考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白質(zhì)含量：分光光度使用

1、考馬斯亮藍法（考馬斯亮藍法（Bradford法）測定蛋法）測定蛋白質(zhì)含量：分光光度的使用白質(zhì)含量：分光光度的使用【實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康摹?1. 掌握考馬斯亮藍染色法定量測掌握考馬斯亮藍染色法定量測定蛋白質(zhì)的原理與方法。定蛋白質(zhì)的原理與方法。 2. 熟練分光光度計的使用和操作熟練分光光度計的使用和操作方法。方法。 【實驗原理實驗原理】 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G250測定蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍G250在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸收峰在收峰在465nm；當它與蛋白質(zhì)通過范；當它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合成復(fù)合物時變

2、為藍色，其德華鍵結(jié)合成復(fù)合物時變?yōu)樗{色，其最大吸收峰移至最大吸收峰移至595nm，而且消光系，而且消光系數(shù)更大。數(shù)更大。 在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) (11000g/ml）,蛋白質(zhì)染料復(fù)合物在蛋白質(zhì)染料復(fù)合物在595nm處的光吸收與蛋白處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。 蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G250的結(jié)合十分迅速，的結(jié)合十分迅速，約約2min即可反應(yīng)完全，其復(fù)合物在即可反應(yīng)完全，其復(fù)合物在1h內(nèi)保持穩(wěn)內(nèi)保持穩(wěn)定。由于蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系定。由于蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此大大

3、提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度（最低數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度（最低檢出量為檢出量為1g）。由于染色法簡單迅速，抗干擾）。由于染色法簡單迅速，抗干擾性強，靈敏度高，線性關(guān)系好，近年來在某些方性強，靈敏度高，線性關(guān)系好，近年來在某些方面有取代經(jīng)典的面有取代經(jīng)典的Lowry法的趨勢，是一種較好的法的趨勢，是一種較好的蛋白質(zhì)快速微量測定方法。蛋白質(zhì)快速微量測定方法?！酒鞑呐c試劑器材與試劑】（一）器材（一）器材 1. 可見光分光光度計可見光分光光度計 2. 刻度移液管刻度移液管 3. 移液槍移液槍 4. 新鮮小麥葉片或綠豆芽下胚軸等新鮮小麥葉片或綠豆芽下胚軸等（二）試劑（二）試劑 1. 0.9%生

4、理鹽水生理鹽水 2. 考馬斯亮藍試劑考馬斯亮藍試劑 3. 1000g /ml蛋白質(zhì)標準液蛋白質(zhì)標準液 定義定義: 分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術(shù)。收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術(shù)。 特點特點: 靈敏、精確、快速和簡便，在復(fù)雜組靈敏、精確、快速和簡便，在復(fù)雜組分系統(tǒng)中，不需要分離，即能檢測出其中所含的分系統(tǒng)中，不需要分離，即能檢測出其中所含的極少量物質(zhì)。極少量物質(zhì)。 應(yīng)用應(yīng)用: 生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法之生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一，廣泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定一，廣泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的

5、快速定量檢測。量檢測。 分光光度計的分類分光光度計的分類紅外分光光度計紅外分光光度計:可見光分光光度計可見光分光光度計:紫外分光光度計紫外分光光度計:測定波長范圍為測定波長范圍為大于大于760 nm的的紅外光區(qū)紅外光區(qū) 測定波長范圍為測定波長范圍為400 760 nm的的可見光區(qū)可見光區(qū)測定波長范圍為測定波長范圍為200400 nm的的紫外光區(qū)紫外光區(qū)可見光譜可見光譜可見光范圍內(nèi)波長和顏色的關(guān)系可見光范圍內(nèi)波長和顏色的關(guān)系分光光度計的基本結(jié)構(gòu)分光光度計的基本結(jié)構(gòu) 無論哪一類分光光度計都包括：光源、單無論哪一類分光光度計都包括：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光色器、吸收池、檢測器和

6、測量儀表。分光光度計各部件的次序如圖所示度計各部件的次序如圖所示: 入射光入射光強度強度 Io透射光透射光強度強度 I樣品池樣品池 檢測器檢測器及儀表及儀表單色器單色器光源光源光照射到物質(zhì)上，物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)決定光照射到物質(zhì)上，物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)決定哪些特定波長的光被吸收。這一現(xiàn)象符哪些特定波長的光被吸收。這一現(xiàn)象符合符合朗伯比耳定律。合符合朗伯比耳定律。入射光強度入射光強度 Io樣品濃度樣品濃度c光程光程 b透射光強度透射光強度 I當一束平行單色光當一束平行單色光(I0)照射有色溶液時，光的一部照射有色溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液分被吸收，一部分透過溶液(I)朗伯朗伯比爾定律比爾定律:

7、 A=lg(1/T)=Kbc A為吸光度為吸光度;T為透光度為透光度,是透射光強度比上入射光強度（是透射光強度比上入射光強度（I/I0);c為吸光物質(zhì)的濃度為吸光物質(zhì)的濃度; b為吸收層厚度為吸收層厚度(光程）光程）. 物理意義物理意義當一束平行單色光垂直通過某一吸光物質(zhì)時當一束平行單色光垂直通過某一吸光物質(zhì)時,其吸其吸光度光度A與吸光物質(zhì)的濃度與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度及吸收層厚度b成正比成正比. 測量條件選擇測量條件選擇（1）儀器預(yù)熱是保證儀器準確穩(wěn)定的重要步驟。）儀器預(yù)熱是保證儀器準確穩(wěn)定的重要步驟。（2）比色皿的清潔程度，直接影響實驗結(jié)果。）比色皿的清潔程度，直接影響實驗結(jié)果。比色

8、皿與分光光度計應(yīng)配套使用。比色皿與分光光度計應(yīng)配套使用。 比色皿內(nèi)盛比色皿內(nèi)盛液應(yīng)為其容量的液應(yīng)為其容量的2/3。（3）選擇適宜波長的入射光：由于物質(zhì)對光有）選擇適宜波長的入射光：由于物質(zhì)對光有選擇性吸收，為了使測定結(jié)果有較高的靈敏度，選擇性吸收，為了使測定結(jié)果有較高的靈敏度，必須選擇溶液最大吸收波長的入射光。必須選擇溶液最大吸收波長的入射光。（4）控制吸光度）控制吸光度A的準確的讀數(shù)范圍：吸光的準確的讀數(shù)范圍：吸光度控制在度控制在0.10.8讀數(shù)范圍內(nèi)時，測量的準確讀數(shù)范圍內(nèi)時，測量的準確度較高。度較高。（5）選擇參比溶液：參比溶液是用來調(diào)節(jié)儀）選擇參比溶液：參比溶液是用來調(diào)節(jié)儀器工作零點的

9、。無色樣品可用蒸餾水作參比器工作零點的。無色樣品可用蒸餾水作參比溶液；反之應(yīng)采用不加樣品（加顯色劑）的溶液；反之應(yīng)采用不加樣品（加顯色劑）的溶劑作參比溶液。溶劑作參比溶液。722型光柵分光光度計使用方法型光柵分光光度計使用方法100調(diào)波長旋鈕調(diào)波長旋鈕電源開關(guān)電源開關(guān)T/A切換旋鈕切換旋鈕消光零消光零0靈敏度靈敏度暗盒蓋比色皿拉桿顯示窗口1調(diào)整調(diào)整（1） 接通電源。接通電源。（2） 調(diào)波長調(diào)節(jié)器至所需波長。調(diào)波長調(diào)節(jié)器至所需波長。（3） 開啟電源開關(guān)，指示燈亮，選擇開關(guān)置開啟電源開關(guān)，指示燈亮，選擇開關(guān)置于于“T”，將靈敏度旋鈕調(diào)至，將靈敏度旋鈕調(diào)至”1”檔位，調(diào)節(jié)透檔位，調(diào)節(jié)透光率光率100

10、%T。預(yù)熱。預(yù)熱20min .預(yù)熱儀器應(yīng)在不測定時，將比色皿暗箱蓋打開，預(yù)熱儀器應(yīng)在不測定時，將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。使光路切斷。2校正校正（1）打開吸收池暗室蓋，調(diào)節(jié)）打開吸收池暗室蓋，調(diào)節(jié)0% T旋鈕，旋鈕，使數(shù)字顯示為使數(shù)字顯示為“00.0”，將參比溶液置于光路，將參比溶液置于光路，蓋上吸收池蓋，調(diào)節(jié)透光率蓋上吸收池蓋，調(diào)節(jié)透光率100% T 旋鈕，旋鈕，數(shù)字顯示為數(shù)字顯示為“100.0”。（2）如果顯示不到）如果顯示不到“100”，則可適當增加電，則可適當增加電流放大器靈敏度檔數(shù)，當改變靈敏度流放大器靈敏度檔數(shù)，當改變靈敏度 后必須重后必須重新校正新校正“0”和和“100”。（

11、3）按（）按（1）連續(xù)幾次調(diào)整）連續(xù)幾次調(diào)整“00.0”和和“100.0”后，將選擇開關(guān)置于后，將選擇開關(guān)置于“A”，調(diào)節(jié)吸光，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零旋鈕，使數(shù)字顯示為度調(diào)零旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”，即可進行，即可進行吸光度吸光度A的測量的測量.3測定測定 將待測樣品的將待測樣品的比色皿放入相應(yīng)的樣品穴，輕比色皿放入相應(yīng)的樣品穴，輕輕拉動比色皿座架拉桿，使待測溶液進入光路，輕拉動比色皿座架拉桿，使待測溶液進入光路，測定。測定。顯示值（小數(shù)后三位數(shù)）即為待測樣品的顯示值（小數(shù)后三位數(shù)）即為待測樣品的吸光度值。吸光度值。 讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。4. 關(guān)機關(guān)機 實驗完畢，

12、切斷電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至實驗完畢，切斷電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始位置。將比色皿取出洗凈，晾干，存于專用初始位置。將比色皿取出洗凈，晾干，存于專用盒內(nèi)，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。盒內(nèi)，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。【注意事項注意事項】1）為了防止光電管疲勞不測定時須將比色皿暗箱蓋）為了防止光電管疲勞不測定時須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。打開，使光路切斷。2）比色皿的使用方法：）比色皿的使用方法：拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面。要碰比色皿的透光面。每次做完實驗時，應(yīng)立即洗凈比色皿。每次做完實驗時，應(yīng)立即洗

13、凈比色皿。 清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。必要時可用鹽酸必要時可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（乙醇混合洗滌液（1 2）浸泡片刻，再）浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，。用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，。不能用毛刷清洗。不能用毛刷清洗。比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干，以比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干，以保護透光面。保護透光面。 3）在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到）在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。濃的順序測定，以減小測量誤差。

14、【實驗步驟實驗步驟】（一）、標準曲線的制作（一）、標準曲線的制作1. 取試管取試管6支，按下表進行編號并加入試劑。支，按下表進行編號并加入試劑。試試 劑劑試管編號試管編號1234561000g/ml標準蛋白溶液標準蛋白溶液（l）0204060801000.9%生理鹽水（生理鹽水（l）100806040200蛋白質(zhì)含量（蛋白質(zhì)含量（g/0.1ml）0204060801002. 分別向上述各管加入分別向上述各管加入3.0ml考馬斯亮藍考馬斯亮藍G250試劑試劑, 充分振蕩混合，放置充分振蕩混合，放置5min后，后，測定測定A595值。值。3. 以以A595為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線標，繪制標準曲線。（二）（二） 樣品提取液中蛋白質(zhì)含量的測定樣品提取液中蛋白質(zhì)含量的測定 蛋白質(zhì)提取蛋白質(zhì)提取: 稱取樣品約稱取樣品約200mg，加蒸餾水，加蒸餾水5ml，勻漿，勻漿，4000rpm離心離心10min， 取上清取上清液。殘渣用液。殘渣用2.0ml蒸餾水懸浮，蒸餾水懸浮，4000rpm離心離心10min，合并上清液并定，合并上清液并定容至容至10ml。2. 蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定: 取取3支試管，各吸取樣品提取液支試管，各吸取樣品提取液0.1ml，加入考馬斯亮藍加入考馬斯亮藍G250試劑試劑3.0ml，充分振蕩，充分振