 電泳方法及原理電泳方法及原理一一 紙電泳紙電泳二二 薄層電泳薄層電泳三三 薄膜電泳薄膜電泳四四 凝膠電泳（凝膠電泳（比凝膠層析效果好比凝膠層析效果好）1.1.凝膠的組成與制作凝膠的組成與制作 組成：組成：?jiǎn)误w單體+ +交聯(lián)劑交聯(lián)劑+ +催化劑催化劑 制作：制作：三種成分混合溶解即可三種成分混合溶解即可2.2.單體、交聯(lián)劑與凝膠網(wǎng)孔大小的關(guān)系單體、交聯(lián)劑與凝膠網(wǎng)孔大小的關(guān)系 單體濃度單體濃度網(wǎng)孔大小網(wǎng)孔大小 交聯(lián)劑濃度占交聯(lián)劑濃度占5%5%網(wǎng)孔最小網(wǎng)孔最小3.3.連續(xù)凝膠電泳三連續(xù)：連續(xù)凝膠電泳三連續(xù)：?jiǎn)误w濃度、單體濃度、phph、

13、緩、緩沖液沖液連續(xù)連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳1.1.三個(gè)不連續(xù)：三個(gè)不連續(xù)：?jiǎn)误w濃度、單體濃度、phph、緩沖液不連、緩沖液不連 續(xù)續(xù)2.2.三種效應(yīng)：三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮 效應(yīng)效應(yīng)3.3.三層：三層：樣品膠層：樣品膠層：最上層，與樣品混合最上層，與樣品混合 濃縮膠層：濃縮膠層：樣品大多因分子太大濃樣品大多因分子太大濃 縮于此縮于此 分離膠層：分離膠層：需分離出的樣品通過(guò)濃縮層，需分離出的樣品通過(guò)濃縮層， 聚集于分離膠層聚集于分離膠層不連續(xù)凝膠電泳比連續(xù)凝膠電泳效果好不連續(xù)凝膠電泳比連續(xù)凝膠電泳效果好濃度梯度凝膠電泳濃度梯度凝膠電泳1.1.定義：

14、定義：上面單體濃度小，網(wǎng)孔大；往下單上面單體濃度小，網(wǎng)孔大；往下單 體濃度依次增大，網(wǎng)孔依次變小，體濃度依次增大，網(wǎng)孔依次變小， 增大了分子篩效應(yīng)，增大了分子篩效應(yīng)，比連續(xù)凝膠電比連續(xù)凝膠電 泳效果好泳效果好2.2.特點(diǎn)：特點(diǎn)：分子篩效應(yīng)大于電荷效應(yīng)，為主要分子篩效應(yīng)大于電荷效應(yīng)，為主要 效應(yīng)效應(yīng)3.3.作用：作用：不同質(zhì)量數(shù)的物質(zhì)聚于不同的膠層不同質(zhì)量數(shù)的物質(zhì)聚于不同的膠層 ，m m大的聚于上層，大的聚于上層，m m小的聚于下層小的聚于下層 可用于測(cè)可用于測(cè)/ /比較比較m msds-page（1.1.電泳速度只與網(wǎng)孔大?。娪舅俣戎慌c網(wǎng)孔大?。ǚ肿雍Y效應(yīng)分子篩效應(yīng)）有）有 關(guān)原因關(guān)原因 s

15、ds sds與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞三級(jí)結(jié)構(gòu)二硫鍵，與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞三級(jí)結(jié)構(gòu)二硫鍵，與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，該復(fù)合物短軸均為與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，該復(fù)合物短軸均為1818埃埃左右，長(zhǎng)軸與左右，長(zhǎng)軸與m m有關(guān)：有關(guān)：m m越大越大長(zhǎng)軸越長(zhǎng)軸越長(zhǎng)，長(zhǎng)，長(zhǎng)度差距很大，長(zhǎng)度差距很大， m m越大越大長(zhǎng)軸越長(zhǎng)，長(zhǎng)軸越長(zhǎng)，在凝膠中受到阻力越大，電泳速度越小在凝膠中受到阻力越大，電泳速度越小2.2.作用：作用：測(cè)測(cè)m mm m與電泳速率有關(guān)：與電泳速率有關(guān)：可以通過(guò)測(cè)電泳速率得可以通過(guò)測(cè)電泳速率得m m等電點(diǎn)聚焦電泳等電點(diǎn)聚焦電泳1.1.原理：原理：兩性離子載體加入到電泳池中，兩兩性離子載體加入到電泳池中，兩 電極

16、通電后，正極到負(fù)極電極通電后，正極到負(fù)極phph依次增依次增 大，不同蛋白質(zhì)大，不同蛋白質(zhì)pipi不同，不同，ph=piph=pi時(shí)的時(shí)的 地方該蛋白質(zhì)帶電量為零，聚集于地方該蛋白質(zhì)帶電量為零，聚集于 此，此，可用于分離不同的蛋白質(zhì)可用于分離不同的蛋白質(zhì)2.2.兩性離子載體：兩性離子載體：萃取分離萃取分離一一 有機(jī)萃取有機(jī)萃取1.1.原理：原理：利用不同物質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度利用不同物質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度 不同而分離不同而分離2.2.作用：作用：用于分離有機(jī)物與無(wú)機(jī)物用于分離有機(jī)物與無(wú)機(jī)物二二 雙水相萃取雙水相萃取1.1.雙水相的制備方法雙水相的制備方法高聚物與高聚物：高聚物與高聚物：相互有排

17、斥力，不成單相相互有排斥力，不成單相高聚物與無(wú)機(jī)鹽：高聚物與無(wú)機(jī)鹽：有機(jī)物與無(wú)機(jī)物不成一相有機(jī)物與無(wú)機(jī)物不成一相2.2.原理：原理：利用不同物質(zhì)在雙水相中溶解度不利用不同物質(zhì)在雙水相中溶解度不 同而分離同而分離3.3.優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可直接從細(xì)胞中提取酶，不用處理可直接從細(xì)胞中提取酶，不用處理 細(xì)胞殘片；可室溫下操作，利于工細(xì)胞殘片；可室溫下操作，利于工 業(yè)化生產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)三三 超臨界萃取超臨界萃取1.1.原理：原理：超臨界流體作萃取劑，利用不同物超臨界流體作萃取劑，利用不同物 質(zhì)在超臨界流體中溶解度不同而分質(zhì)在超臨界流體中溶解度不同而分 離離2.2.超臨界流體：超臨界流體：t t、p p超過(guò)臨界值形成的流體超過(guò)臨界值形成的流體 ，性質(zhì)介于氣相與液相之間，性質(zhì)介于氣相與液相之間3.co3.co2 2作萃取劑原因：作萃取劑原因：coco2 2臨界點(diǎn)易達(dá)到，臨界點(diǎn)易達(dá)到， coco2 2 的超臨界流體易制取的超臨界流體易制取4. co4. co2 2作萃取劑優(yōu)點(diǎn)：作萃取劑優(yōu)點(diǎn)：coco2 2無(wú)毒、不腐蝕、價(jià)格低無(wú)毒、不腐蝕、價(jià)格低 、可循環(huán)利用、可循環(huán)利用四四 反膠束萃取反膠束萃取1.1.原理：原理：利用正膠束與反膠束轉(zhuǎn)換分離出酶利用正膠束與反膠束轉(zhuǎn)換分離出酶2.2.定義定義表面活性劑：表面活性劑：極性基團(tuán)與非極性基團(tuán)組成的有機(jī)物極性基團(tuán)與非極性基團(tuán)組成的有機(jī)物正膠