雙藤痹痛凝膠對(duì)CIA大鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用研究

1、雙藤痹痛凝膠對(duì)CIA大鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用研究【摘 要】 目的：分析雙藤痹痛凝膠對(duì)膠原免疫性關(guān)節(jié)炎大鼠外周CD+4CD+25FoxP3+Treg 細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。方法：Wistar大鼠50只，隨機(jī)分成5組，分別為正常組、模型組、雙藤痹痛凝膠高劑量組、中劑量組、低劑量組，膠原蛋白誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中IL-6表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周血CD+4CD+25 T細(xì)胞及CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞水平顯著升高，且高、中劑量組血清IL-6水平顯著下降。結(jié)論：雙

2、藤痹痛凝膠治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能通過(guò)上調(diào)外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞表達(dá)水平，降低血清IL-6水平，從而恢復(fù)免疫耐受作用。【關(guān)鍵詞】 雙藤痹痛凝膠劑；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞【中圖分類號(hào)】R2855 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）23-0033-03類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA），是一種慢性全身性自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)痹證;范疇，臨床常出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛，腫脹，僵直，變形等癥狀，病情反復(fù)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量【1】。雙藤痹痛凝膠為我院院內(nèi)制劑雙藤痹痛酊（批準(zhǔn)文號(hào)： 閩藥制 Z20110008） 的基礎(chǔ)上研

3、制而成的新型制劑，凝膠劑是一種以水溶性高分子化合物或親水性物質(zhì)為基質(zhì)，與中藥或中藥提取物混合后，涂布于布上制成的外用貼劑，具有透氣性好、載藥量大、耐汗性強(qiáng)，可反復(fù)黏貼，不污染衣物，藥物無(wú)致敏、無(wú)刺激性等副作用。前期臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抑制 CIA 模型大鼠足趾腫脹和關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，降低其關(guān)節(jié)炎指數(shù)的作用【2】。近年的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能與數(shù)量對(duì)RA等自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要的影響，特別是對(duì)CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞的影響，它可能成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新策略和途徑，因此，本文旨在探討雙藤痹痛凝膠是否通過(guò)調(diào)節(jié)CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞，而

4、發(fā)揮抗RA的作用。1 材料與儀器11 動(dòng)物 Wistar大鼠50只，雌雄各半，SPF級(jí)，體重（220±20） g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，均由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始試驗(yàn)。12 藥物與試劑 藥物 雙藤痹痛凝膠，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，每片（8cmx12cm） 含雷公藤甲素24659μg，含青藤堿15589mg；空白凝膠膏劑，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。試劑弗氏完全佐劑（chondrex公司，批號(hào)：7002），型膠原（chondrex公司，批號(hào)：2002-2）；APC-抗CD4 mAb（

5、批號(hào)：551980）、PE-FoxP3 mAb（批號(hào)：560046）、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（批號(hào)：F1567）均購(gòu)于Bioscience公司，F(xiàn)ITC-抗CD25 mAb（批號(hào)：553071）購(gòu)于Biolegend公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)BD公司。13 儀器 CS-1EAS型電子天平（北京市菲姆斯科技開發(fā)公司，精度01g）；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海儀分科學(xué)儀器有限公司）；InfiniteM200 Pro多功能酶標(biāo)儀（TECAN）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。2 方法21 大鼠CIA模型的建立 取50只Wistar大鼠，隨機(jī)分成五組，每組10只，用刮毛刀

6、刮去大鼠背部毛，以供貼藥。將弗氏完全佐劑（FAC）與2mg/mL的型膠原乳液等體積混合，制成1mg/ml的膠原乳劑，除正常組外，按每只大鼠02mL乳劑（含C02mg）于尾根部皮下注射造模。7d后強(qiáng)化1次，除正常組外，按每只大鼠01mL乳劑（含C01mg）于尾根部皮內(nèi)注射造模。22 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 除正常組外，其余各組（模型組、雙藤痹痛凝膠膏劑高、中、低劑量組）動(dòng)物初次免疫后次日起開始給藥，將藥物貼于大鼠背部后，并用醫(yī)用膠布固定；每日給藥1次，連續(xù)28d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小為2cmx3cm；高、中、低劑量給藥組分別給于大小為1cmx3cm、2cmx3cm、3cmx3cm的雙藤痹痛凝膠

7、膏劑。23 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg 摘眼球取血，肝素抗凝收集；取血100μL，加入含有05μLCD4-FITC和25μL CD25-APC單克隆抗體的離心管中，室溫避光孵育30min；加入1mL紅細(xì)胞溶解液混勻，以1500r/min離心5min，棄其上清液；加入1mL透化緩沖液（1x），以1500r/min離心5min，以試管底部不見紅色為度；棄其上清液，加固定/透化工作液500μL震勻，4下避光孵育12h（或過(guò)夜）。加流式染色緩沖液以1500r/min離心5min，清洗，于上述細(xì)胞懸液，加入含有1μL FoxP3-PE單克隆抗

8、體（設(shè)IgG2α為同型對(duì)照）震勻，室溫避光孵育30min，加流式染色緩沖液清洗，加01moL/L PBS調(diào)定至300μL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。24 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清IL-6表達(dá)水平 眼眶采血，1500rpm/min離心15min制備血清，待測(cè)上清液、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)抗體使用量均為100μL，參照試劑盒的說(shuō)明書檢測(cè)血清中IL-6的含量。25 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)結(jié)果均以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P005表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果31 外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞水平 采用三色熒光法標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，

9、模型組大鼠外周血CD+4CD+25T細(xì)胞水平顯著下降，CD+4CD+25T細(xì)胞中FoxP3+T表達(dá)明顯下降（P005或P001），CD+4CD+25FoxP3-T和CD+4CD+25FoxP3+T表達(dá)水平明顯明顯升高（P005或P001）；與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周CD+4CD+25T細(xì)胞水平顯著升高，同時(shí)CD+4CD+25T細(xì)胞中FoxP3+T表達(dá)水平明顯升高，CD+4CD+25FoxP3+T表達(dá)水平顯著下降（P005或P001）。而雙藤痹痛凝膠中劑量組除了CD+4T細(xì)胞及CD+4CD+25FoxP3+T顯著下降外（P001），其余無(wú)明顯變化。32 大鼠血清中IL-6表達(dá)

10、水平 與正常組比較，模型組的IL-6水平顯著升高（P001），雙藤痹痛凝膠高、中劑量組與模型組比較，均能顯著降低IL-6表達(dá)水平（P005或P001），而低劑量組無(wú)明顯變化。4 討論已有文獻(xiàn)研究表明，CD+4CD+25T細(xì)胞的數(shù)量減少或者功能的異?？赡苁怯捎谄鋮⑴c了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生【5】，而FoxP3（Forkhead boxP3，F(xiàn)oxP3）則是目前公認(rèn)的CD+4CD+25T細(xì)胞特異性標(biāo)志，其基因表達(dá)調(diào)控著免疫T細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟，一旦CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞表達(dá)下降，可能直接影響機(jī)體免疫耐受，最終導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生【6】。因此，研究CD+4CD+

11、25T細(xì)胞及其特異性標(biāo)志物FoxP3，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙藤痹痛凝膠在一定劑量下可降低CD+4T細(xì)胞水平，同時(shí)升高CD+4CD+25T細(xì)胞水平和CD+4CD+25T細(xì)胞中FoxP3+表達(dá)水平，降低IL-6水平。這可能就是前期研究發(fā)現(xiàn)，雙藤痹痛凝膠具有抑制CIA模型大鼠足趾腫脹和關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，降低其關(guān)節(jié)炎指數(shù)作用機(jī)制之一。參考文獻(xiàn)【1】胡蔭奇.風(fēng)濕性疾病診斷治療指南.1版.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2006：84.【2】嚴(yán)國(guó)鴻，黃燕，李煌，等.雙藤痹痛凝膠膏劑對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的作用.中藥藥理與臨床，2014，01：119-121.【3】郭應(yīng)強(qiáng)，邱桐，曾昭洋，等.敦煌消痹定痛酊對(duì)膠原誘導(dǎo)性大鼠關(guān)節(jié)炎病理形態(tài)學(xué)的影響.中醫(yī)兒科雜志，2007，3（1）：14-16.【4】趙海梅，劉端勇，程紹民，等.型膠原蛋白對(duì)CIA大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+ T細(xì)胞的影響.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（3）：290-291.【5】MorganME， Sutmuller RPM， Witteveen HJ， et al. CD25+ cell depletion hastens the onset of severe disease in collagen-induced arthritis. Arth