北大醫(yī)學(xué)部激光掃描共焦顯微鏡與流式細(xì)胞總結(jié)綜述

1、激光掃描共焦顯微鏡與流式細(xì)胞總結(jié)共焦部分一、根據(jù)激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocal)的工作原理，說(shuō)明：1為什么Confocal能夠逐層采集熒光樣品的一系列高清晰光學(xué)切片？Con focal禾U用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn) 探測(cè)，來(lái)自光源的光通過(guò)照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔內(nèi)，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即為共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即為共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像， 由光路中的掃描系

2、統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上， 隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。2、如何實(shí)現(xiàn)時(shí)間動(dòng)態(tài)程序監(jiān)測(cè)？將樣品固定在同一個(gè)觀察視野， 利用動(dòng)態(tài)時(shí)間程序軟件， 按照一定的時(shí)間間隔， 自動(dòng)采 集某時(shí)間段內(nèi)該視野的一系列圖像， 并定量測(cè)定相關(guān)參數(shù)的隨著時(shí)間的變化。 特點(diǎn)：快速跟 蹤毫秒級(jí)變化。具體操作如下：1) 在顯微鏡下找到活細(xì)胞；2) 調(diào)節(jié)掃描狀態(tài)，獲得滿意圖像；3) 把 Mode 改成 XYT ;4) 設(shè)定加藥時(shí)間，加藥后觀察時(shí)間；5) 開(kāi)始程序，自動(dòng)完成程序。二、如

3、何利用Confocal實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化？(1) 將細(xì)胞種在共焦小皿中，(2) 將用FLuo3等銀光染料標(biāo)記好樣本，在顯微鏡下找到合適的細(xì)胞。(3) 確定采集圖像的條件，包括針孔的大小、光電倍增管的增益、濾片系統(tǒng)的選擇、掃描速度和掃描密度等，掃描速度和掃描密度要精心選擇，它直接影響采樣頻率， 即會(huì)影響測(cè)量結(jié)果。(4) 根據(jù)細(xì)胞種類和所加的藥物等實(shí)驗(yàn)要求，確定采集頻率，即采集每一幅圖像的間隔時(shí)間。當(dāng)需要采樣頻率較高時(shí)， 采集每一幅圖像的時(shí)間間隔可設(shè)定為零， 此時(shí)采樣頻率的快慢 取決于掃描速度和掃描密度。如果仍然不能滿足Ca2+快速變化的要求，應(yīng)加快掃描速度和 減少掃描密度，或采用線掃描。然

4、后根據(jù)掃描的總時(shí)程，確定共需采集多少幅圖像。(5) 開(kāi)始采集圖像，加藥前采集1分鐘作為靜息水平對(duì)照，加藥后繼續(xù)掃描。程序設(shè)定加 藥的等待時(shí)間。(6) 采集圖像之后或采集之前，勾畫(huà)感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)某個(gè)區(qū)域(核周、胞漿、胞核 或突起等)，計(jì)算機(jī)會(huì)描繪出時(shí)間-熒光強(qiáng)度曲線。三、影響所采集圖像熒光強(qiáng)度的參數(shù)主要有哪些？1、 物鏡性能：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑、分辨率、景深-焦點(diǎn)深度、鏡像高度、物鏡工作距離、 視野范圍；2、激發(fā)光波長(zhǎng)/強(qiáng)度；3、發(fā)射波長(zhǎng)范圍/強(qiáng)度；4、檢測(cè)器靈敏度；5、Pinhole 大??；6、聚焦程度；7、其他（可以不答）：甘油、蓋片數(shù)等。四、在 Hoechst 33258、DAPI、

5、PI （ propidium iodide，碘化丙叮）、AO （acridine orange,吖啶橙）這四種核酸探針中（1） 要特意地標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的DNA，應(yīng)該選擇哪種核酸探針？Hoechst 33258 （定位于細(xì)胞核）、A0（2） 若要特意地標(biāo)記固定（死）的細(xì)胞內(nèi)的DNA可選擇哪種核酸探針？DAPI （半通透細(xì)胞，定位于細(xì)胞核）、PI顯微鏡部分1、物鏡的數(shù)值孔徑及意義。（1 ）物鏡的數(shù)值孔徑：是物鏡與樣品之間介質(zhì)的折射率（n）和1/2孔徑角（u）的正弦值的乘積。NA=n x Sin u（2）意義：數(shù)值孔徑是物鏡最重要的參數(shù)之一，它直接影響物鏡的分辨率和物鏡的鏡像亮 度。NA越大越好。2、

6、顯微鏡有幾種性能指標(biāo)？ 了解各種性能指標(biāo)的意義。（1）數(shù)值孔徑：物鏡的最重要的參數(shù)之一，直接影響物鏡的分辨率和物鏡的鏡像亮度。分辨率：區(qū)分物平面兩個(gè)點(diǎn)間最小距離為分辨距離即分辨率。它代表分辨微細(xì)結(jié)構(gòu)的本 領(lǐng)。（3）放大率：放大率等于物鏡放大率乘以目鏡放大率。（4）景深-焦點(diǎn)深度：景深表示清晰的像平面所能對(duì)應(yīng)物平面前后空間的深度（或指焦點(diǎn)與樣品上某點(diǎn)相一致時(shí)， 能看清這一點(diǎn)及其上下兩側(cè)的結(jié)構(gòu)）。那么，清晰部分的厚度即為景深，也稱為焦點(diǎn)深度。（5）鏡像亮度：顯微圖像亮度。（6）物鏡工作距離：物鏡工作距離越長(zhǎng)， NA越小。（7）視野范圍：鏡下看到的目鏡光闌所圍的圓，其直徑為視野寬度。3、 按校正像差

7、分類，物鏡有幾種等級(jí)標(biāo)識(shí)？每一種標(biāo)識(shí)的意義.（1）消色差物鏡：校正了球差，彗差和二種色光的位置色差。物鏡外殼沒(méi)有特殊標(biāo)記。（2）平場(chǎng)消色差物鏡：在消色誤差鏡的基礎(chǔ)上還矯正了像散和場(chǎng)曲，像面平坦。物鏡外殼 標(biāo)有|PL或N PLAN字樣。（3）半平場(chǎng)消色誤差鏡：清晰范圍介于消色誤差鏡和平場(chǎng)消色誤差鏡之間，但明顯優(yōu)于消色誤差經(jīng)，接近平場(chǎng)消色誤差鏡。外殼刻有C PLAN.（4）平場(chǎng)半復(fù)消色誤差鏡：色差的校正程度介于平場(chǎng)消色誤差鏡與平場(chǎng)復(fù)消色誤差鏡之間?？逃蠵L FLUOTAR,此類物鏡通常作為觀察熒光的物鏡來(lái)使用。（5）平場(chǎng)復(fù)消色誤差:它在平場(chǎng)消色誤差鏡的基礎(chǔ)上，還對(duì)第三種色光校正了位置色差, 這種物

8、鏡成像最佳，數(shù)值孔徑也較同倍率物鏡大。外殼刻有PL APO4、熒光顯微鏡光路中的濾片有幾種？各自在熒光光路中的作用。（1）激發(fā)濾片：位于光源和物鏡之間，作用是選擇適于特定熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)。（2）二色光分光鏡：它的放置方向與激發(fā)光的方向呈 45，位于激發(fā)光濾片和發(fā)射光濾片之間，具有特征值 M （ Leica顯微鏡用RKP表示）。波長(zhǎng)短于M的光被反射，波長(zhǎng)大于 M的光可 通過(guò)，也就是說(shuō)它對(duì)激發(fā)光具有高反射率， 而對(duì)激發(fā)出的熒光具有高透過(guò)率， 它是分離激發(fā) 光（短波長(zhǎng)）和發(fā)射熒光（長(zhǎng)波長(zhǎng)）的一個(gè)重要組件。（3）阻擋濾片：位于目鏡之前。其作用是進(jìn)一步使發(fā)射熒光與激發(fā)光分離，以獲得更純的 發(fā)射熒光。圖

9、像部分模擬圖像與數(shù)字圖像的區(qū)別，數(shù)字圖像的特點(diǎn)。（理解即可）（1 ）模擬圖像a. 定義：圖像是用各種觀測(cè)系統(tǒng)以不同形式和手段觀測(cè)客觀世界而獲得的，可以直接或間接作用于人眼并進(jìn)而產(chǎn)生視知覺(jué)的實(shí)體。b. 存在形式：常見(jiàn)的各種照片、圖片、海報(bào)、廣告畫(huà)等均屬模擬圖像 醫(yī)學(xué)中的圖像包括組織胚胎學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、放射學(xué)、超聲、X線、CT磁共振、PET電子顯微術(shù)和熱像等圖像。如果把圖形（如心電圖、腦電圖等）都包括進(jìn)去，則幾乎醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷就離不開(kāi)圖像（形）了。（這個(gè)記住幾個(gè)就成）c. 函數(shù)表示：f （x,y, 入，t）x,y表示圖像在某點(diǎn)的坐標(biāo)f （x,y）表示圖像在（x,y）

10、點(diǎn)的強(qiáng)度（亮度）（2 ）數(shù)字圖像a. 定義：將模擬圖像變換成為計(jì)算機(jī)能夠處理的數(shù)字矩陣或數(shù)組被稱為數(shù)字圖像。b. 存在形式：必須以數(shù)字格式存儲(chǔ)c. 函數(shù)表示：fdl)+f(UN-D ICU9KIKD-Ml廚一tfu)-It戀章在3直的黃屋疇數(shù)字圖像的特點(diǎn)：便于計(jì)算機(jī)處理分析；圖像損失低；抽象性強(qiáng)。（不確定）2.圖像處理與分析的主要內(nèi)容：清晰圖像 改善圖像的質(zhì)量-“圖像t圖像” 模糊圖像經(jīng)圖像增強(qiáng)、消除噪聲 使圖像的質(zhì)量得到改善圖像處理：從圖像到圖像的變換。以完善圖像的視覺(jué)效果為目標(biāo) 描述圖像的目標(biāo)特征-“圖像T描述”目標(biāo)：把對(duì)圖像中感興趣的某些區(qū)域稱為目標(biāo)。圖像經(jīng)圖像分割獲取目標(biāo)對(duì)圖像中并進(jìn)行

11、特征參數(shù)的測(cè)量某些特征的描述圖像分析：從圖像到特征描述的變換。著重對(duì)圖像中感興趣的目標(biāo)進(jìn)行特征提取 三維結(jié)構(gòu)的重建-“描述T圖像”對(duì)一個(gè)立體結(jié)構(gòu)按一定的方向，一定的間隔，連續(xù)切出二維斷面，通過(guò)對(duì)二維圖像的描述， 再返推出三維圖像。CT就是圖像重建處理的典型應(yīng)用實(shí)例3圖像分析系統(tǒng)硬件組成一主要包括四個(gè)部分： 輸入系統(tǒng)主要包括：顯微鏡宏觀器CCD攝像頭解剖鏡（小鼠的椎骨、牙）CCD（ Charge coupled Device）電荷耦合器件CCD可以將照射在其上的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的電信號(hào)。 圖像采集系統(tǒng)-圖像采集卡 計(jì)算機(jī) 輸出系統(tǒng)：主要包括：顯示器、打印機(jī)、顯微照相、軟盤(pán)、硬盤(pán)、光盤(pán)、U盤(pán)等4.

12、 圖像數(shù)字化原理主要包括什么？如何計(jì)算圖象的大小？（1 ）圖像數(shù)字化就是指把一幅灰度隨空間位置作連續(xù)變化的圖像變換成一幅離散的數(shù)字圖 像的過(guò)程。包括兩個(gè)方面：空間采樣、灰度量化空間采樣的定義：把一幅連續(xù)圖像在空間上用M*N個(gè)樣本點(diǎn)表示的方法稱為空間采樣?；叶攘炕x：將灰度從黑到白分成若干等級(jí)，這種方法稱為灰度量化。（2 ）不知道啊 是不是就是 M*N?5. 掌握霍夫曼（Hufman）編碼（一定要掌握）1）基本思想：通過(guò)減少編碼冗余來(lái)達(dá)到壓縮的目的。統(tǒng)計(jì)符號(hào)的出現(xiàn)概率，建立概率統(tǒng)計(jì)表.將在圖像中出現(xiàn)頻度大的像素值 ，給一個(gè)比較短的編碼，將出現(xiàn)頻度小的像數(shù)值，給一個(gè)比較 長(zhǎng)的編碼2）步驟：按照概

13、率從大到小排列?將兩個(gè)最小概率相加，形成一個(gè)新的概率集合?再將它們按照大小排列，依此方法做下去?最后縮減到兩個(gè)概率時(shí)就停止?從最后兩個(gè)概率開(kāi)始逐步向前進(jìn)行編碼，如對(duì)概率大的賦予碼元0,對(duì)概率小的賦予碼元1。注：如遇等概率時(shí)，可任意排列例題：信號(hào)源 s=s1,s2, S3, s4, s5, s6，其概率分布為 p1=0.4 p2=0.3 p3=0.1 p4=0.1p5=0.06 p6=0.04 ,求最佳 Huffman 碼沒(méi)看懂碼字：S1=1 S2 =00、S3=011、S4 =0100 S5=01010、S6 =01011碼長(zhǎng)：S1 =1、S2 =2、S3 =3、S4=4S5=5、S6 =5平

14、均碼長(zhǎng)=各自碼長(zhǎng) *概率的和=1*0.4+2*0.3+3*0.1+4*0.1+5*0.06+5*0.04=2.20(bit)Si W ：6了解灰度直方圖、灰度變換、直方圖均衡化、圖像的平滑、圖像的銳化(了 解就好了，老師說(shuō)不用背)(1) 定義：用橫坐標(biāo)表示灰度級(jí)，縱坐標(biāo)表示圖像中該灰度級(jí)出現(xiàn)的個(gè)數(shù)(像素個(gè)數(shù))。即對(duì)一幅數(shù)字圖像進(jìn)行各灰度級(jí)像素?cái)?shù)的統(tǒng)計(jì)，就可以得出圖像的灰度直方圖。性質(zhì)：i直方圖實(shí)際是一幅圖像中各個(gè)像素灰度值出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，它僅僅反映了圖像中不同灰度值出現(xiàn)的次數(shù)，但是不能反映某一灰度值像素所在圖像中的位置。 (所有的空間信 息全部丟失)ii圖像與直方圖之間存在著多對(duì)一的映射關(guān)

15、系。任意一幅圖像，能夠唯一求出一幅與之對(duì)應(yīng)直方圖，但是不同的圖像，可能會(huì)有相同的直方圖。iii一幅圖像各個(gè)子區(qū)的直方圖之和應(yīng)當(dāng)?shù)扔趯?duì)應(yīng)全圖的直方圖。(2) 灰度變換：灰度變換是將一個(gè)灰度區(qū)間映射到另一個(gè)灰度區(qū)間的變換?；叶茸儞Q可改變圖像動(dòng)態(tài)范圍，圖像對(duì)比度擴(kuò)展，顯示效果更加清晰，是圖像增強(qiáng)的重要手段。包括線性變換、非線性變換。i 圖像求反 g(x,y)=255-f(x,y)ii改變圖像動(dòng)態(tài)范圍將感興趣的灰度范圍線性擴(kuò)展，相對(duì)抑制不感興趣的灰度區(qū)域i對(duì)數(shù)變換擴(kuò)展低灰度區(qū)，壓縮高灰度區(qū)iv指數(shù)變換擴(kuò)展高灰度區(qū)，壓縮低灰度區(qū)(3 )直方圖均衡化：對(duì)在圖像中像素個(gè)數(shù)多的灰度級(jí)進(jìn)行展寬，而對(duì)像素個(gè)數(shù)少的

16、灰度級(jí) 進(jìn)行縮減，從而達(dá)到圖像清晰的目的。直方圖均衡化就是把給定圖像的直方圖分布改變成“均勻”分布直方圖分布。(4) 圖像的平滑：抑制或消除圖像噪聲而改善圖像質(zhì)量的過(guò)程稱為對(duì)圖像的平滑過(guò)程。圖像噪聲是圖像在采集或傳輸時(shí)所受到的隨機(jī)干擾信號(hào)。反映在圖像上，噪聲使原本均勻和連續(xù)變化的灰度突然變大或減小，形成一些虛假的物體邊緣或輪廓。i中值濾波 ii鄰域平均法 iii多幅圖像疊加法(5) 圖像的銳化：加強(qiáng)圖像中景物的細(xì)節(jié)邊緣和輪廓(位于灰度突變的地方，可用微積分運(yùn)算銳化圖像）7、掌握中值濾波定義及實(shí)現(xiàn)過(guò)程。（重點(diǎn)，得會(huì)算一維的中值濾波）【答】：I. 中值濾波法是一種非線性平滑技術(shù)，指把圖像中一點(diǎn)的灰

17、度值用該點(diǎn)的一個(gè)鄰域中各點(diǎn) 值的中值代替，既可以去除噪聲又可以有效地保護(hù)圖像的邊緣。II. 經(jīng)典的中值濾波算法實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下：第一步：選擇一個(gè)（2N+1 ） * （2N+1 ）的窗口（通常為3*3或5*5 ），并用該窗口沿圖像數(shù) 據(jù)進(jìn)行或列方向的移動(dòng)；第二步：每次移動(dòng)后，對(duì)窗口內(nèi)的像素灰度值進(jìn)行排序；第三步：通過(guò)排序得到的中值代替窗口內(nèi)中心位置的原始像素灰度值&圖像分割定義。了解二值圖像的膨脹、腐蝕（二值圖像運(yùn)算）；與、或、異或（二值圖像的邏輯運(yùn)算）?！敬稹浚篒. 圖像分割是指把圖像分成各具特性的區(qū)域并提取出感興趣目標(biāo)的技術(shù)和過(guò)程。（圖像分割結(jié)果直接影響進(jìn)行的圖像分析的質(zhì)量，常用方法為閾值法。）

18、II. （二值圖像是指通過(guò)設(shè)定某個(gè)閾值，把具有灰度級(jí)的圖像變成只有兩個(gè)灰度級(jí)的黑白圖 像。）膨脹：使二值圖像擴(kuò)大（方法：用結(jié)構(gòu)元素掃描圖像的每一個(gè)像素并與其覆蓋的二值圖像做與”操作，如果都為0，結(jié)果圖像該像素為0,否則為1。）腐蝕：使二值圖像減?。ǚ椒ǎ河媒Y(jié)構(gòu)元素掃描圖像的每一個(gè)像素并與其覆蓋的二值圖像做與”操作，如果都為1,結(jié)果圖像該像素為1,否則為0。）與（AND）運(yùn)算的定義g（x,y） = f（x,y）h（x,y）/只有2個(gè)像素都是1時(shí)，“與”運(yùn)算的結(jié)果才是1?；颍∣R 運(yùn)算的定義 g（x,y） = f（x,y） v h（x,y）/當(dāng)2個(gè)像素之一為1時(shí)或同時(shí)為1時(shí)，“或”運(yùn)算的結(jié)果都為1

19、。異或（XOR運(yùn)算的定義g（x,y） = f（x,y）- h（x,y）/當(dāng)2個(gè)像素之一（但不同時(shí)）為 1 時(shí)結(jié)果為1,其它情況下結(jié)果為0。9平均光密度參數(shù)的定義及物理意義是被測(cè)個(gè)體的界面內(nèi)各象素光密度的算術(shù)平均，可反映組織細(xì)胞被染色的深淺。OD=lg1/T=lgl 0/l1=lgGrey/Grey i10. 圖像中所帶標(biāo)尺的意義。（這個(gè)不太確定該怎么答）即每個(gè)像素所代表的實(shí)際長(zhǎng)度，是人為地將像點(diǎn)長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)化以衡量比較其大小的一種有效工具。（我胡謅的）11光密度測(cè)量分析中應(yīng)該注意的問(wèn)題是什么？在光密度定量分析過(guò)程中，影響其定量測(cè)定的原因有制片原因、圖像獲取、圖像分析三個(gè)方 面，故應(yīng)該注意的問(wèn)題也應(yīng)

20、運(yùn)而生：制片原因：.良好的取材，及時(shí)的固定。保證組織脫水時(shí)間，按時(shí)、按濃度脫水。避免載玻片和蓋玻片對(duì)背景光強(qiáng)度的影響，切片厚度要求均勻一致?？刂坪每乖迯?fù)的溫度和時(shí)間。選用質(zhì)優(yōu)的特異抗體。選用結(jié)果穩(wěn)定的顯色方法，控制顯色時(shí)間。用于定量的樣本，不要復(fù)染。圖像獲取：顯微圖像分析儀在測(cè)量被測(cè)結(jié)構(gòu)的光密度時(shí)，對(duì)光的條件要求十分嚴(yán)格，因此圖像獲取時(shí)應(yīng)注意：.保持光路的穩(wěn)定：光源、顯微鏡內(nèi)部元器件、CCD等儀器參數(shù)一致：放大倍數(shù)、孔徑光闌、視場(chǎng)光闌、曝光時(shí)間、圖像大小等消除顯微鏡視場(chǎng)光強(qiáng)度分布的不均勻一陰影校正為確保測(cè)量條件的一致：測(cè)量空白本底的灰度值要保持一致樣品部位的選擇：選擇切片厚度均勻、無(wú)刀痕、皺

21、褶、破碎、壞死等而且染色一致的區(qū)域拍照?qǐng)D像的存儲(chǔ)格式：存儲(chǔ)為T(mén)IFF格式圖像分析：扣除背景.陽(yáng)性標(biāo)記區(qū)域的選擇面積的選擇12從功能出發(fā)闡述圖像分析儀的作用。圖像分析儀主要功能體現(xiàn)在圖像處理、物體幾何特征參數(shù)的測(cè)量及光密度參數(shù)的測(cè)量三方面，故其應(yīng)用也由此展開(kāi)，具體如下：基于圖像處理功能 的應(yīng)用：1）圖像質(zhì)量的改善 一一CT、NMR、電鏡：主要指對(duì)醫(yī)學(xué)或生物成像的處理與編輯，提高圖像的反差、清晰度，對(duì)圖像進(jìn)行必的修飾。Photoshop軟件2）圖像的存檔與檢索一一圖像數(shù)據(jù)庫(kù)的管理3）遠(yuǎn)程圖像的傳輸一一遠(yuǎn)程診斷基于物體幾何特征參數(shù) 的測(cè)量功能的應(yīng)用：宏觀：實(shí)物（牙、胚胎、心肌缺血面積、腦缺血面積、血

22、管內(nèi)膜增生、）微觀：組織切片、電鏡照片（神經(jīng)元突起的長(zhǎng)度、細(xì)胞或細(xì)胞核面積、核質(zhì)比、新生骨 血管密度、細(xì)胞計(jì)數(shù)等）光密度參數(shù)的測(cè)量組織化學(xué)定量：.核酸定量：Feulgen法特異對(duì)DNA染色甲基綠一派若寧法特異對(duì) DNA和RNA染色，DNA為藍(lán)綠色，RNA為紅色?？偟鞍锥浚嚎捡R斯亮蘭，萘酚黃s組蛋白：固綠多糖和糖原：PAS （過(guò)碘酸雪夫）反應(yīng).脂肪：油紅0.酶類定量：堿性磷酸酶、酸性磷酸酶免疫酶組化定量：某種特定蛋白的定量，酶顯色。原位雜交： 酶顯色分子生物學(xué)影像定量 ：PCR、Western、Northern、Southern （專用凝膠成像系統(tǒng)）流式細(xì)胞術(shù)部分1、什么是流式細(xì)胞技術(shù)？ FC

23、M特點(diǎn)是什么？流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM ）是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速流動(dòng)狀態(tài)中的單 細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)待定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。FCM特點(diǎn)：流式細(xì)胞技術(shù)最大特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助， 從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純 化分選。其特點(diǎn)可歸結(jié)為：（1）研究對(duì)象：生物顆粒，各種細(xì)胞、細(xì)胞器，微生物及人工合成微球等。（2 ）分析速度：快速，最高達(dá)上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/秒。（3）同時(shí)測(cè)定多個(gè)參數(shù)，研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量。（4）精度高，準(zhǔn)確性好。2、流式細(xì)

24、胞儀（分選型）內(nèi)部結(jié)構(gòu)包括哪些系統(tǒng)？其重要部件和作用是什么？ 流式細(xì)胞儀主要結(jié)構(gòu)：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分選系統(tǒng)。（1）液流系統(tǒng)聚焦細(xì)胞以供檢測(cè)流動(dòng)室液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（壓力泵）為待檢液體流動(dòng)提供動(dòng)力（2）光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)和收集光信號(hào)激發(fā)光源弧光燈、激光器光學(xué)濾片選擇性的通過(guò)特定波長(zhǎng)的光光信號(hào)收集和分離系統(tǒng)（3）電子系統(tǒng)將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并使其數(shù)字化以供計(jì)算機(jī)分析。光電轉(zhuǎn)換器光電二極管：光敏度低，檢測(cè)強(qiáng)信號(hào)（FCS）光電倍增管：放大電信號(hào)，光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（SSC、FL1、FL2-）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集、分析（4）分選系統(tǒng)將目的細(xì)胞群分選到收集管中3、LP500、SP500、B

25、P500/50三種濾光片的含義是什么？A : LP500 長(zhǎng)通500,表示波長(zhǎng)大于 500nm的光都能通過(guò)SP500短通500，表示波長(zhǎng)小于 500nm的光都能通過(guò)BP500/500帶通500/50，表示濾片只允許波長(zhǎng)在500nm前后總共50nm的光譜帶的光線通過(guò)，又可以寫(xiě)成BP500 25或者BP4755254、光電轉(zhuǎn)換器的作用是什么？包括哪兩種探測(cè)器？接受哪些信號(hào)?A :光電傳感器的作用是將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。包括1）光電二極管：其光靈敏度低，接受強(qiáng)信號(hào)（FSC）; 2）光電倍增管：放大光信號(hào)，光靈敏度高，用于接收弱信號(hào)（SSC、FL1、FL2、FL3、FL4）5流式細(xì)胞儀能檢測(cè)的信號(hào)有那

26、兩大類？分別舉例說(shuō)明主要包括散射光信號(hào)和熒光信號(hào)。（1）散射光信號(hào)反映細(xì)胞的物理或固有參數(shù)，包括前向散射光（FSC）,又叫小角散射光1 6，反映細(xì)胞的大小；側(cè)向散射光（SSC），又稱為90散射光，代表細(xì)胞的粒度和精細(xì)的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)包膜，包質(zhì)和核膜的變化很敏感。（2 ）熒光信號(hào)，分為自發(fā)熒光和特異熒光。自發(fā)熒光是細(xì)胞內(nèi)部有不需要經(jīng)過(guò)染色，經(jīng)過(guò) 光照射可以產(chǎn)生熒光的分子，這類分子經(jīng)過(guò)照射產(chǎn)生的熒光。特異熒光指細(xì)胞經(jīng)過(guò)熒 光染料的標(biāo)記，在激光的照射下產(chǎn)生的熒光，這樣的熒光強(qiáng)度較弱，波長(zhǎng)也較照射的 激光不同。如fluo-2，fluo-36什么叫熒光信號(hào)的線性測(cè)量與對(duì)數(shù)測(cè)量？分別舉例說(shuō)明答：輸入信號(hào)和輸

27、出信號(hào)成線性放大關(guān)系的稱為線性放大測(cè)量。主要用于，DNA,RNA和總蛋白的測(cè)量。輸入信號(hào)和輸出信號(hào)成對(duì)數(shù)放大關(guān)系的稱為對(duì)數(shù)放大測(cè)量。主要用于，細(xì)胞膜表面蛋白的測(cè)量。7什么叫光譜交叉？如何做熒光之間的補(bǔ)償？答：發(fā)射光譜的重疊對(duì)結(jié)果分析帶來(lái)的干擾稱為光譜交叉。先將所有的補(bǔ)償和電壓調(diào)節(jié)為零；用同型對(duì)照或者陰性對(duì)照調(diào)節(jié)電壓，使陰性群位 于左下角；用單陽(yáng)性的管調(diào)節(jié)相鄰熒光之間的補(bǔ)償。8試舉FCM常用熒光染料？分別被哪些激光器激發(fā)?FCM常用熒光染料488虹色PRC5PeKP遠(yuǎn)紅FtrC P-Cy5-S1紅外i陀6 7KA* 光虹色APTMffBna633紅炸APC-Cy7FlurvPacirif Blu

28、eiiiMI1 19如何使用BD的流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集？基本程序是什么？3個(gè)常用軟件及各自功能？FCM數(shù)據(jù)采集基本粋序：外機(jī)一光舞校正一模板一篷件優(yōu)化一采如數(shù)據(jù)訂江;L”頂：1.前先鍛門(mén)”一掏在堀胞分布圖中指定一個(gè)范圍或一片區(qū)域，對(duì)直中的細(xì)幗進(jìn)音單事數(shù)或雋參數(shù)分析.也血吹：一股對(duì)目的細(xì)胞收集1萬(wàn)以上配茯取衆(zhòng)件優(yōu)化:用陰性管和單陽(yáng)管調(diào)電壓、域值(1) FACSComp自動(dòng)調(diào)整儀器設(shè)置(2) CellQuest完成儀器設(shè)置 數(shù)據(jù)獲取 統(tǒng)計(jì)分析等全能工具(3) ModFit DNA周期倍體凋亡的自動(dòng)或手動(dòng)分析。10、答：參么叫參數(shù)？單參數(shù)和雙參數(shù)時(shí)可出現(xiàn)什么樣的圖像？數(shù)(不太確定，自己概括的)：可

29、測(cè)定的細(xì)胞參數(shù)包括核算分析、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等，同時(shí)測(cè)定多個(gè)參數(shù)是流式細(xì)胞技術(shù)(FCM )的特點(diǎn)之一。單參數(shù)：?jiǎn)螀?shù)可出現(xiàn)單參數(shù)直方圖，雙參數(shù)可出現(xiàn)：二維( Dot Plot)、等高線圖(Con tourPlot)、二維密度圖(Density Plot)、假三維圖(Pseudo 3D Plot)。11、 什么叫DNA指數(shù)（DI）?什么叫增值指數(shù)（PI） ?含義是什么？答：DNA指數(shù)：樣本 G0/G1峰平均道數(shù)和正常 2倍體G0/G1峰的比值。 指數(shù)：增殖細(xì)胞 占總周期細(xì)胞的比例。12、DNA分析時(shí)主要影響因素是什么？1分辨率（CV）:儀器因素：液流、光路調(diào)試、光學(xué)元件人為因素：樣本制備過(guò)程均導(dǎo)致

30、CV變化。DNA直方圖中CV越小越 好，新鮮標(biāo)本 CV好于石蠟標(biāo)本，一般新鮮 CV 3,石蠟 8時(shí)，不再合適做 S期評(píng)估.2線性度：DNA分析中G2/M期道數(shù)應(yīng)該是 G0/G1期的2倍，若G2/M期 與G0/G1期的比 值不在1.95-2.05范圍，放大器的線性度需要檢查調(diào)節(jié)3碎片：較多碎片干擾 S期計(jì)算4.細(xì)胞雙粘體：通過(guò)雙粘體辨別模式DDM （ Doublet Discrimination Module ）來(lái)區(qū)分13、什么是雙粘體辨別模式（DDM ）?主要作用是什么？答：通過(guò)FL-2-W和FL-2-A來(lái)區(qū)分樣本中正常周期細(xì)胞和粘連體細(xì)胞的模式稱為雙粘 連體辨別模式。其目的是為了除去粘連體和

31、假陽(yáng)性的情況。14、樣品熒光標(biāo)記時(shí)都受哪些因素影響？1. 溫度的影響：溫度升高熒光量減弱2. pH值的影響：發(fā)生改變?cè)斐蔁晒夤庾V的改變，熒光強(qiáng)度的降低3. 熒光染料濃度的影響：熒光染料形成的締合分子中電子共振作用4. 雜質(zhì)的影響：產(chǎn)生淬滅作用5. 固定劑的影響：染 DNA時(shí)用醛類固定劑（戊二醛、甲醛）時(shí)熒光強(qiáng)度降低50%，醇類 影響較小6. 其他：溶劑的性質(zhì)、濃度對(duì)熒光淬滅也用一定影響15、DNA周期分析的主要操作步驟是什么？1. 開(kāi)機(jī)2. 運(yùn)行FACSComp :監(jiān)測(cè)儀器工作狀態(tài)并記錄數(shù)據(jù)3. 建立獲取模板：散點(diǎn)圖（ FL2-W.aFL2-A ）、兩個(gè)直方圖（FL2-A和FL2-W）4. 運(yùn)

32、行DNA QC質(zhì)控：建立測(cè)試條件，檢測(cè)儀器線性度、分辨率和脈沖處理器5. 確定存儲(chǔ)數(shù)據(jù)的地址6. 記錄數(shù)據(jù)：倍體分析建議做3個(gè)平行管，一管：2倍體標(biāo)準(zhǔn)品，二管：未知樣品 +2倍體標(biāo)準(zhǔn)品，三管：未知樣品。低速進(jìn)樣，以第一管為準(zhǔn)優(yōu)化條件，同條件下按順序獲取數(shù)據(jù)， 2萬(wàn)細(xì)胞7. 分析數(shù)據(jù)：用ModFit軟件分析結(jié)果16、通過(guò)你所學(xué)到的知識(shí)試舉兩例 FCM的應(yīng)用例子。要求繪出獲取與分析圖， 并簡(jiǎn)述分析結(jié)果。兩次流式實(shí)習(xí)的內(nèi)容寫(xiě)上去，細(xì)胞周期的分期鑒定 and淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞的表面CD分子 的熒光標(biāo)記。（按照老師課件上的寫(xiě)）仃、什么是CBA技術(shù)，檢測(cè)原理及特點(diǎn)。原理：將不同的捕獲抗體包被在不同熒光強(qiáng)度的微球上構(gòu)成捕獲微球，與待測(cè)樣品溶液混合形成抗原抗體結(jié)合物，再加入熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體形成：三明治“夾心復(fù)合物，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。特點(diǎn)：1）單一樣本同時(shí)檢測(cè)多種目的蛋白2）樣本量少3）靈敏度高，重復(fù)性好 4）所有分析只需一標(biāo)準(zhǔn)曲線 5）檢測(cè)線性范圍寬 6）避免酶聯(lián)反應(yīng)所致人工假象7）隨心所欲的組合菜單8）強(qiáng)大的軟件分析系統(tǒng) 9）高通量檢測(cè)系統(tǒng) FACSARRAY BIOANAL YZER10 ） 樣本來(lái)源：血清、血漿、細(xì)胞裂解液etc11