GB-T18936-2020高致病性禽流感診斷技術(shù)

?ICS11.220B41

中華人民共和

國家標準

GB/T18936—2020

代替GB/T189362003

高致病性禽流感診斷技術(shù)

Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfluenza

2020-12-14發(fā)布 2020-12-14實施

I轟裏霞審暮霱雲(yún)養(yǎng)唇

GB/T18936—2020

目次

I1細 1

2規(guī)范性引用文件 1

3術(shù)語和定義 1

4臨床診斷 2

5樣品采集、保存與運輸 2

6病毒分離與鑒定 3

7血凝和血凝抑制試驗 3

8禽流感病毒RT-PCR試驗 4

9禽流感病莓實時熒光KT-PCR試驗 5

10綜合判定 6

附錄A（規(guī)范性附錄）試驗所用溶液和1%雞紅細胞的配制 7

附錄B（資料性附錄）髙致病性禽流感病毒IVPI測定試驗 8

附錄C（資料性附錄）血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法 10

附錄D（資料性附錄）禽流感病毒RT-PCR試驗用引物 12

附錄E（資料性附錄）RT-PCR反應(yīng)液配制 13

附錄F（資料性附錄）實時熒光RT-PCR引物探針序列及反應(yīng)液配方 14

本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標準代替GB/T18936-2003＜髙致病性禽流感診斷技術(shù)》.與GB/T18936-2003相比.主要技術(shù)變化如下：

——增加了禽流感病毒RT-PCR試驗（見第8章〉＞

增加丫禽流感病毒實時熒光RT-PCR試驗（見第9章）；

—刪除f瓊脂凝膠免疫擴散（AGID）試驗（見2003年版的第4章）,

刪除了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（見2003年版的第5章）。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。

本標準由全國動物衛(wèi)生標準化技術(shù)委員會（SAC/TC181）歸口。

本標準起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱苒醫(yī)研究所、中華人民共和國北京海關(guān)、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心。

本標準主要起草人:王秀榮、田國彬、劉環(huán)、鄧國華、蔣文明、施建忠、曾顯營、李雁冰、谷強、孫曉東、陳化蘭，

本標準所代將標準的歷次版本發(fā)布情況為：

——GB./T18936-2003。

GB/T18936—2020

高致病性禽流感診斷技術(shù)

1范圍

本標準規(guī)定了髙致病性禽流感臨床診斷，樣品采集.保存與運輸.病毒分離與鑒定.血凝和血凝抑制試驗.禽流感病毒RT-PCR試驗和禽流感病毒實時熒光RT-PCR試驗的技術(shù)要求。

本標準適用于髙致病性禽流感的診斷、檢疫、檢測、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)査等。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新，坂本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

NY/T765髙致痃性禽流感樣品采集、保存及運輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件，

3.1

商致病性禽流感highlypathogenicavianinfluenza?HPAl

由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病賚引起的以禽類為主的急性傳染病。

3.2

血凝hemagglutinin;HA

流感病毒顆粒表面的血凝索蛋白，具有識別紅細胞表面受體并使紅細胞凝集的特性。

3.3

血凝抑制hema朗lutinininhibition；HI

抗體特異性地附著在HA分子的抗原位點上，干擾流感病毒HA與紅細胞受體之間的結(jié)合.抑制了流感病毒HA凝集紅細胞的能力。

3.4

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)reversetranscription-polymerasechainreaction；RT-PCR

一種用于放大擴增特定的RNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。先用RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以cDNA為模板進行PCR擴增的過程。

3.5

實時熒光RT-PCRreal-timeRT-PCR

利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程的一種擴增核酸方法。

Ct值cyclethreshold

毎個反應(yīng)管內(nèi)的熒光倌號量達到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。

4臨床診斷4.1易感動物

雞、火雞、鴨、鵝、鶴鶉、雉雞、鵝鴣、蛇鳥、孔雀等多種禽類易感.多種野烏也可感染發(fā)病。4.2臨床癥狀

4.2.1

4.2.2

4.2.3

4.2.4

精神沉郁.嗜睡，頭翅下垂.呆立I食欲不振；呼吸困難，有呼吸道癥狀。

雞冠發(fā)鉗、發(fā)紫;眼結(jié)膜發(fā)紅;排 未完全消化的飼料;腳鱗或有出血。

產(chǎn)蛋下降.軟殼蛋、畸形

鴨、鵝等水禽可貝

略物.甚至失明。

4.3剖檢變化

神大出*:直

出血。

4.4結(jié)

］為髙

出

3中的

鹽似病

一步開

:診斷。

.2

5樣品

集.

存與運轍

5.1總則

免交叉污染。死禽或其他動物采集氣贊、肺和腦等

5.2拭子樣品

歪脖于等神經(jīng)癥狀。

和腹

.出血?有少黏液；肺部有炎性癥狀r

，卵泡充血、出

胎肪出血：腺胃乳頭司

5.2.1采集咽喉拭子時將拭

頭及上W

轉(zhuǎn).取分泌液。

便。

遮腔拭子I小珍禽用拭子取樣易造成損傷，可

4.3.1氣管彌

4.3.2腹腔

血、萎縮、

4.3.3心置及

njf梅黃性腹祺炎”：興腺邊絕有出血、：K死.

樣品采

禽進行，采樣i

禽樣品應(yīng)包括咽

期、遵樣具寥典型臨床癥狀的［樣＜，進行分別處理;活

5.2.2采集泄殖腔拭子時將拭子深人 i取少量糞便。

5.2.3將采樣后的拭子分別放人盛有1.2mL樣品稀釋液（配制方法見附錄A中的A.1）的2mL采樣管中.編號并填寫相應(yīng)采樣單。

5.3組織樣品

發(fā)病禽鳥町無歯采集氣管、肺、腦、腸（包括內(nèi)容物）、肝、脾、腎、心等組織臟器.裝入15mL或

50mL帶螺口的有機材料保存管中.編號并填寫相應(yīng)采樣單。

5.4血清樣品采集

無菌采集禽類的血液，毎只約2mL,編號并填寫相應(yīng)采樣單。待血液凝固.血清析出后.收集血清用于HI檢測。

5.5樣品保存和運輸

樣品采集后置保溫箱中，加入預(yù)冷的冰袋.密封.宜24h內(nèi)送實驗室。樣品應(yīng)盡快處理.沒有條件的可在4r存放不超過d.也可在低溫條件下保存（一70’C貯存為宜）。

6病毒分離與鑒定

6.1適用范圍

病毒分離與鑒定方法適用于對HPAI的病原學(xué)診斷，應(yīng)在有資質(zhì)的髙等級生物安全實驗室操作.按照GB19489的規(guī)定執(zhí)行。

6.2樣品處理

將棉拭子充分捻動、擠十后棄去拭子；糞便、研碎的組織加樣品稀釋液充分研磨.按照1g組織加10mLPBS的比例配成懸液。樣品液經(jīng)3000r/min離心10min.取上清作為接種或者核酸檢測材料。

6.3樣品接種及收獲

取處理好的樣品，以0.2mL/胚的i經(jīng)尿囊腔途徑接種9d?11d無特定病原體雞胚.毎個樣品接種3?5枚雞胚.在37‘C孵化箱內(nèi)孵育.毎天上午和下午定點觀察雞胚死亡情況。無菌收取死胚及96h仍存活璁胚的雞胚尿囊液.測HA活性。

6.4病番鑒定

若無HA活性.則收取尿囊液進行肓傳.至少育傳1代，若仍陰性，則認為病毒分離陰性I若有HA活性說明可能有正黏病灌科的流感病哿.可進一步采用血凝和血凝抑制試驗（見第7章）、高致病性禽流感病毐IVPI（靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)）測定試驗（參見附錄B）、禽流感病毒RT-PCR試驗（見第8章）、禽流感病堆實時熒光RT-PCR試驗（見第9章〉等方法進行驗證。

7血凝和血凝抑制試驗

7.1適用范圍

血凝和血凝抑制試驗適用于血凝素亞型的診斷和抗體效價擁定。

7.2試劑

7.2.1阿氏（Alsevers）液，配方參見A.2。

7.2.21%雞紅細胞懸液.配方參見A.3.

7.2.3pH7.2、0.01mol/LPBS，配方參見A.4。

7.2.4禽流感病毒血凝素分型標準抗原、標準陽性血清、陰性血清。

7.3HA試驗（微量法）試驗步驟

7.3.1在96孔V型微B反應(yīng)板中，每孔加0.025mLPBS。

7.3.2第1孔加0.025mL抗原或病莓液.反復(fù)吹吸3次?5次混勻。

7.3.3從第1孔吸取0.025mL抗原或病毒液加人第2孔.混勻后吸取0.025mL加人第3孔.進行2倍系列稀釋至第11孔.從第11孔吸取0.025mL棄去。第12孔為PBS對照孔。

5

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7.3.4毎孔加0.025mL?BS。

7.3.5每孔加人0.025ml1%（體積分數(shù)）鴉紅細胞懸液。

7.3.6結(jié)果判定。輕扣反應(yīng)板混合反應(yīng)物.室溫（約20’C）靜置40min，環(huán)境溫度過髙時可在4t條件下靜置60min,^對照孔的紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結(jié)果。判定時，將反應(yīng)板傾斜60觀察紅細胞有無淚珠狀流淌.完全無淚珠樣流淌（100%凝集）的最髙稀釋倍數(shù)判為血凝效價。

7.4HI試驗（微量法）試撿步驟

7.4.1根據(jù)HA試驗測定的效價配制4個血凝單位（即4HAU）的病毒抗原。4HAU抗原應(yīng)根據(jù)檢驗結(jié)果調(diào)整準確。

示例：如果血凝的終點滴變?yōu)? =64（EP1:64）;取PBS6.3mL,加抗原

0.1mL.即通過1:64稀釋獲得#.將配制的4HAU抗原進行系列稀釋，観終稀釋度為1!2J|^1' 和1:7。取，加人PBS0.025mL,再加人

min，如果配制的抗原液為集終點；如果高于4HAU,可能1|5或1:6為_<如于4HAU,可能1:2或

log:

1%雞紅細胞懸液凝板在室溫（約20’C）條件下靜置41

4HAU，則1>4

1，3為終點?/ /

7.4.2第1 孔加人0.025mLPBS.第12孔加人0.05mLPBS作為炎白

7.4.3第l/加A"0.025mL血清（鴨、的jfa濟車

PBS充分者勻漆取0.】|驗抒2孔，依次2

11孔作5

7.4.43

60mino

7.4.5?

4?C60!

7.4.6名

2log2），

4HAU抗J

效價不髙于

吋建i義進行頂處埋,_見_

釋至第W孔.從第10孔吸觀.

f第1孔血清與

6mL棄去。第

充原曩照。

某亞型禽流感q

價不髙于118U

其他病毒檢測方法

第112加入1IHA'

\0.025 分數(shù)〉雞

對照孔~孔、呈盧扣狀吋解定

氣抗原對照孔（第ii孔）寵全凝彙.且與性對照血清抗體紋&血清抗_玫價與a知效

種釋倍數(shù)判為該盧清的hi抗體效價，用丁檢測擾體.

t體抑制.HI效價不低于1|16（24或4log2）時^^為陰性，對于疑似H5亞型等抗原性

8禽流感病毒RT-PCR試驗

8.1適用范圍

抗原.在章街（約20r）下

胞鉍液蕩混

<約20?<

3i

i爺?shù)巫儠r.試齄方我

抗體效價.用T檢

適用于檢測禽組織、分泌物、排泄物、雞胚培養(yǎng)物等物質(zhì)中禽流感病毒核酸。

min或4"C

IS40min或

iSF1:4（2、或蜷以完全抑制淸時，HI抗體I測抗原.能夠被

用

陽性；HI抗體效

f差別的病毒，應(yīng)結(jié)合

8.2儀器設(shè)備

8.2.1PCR擴增儀及配套反應(yīng)管。

8.2.2髙速臺式冷凍離心機（離心速度不低于12000r/min）。

8.2.3n級生物安全柜。

8.2.4微童移液器（5gL、10pL、100ML、1000gL）及配套吸頭與1.5mL離心管。

8.2.5電泳儀。

8.2.6電泳槽。

4

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8.2.7紫外凝膠成像儀。

8.3試劑

8.3.1推薦的禽流感病埠RT-PCR引物序列.參見附錄D。

8.3.2RT-PCR反應(yīng)液.配方參見附錄E的E.1。

8.3.3無核酸酶水，配方參見E.2。

8.3.4無水乙醇。

8.3.5陰性對照為SPF雞胚尿囊液。

8.3.6陽性對照為滅活的相應(yīng)亞型禽流感病毒胚培養(yǎng)物。

8.4RNA提取

可選市售商品化RNA提取試劑盒，按說明書進行。

8.5RT-PCR操作

取2.5（約250ng）提取的RNA加人RT-PCR反應(yīng)液中，置于PCR儀中.循環(huán)參數(shù)為：45’C逆轉(zhuǎn)錄45min；94'C預(yù)變?生2min;94.C30s、52-C45s、68‘C45s，35個循環(huán)；最后68'C延伸8min。

8.6電泳

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

8.7結(jié)果判定

在陽性對照出現(xiàn)相,3擴增帶、陰性對照無此擴增帶時判定結(jié)果。出現(xiàn)預(yù)期大小的擴増片段時.判定為核酸檢測陽性，否則判定為陰性。

9禽流感病毒實時熒光RT-PCR試驗

9.1適用范圍

實時熒光RT-PCR適用于檢測禽組織、分泌物、排泄物、雞胚尿囊液等物質(zhì)中禽流感病毒核酸。9.2儀器設(shè)備

9.2.1熒光PCR儀。

9.2.2其余器材同8.2.2?8.2.4。

9.3試劑及引物探針序列

推薦的實時熒光RT-PCR引物探針序列參見附錄F的F.1。

9.4樣本核酸的提取

可選市售商品化RNA提取試劑盒.按說明書進行。

9.5實時熒光RT-PCR操作

9.5.1實時熒光RT-PCR擴増試劑的準備與配飼

宜在專門的反應(yīng)混合物配制區(qū)配制實時熒光RT-PCR擴增試劑。根據(jù)需要檢測的樣品數(shù).按推薦

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的實時熒光RT-PCR反應(yīng)液配方（參見F.2）配制反應(yīng)液.充分混勻后分裝，毎個反應(yīng)管15mL。轉(zhuǎn)移反應(yīng)管至樣本制備區(qū)。

9.5.2加樣

宜在專門的樣本制備區(qū)進行。在9.5.1配好的反應(yīng)管中分別加入9.4中制備的RNA溶液5mL（約500ng）.使每管總體積達到20ML，記錄反應(yīng)管對應(yīng)的樣品編號。蓋緊管蓋后，500r/min離心30s。

9.5.3實時熒光RT-PCR反應(yīng)設(shè)定

宜在專門的檢測區(qū)進行實時熒光RT-PCR反應(yīng)。將9.5.2中加樣后的反應(yīng)管放人實時熒光RT-PCR檢測儀內(nèi)，編輯樣品表后，選定與探針標記熒光基團相符合的檢測通道讀取熒光信號值，淬滅基團選擇none。推薦的實時熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)定參見F.3。

9.6結(jié)果判定

9.6.1結(jié)果分析條件設(shè)定

綜合分析儀器讀取的各項數(shù)據(jù)及擴增曲線，設(shè)定合理的閾值（threshold）和基線（baseline）,使儀器顯示正確的結(jié)果。

9.6.2質(zhì)控標準陰性對照檢測通道讀取數(shù)據(jù)無Ct值或Ct值＞35并且無特征性擴增曲線。

陽性對照檢測通道讀取數(shù)據(jù)出現(xiàn)特征性擴增曲線，且Ct值應(yīng)＜30。

如陰性和陽性對照不滿足以上條件.此次試驗視為無效。

9.6.3結(jié)果描述及判定

若測定樣品Ct值＜30,判為所用引物探針禽流感病毒特定型或亞型核酸陽性。

若測定樣品30＜Ct值＜35.判為可疑。重復(fù)測定后仍在可疑區(qū)間的樣本判為陽性。若測定樣品無Ct值或Ct值＞35,判為陰性。

10綜合判定

10.1疑似

出現(xiàn)4.23.3中的情況，初步判為商致病性禽流感臨床疑似病例，若其H5或H7亞型的RT-PCR或?qū)崟r熒光RT-PCR檢測陽性.可判為髙致病性禽流感疑似病例。

10.2確診

病毒分離物經(jīng)HA和HI試驗確定為流感病毒.且分離物的IVPI值大于1.2,判定為高致病性禽流感病毒；如果IVPI值小于1.2的H5或H7亞型禽流感病毒.在HA裂解位點處具有與HPAI病毒相似的氨基酸序列?亦判定為髙致病性禽流感病毐。分離到髙致病性禽流感病毐的病例判定為卨致病性禽流感確診病例。

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

試驗所用溶液和1%雞紅細胞的配制

A.1樣品稀釋液

樣品稀釋液的配制方法如下：

a） A液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液。NaH2PO4?H2O27.6g.溶于蒸餾水中.最后定容至1000mL。

b） B液,0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液.N&HPCX.7H,053.6g，或Na2HPO4.12H:O71.6g或Na2HPO4?2H,035.6g，加蒸餾水溶解.最后定容至1000mL.

c） 0.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）（含抗生索和穩(wěn)定劑）的配制。取A液14mL.B液36mL,加NaCl8.5g,用蒸餾水定容至1000mL。經(jīng)121?（：士2rjSmin髙壓滅菌.冷卻后.無菌條件下分別加入青霉索2000U/mL、鏈蔣索（2mg/mL）、慶大霉素（50Mg/mL）、霉菌抑制索（1000U/mL）和牛血清白蛋白（5mg/mL）。

上述抗生素濃度宜用于組織和咽喉拭子.如果用作糞便和泄殖腔拭子的緩沖液.抗生索濃度可提髙5儕。

A.2阿氏(Alsevers)液配制

稱取葡萄糖2.05g,擰橡酸鈉0.8g、擰檬酸0.055g、氣化納0.420g,加蒸餾水至100mL,散熱溶解后調(diào)pH值至6.1.69kPa15min髙壓滅蘭，4‘C保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3 1%雞紅細胞懸液

采集至少三只SPF雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合.用pH7.2的0.01mol/LPBS洗滌3次.每次均以1000r/min離心10min.洗滌后用PBS配成1%（體積分數(shù)）紅細胞懸液.4T保存?zhèn)溆谩?/p>

A.4pH1mol/LPBS的配制

pH7.2,0.01mol/LPBS的配制方法如下：

a） 配制25XPB,稱量2.74g磷酸氫二鈉和0.79g磷酸二氫鈉加蒸餾水至100mL。

b） 配制1XPBS:量取40mL25XPB,加人8.5g孰化鈉，加蒸餾水至1000mL。

c） 用氫氧化衲或鹽酸調(diào)pH至7.2。

d） 滅菌或過濾。

e） PBS-經(jīng)使用，于4’C保存不超過3周。

附錄B

(資料性附錄)

高致病性禽流感病毒IVPI測定試驗

B.1試驗雞

6周齡SPF雞，10只。

B.2接種材料

感染雞胚的尿囊液，血凝價在1:16(24或4log2)以上.未混有任何細菌、霉菌、支原體或其他病毒。

B.3接種方法

將感染雞胚尿囊液用PBS1：10稀釋，以0.1mL/羽的劑量翅靜脈接種。每日觀察每只雞的發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察10d。

B.4記錄方法

根據(jù)每只雞的癥狀用數(shù)字方法毎天進行記錄：正常雞記為0,病雞記為1，重病雞記為2,死雞記為3。病雞和重病雞的判斷主要依據(jù)臨床癥狀表現(xiàn).一般而言，“病雞”表現(xiàn)有下述一種癥狀.而“重病雞”則表現(xiàn)下述多個癥狀.如呼吸癥狀、沉郁、腹瀉、雞冠和/或肉髯發(fā)紺、臉和/或頭部腫脹、神經(jīng)癥狀。列舉1個假設(shè)試驗來說明IVPI的計算方法,參見表B.1和公式(B.1)。

表B.1假設(shè)髙致病性禽流感病毒致病性試驗記錄結(jié)果

臨床癥狀

第1天

第2天

第3天

第4天

第5天第6天

第7天

第8天

第9天

第10天

分類總計

得分

正常(a=0)

10

5

3

3

2

1

0

0

0

0

24

0

病雞(6=1)

0

0

0

0

C

0

0

0

0

0

0

0

重病雞(c=2)

0

5

2

0

1

1

1

0

0

0

10

20

死亡(rf=3)

0

0

5

1

7

8

9

10

10

10

66

198

總計

一

—

—

—

—

100

218

注1:當IVPI值大于1.2時，判定分離株為髙致病性禽流感病毒(HPAIV)。

注2:本試驗中IVPI=(0+0+20+198)/100=2.18>1.2,因此，本試驗中的分離株為HPAIV.

B.5IVPI值計算

IVPI值計算參見公式(B.1):

#

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SaX0+S6Xl+xX2+2rfX3*VA1 —〒

式中：

2,-10d累計正常雞數(shù)；

——10d累計病雞數(shù)；

——10d累計重病雞數(shù)；

L——10d累計死雞數(shù)；

T—10d累計記錄10只雞的總次數(shù).即100。

B.6判定標準

為髙致病性禽流1

B.6.1當IVPI值大于為髙致病性禽流病

的序列分析，如果氨毒。

B.6.2氣IVPI值小H7亞型的禽流感病毒應(yīng)進行

基酸序列同其他髙^毒相似.被檢測的分離物應(yīng)被視為髙致

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附錄C

（資料性附錄）

血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法

C.1非特異性凝集因子的處理

有些禽類血清（如水餺、鴿）可能對雞紅細胞產(chǎn)生非特異性凝集，可先用待檢血清做HA試驗.如果待檢血清出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象.則說明有非特異凝集因子存在.宜用雞紅細胞對待檢血清進行吸附.具體方法為：毎0.5mL血消中加人0.025mL50%雞紅細胞，輕搖后靜置至少30min.800g離心2min~

5min,收集上清液（處理后的血清）。用上清液進行HI試驗時.需設(shè)處理陽性血清對照?；蛘呖捎门c待檢血清宿主來源相同的1%紅細胞懸液進行HA和HI試驗。

C.2非特異性抑制因子的處理

C.2.1胰酶一加熱一離碘酸鹽法

利用胰酶一加熱一髙碘酸鹽法處理非特異性抑制因子的操作如下：

a） 取0.3mL血淸.加0.15mL狹海溶液（8mg/mL：200mg的P-250胰酶溶解于25mL的0.01mol/L,pH值7.0?7.2的PBS中，混勻，過濾除歯.分裝并在一15C以下保存.保存期6個月）.混勻后，在56’C水浴滅活30min后冷卻至室溫。

b） 再加人0.9mL髙碘酸鉀（將230mgKIO4用0.01mol/L.pH值7.0-7.2的PBS定容至

100mL，過濾除謝后避光室溫保存.保存期1周），混合，室溫孵育15min。

c） 再加人0.9mL的丙三醇鹽溶液（1mL丙三醇加人99mL的0.01mol/L,pH值7.0-7.2的PBS中.混勻.過濾除菌.室溫保存），混合，室溫孵育15min。

d） 最后加人0.75mL生理鹽水.混勻.WC保存?zhèn)溆?處理后的血清最終為10倍稀釋的血清。

C.2.2受體破壞?（KDE:處理法

利用RDE處理法處理非特異性抑制因子的操作如下：

a） 取1體積血清（50ML），加4體積RDE（200mL），37_C水浴18h（過夜〉。

b） 再加人5體積（250ML）的1.5%濃度的擰檬酸鈉.混勻.置56’C水浴30min（以破壞殘余的RDE活性）。

c） 將1體積的50%的紅細胞加人到10體積RDE處理的血清中（50ML紅細胞+500ML血清），振蕩混勻后4_C放置1h,期間可輕輕搖勻懸浮紅細胞數(shù)次。

d） 1000g離心10min,小心吸取上層上清，用于檢測。處理后的血清最終為10倍稀釋的血清。

C.2.3處理非特異性抑制因子后血清HI試驗方法

處理后血清HI試驗方法如下：

a） 第2孔?第11孔加人0.025mLPBS.第12孔加人0.05mLPBS作為空內(nèi)對照。

b） 第1孔、第2孔加人處理后的血清0.025mL.第2孔血清與PBS充分混勻后吸0.025mL于第3孔.依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。第11孔為抗原對照。

c） 第1孔?第11孔均加人0.025mL4HAU抗原，在室溫（約20?（：）下靜S40min或4C

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GB/T18936—2020

60mino

d） 毎孔加人0.025mLl%（體積分數(shù)〉雞紅細胞懸液.震蕩混勻，在室溫（約20’C）下靜置40min或4-C60min,對照孔紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結(jié)果。

e） 結(jié)果判定。氣陰性對照血清抗體效價不髙于1:10,陽性對照血清抗體效價與巳知效價誤差不超過1個滴度時.試驗方可成立。以完全抑制4HAU抗原的最商血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI抗體效價。被檢血清HI抗體效價低于1|10判為陰性.不低于1:10判為陽性。

附錄D

（資料性附錄＞

禽流感病番RT-PCR試驗用引物

采用普通RT-PCR方法開展禽流感檢測.可根據(jù)檢測目的基因不同選擇引物（參見表D.1〉。表D.1禽流感病毒RT-PCR試驗可選擇的引物

引物名稱

引物序列

5'-~3'

長度

bp

擴増目的基因

M-229U

TTCTAACCGAGGTCGAAAC

229

M

M-229L

AAGCGTCTACGCTGCAGTCC

H5-372U

GGAATATGGTAACTGCAACACCA

372

H5

H5-372L

AACTGAGTGTTCATTTTGTCAATG

H7-501U

AATGCACARGGAGGAGGAACT

501

H7

H7-501L

TGAYGCCCCGAAGCTAAACCA

H9-273U

TGTGTCTTACGATGGGACAAGCA

273

H9

H9-273L

TTGACAAGAGGCCTTGGTCCTAT

N1-358U

ATTRAAATACAAYGGYATAATAAC

358

N1

N1-358L

GTCWCCGAAAACYCCACTGCA

N2-377U

GTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG

377

N2

N2-377L

GAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCA

N9-203U

ATAATGAAACAAACATCACCAA

203

N9

N9-2O3L

AGCATAGAACCTCCATTCATCT

注：W=(AT)，Y=(CT);R=(AG)。

GB/T18936—2020

附錄E

（資料性附錄）

RT-PCR反應(yīng)液配制

E.1RT-PCR反應(yīng)體系

毎個RT-PCR反應(yīng)體系包括的組分參見表E.l?

表E.1RT-PCR反應(yīng)液配方

組分

1個檢測體系的加入最

5X反S緩沖液

5.0

10mmol/LdNTP

0.5

15mmo/L氯化鎊

1.0

20pmo!上游引物

0.5

20pmo下游引物

0.5

AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ML)

0.5

TaqDNA聚合酶(5U/ML)

0.5

無核酶滅菌水

14.0

E.2無核酸曲水

將DEPC加入去離子水中至終濃度為0.1%,充分混合均勻后作用12h，分裝，（121士2VC髙壓滅菌30min,冷卻后冷藏備用。

附錄F

（資料性附錄）

實時熒光RT-PCR引物探針序列及反應(yīng)液配方

F.1引物和探針

采用實時熒光RT-PCR方法開展禽流感檢測.可根據(jù)檢測目的基因參見表F.1提供的序列合成引物和探針，純度為HPLC級.用RNase-Free滅菌水溶解并稀釋至終濃度10Mmol/L,—20"C保存?zhèn)溆?。表F.1禽流感病番實時熒光RT-PCR試驗可選擇的引物和探針

引物和探針名稱

序列

(5'-3')

M上游引物

GACCRATCCTGTCACCTCTGAC

M下游引物

AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA

M探針

TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG

H5上游引物

AGGGAGGATGGCAGGGAATG

H5下游引物

TCTTTGTCTGCAGCGTACCCACT

H5探針

ATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATG

H7上游引物

CTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCA

H7下游引物

AATTGCC：GATTGAGTGCTTTT

H7探針

CAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCT

N6上游引物

TGCAGGATGTTTGCTCTGAGTC

N6下游引物

CGAAATGGGCTCCTATCATGTAT

N6探針

ACA