實驗三 病原細(xì)菌的鑒定與藥物敏感性(大)

1、1 實驗三實驗三 病原細(xì)菌的分離、鑒定與毒力分析病原細(xì)菌的分離、鑒定與毒力分析 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?1 1掌握無菌操作條件下致病菌的分離方法與程序；掌握無菌操作條件下致病菌的分離方法與程序； 2 2了解細(xì)菌鑒定的方法，熟悉細(xì)菌常用的生理生化反應(yīng)及原理。了解細(xì)菌鑒定的方法，熟悉細(xì)菌常用的生理生化反應(yīng)及原理。 2 二、實驗內(nèi)容二、實驗內(nèi)容 1. 1. 平板劃線法分離病原細(xì)菌；平板劃線法分離病原細(xì)菌； 2 2病原細(xì)菌的形態(tài)與生理生化鑒定；病原細(xì)菌的形態(tài)與生理生化鑒定； 3 3病原細(xì)菌的人工感染（課外選作實驗）。病原細(xì)菌的人工感染（課外選作實驗）。 3 三、主要儀器及試材三、主要儀器及試材 顯微

2、鏡，解剖鏡，解剖用具，包括解剖盤、解剖刀、解剖針、大小手術(shù)剪、顯微鏡，解剖鏡，解剖用具，包括解剖盤、解剖刀、解剖針、大小手術(shù)剪、 大小鑷子，培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、紗布等。大小鑷子，培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、紗布等。 蒸餾水、魚用生理鹽水，蒸餾水、魚用生理鹽水，70%70%的乙醇、的乙醇、BHIBHI培養(yǎng)基、生化管等。培養(yǎng)基、生化管等。 人工感染嗜水氣單胞菌的魚，未知病原菌感染的魚人工感染嗜水氣單胞菌的魚，未知病原菌感染的魚（剪掉部分背鰭或腹鰭（剪掉部分背鰭或腹鰭 作為標(biāo)記作為標(biāo)記) )。 4 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 （一）（一） 病原細(xì)菌的分離病原細(xì)菌的分離 1 1無菌操作打開病

3、魚的腹腔：無菌操作打開病魚的腹腔： 2 2細(xì)菌劃線接種：細(xì)菌劃線接種： 3 3培養(yǎng)與觀察：培養(yǎng)與觀察： （二）病原細(xì)菌的革蘭氏染色（二）病原細(xì)菌的革蘭氏染色 分別取嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和個人分離的未知菌株進(jìn)行分別取嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和個人分離的未知菌株進(jìn)行 革蘭氏染色，記錄結(jié)果。革蘭氏染色，記錄結(jié)果。 5 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 （三）病原細(xì)菌的生理生化鑒定（三）病原細(xì)菌的生理生化鑒定 分別測定分別測定分離菌分離菌和和嗜水氣單胞菌嗜水氣單胞菌的的1212種生化指標(biāo)：氧化酶，吲哚實驗，種生化指標(biāo)：氧化酶，吲哚實驗，VPVP， H H2 2S S，鳥

4、氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶性，七葉苷，賴氨酸脫羧酶，山梨醇，蔗糖，鳥氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶性，七葉苷，賴氨酸脫羧酶，山梨醇，蔗糖， 纖維二糖，明膠。纖維二糖，明膠。 取生化管于距離內(nèi)容物上方取生化管于距離內(nèi)容物上方2cm2cm處用砂輪割開，迅速于酒精燈火焰消毒，處用砂輪割開，迅速于酒精燈火焰消毒， 然后接種菌株，以然后接種菌株，以封口膜封口膜或液體石蠟封口，置或液體石蠟封口，置3535孵育，依據(jù)說明書進(jìn)行。孵育，依據(jù)說明書進(jìn)行。 6 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 （四）病原細(xì)菌的毒力分析（四）病原細(xì)菌的毒力分析 1 1實驗魚：實驗魚：實驗環(huán)境下暫養(yǎng)實驗環(huán)境下暫養(yǎng)7-107-10天。

5、每組不少于天。每組不少于5050條條，設(shè)不少于，設(shè)不少于3 3個平行重復(fù)。個平行重復(fù)。 2 2菌懸液制備：菌懸液制備：液體培養(yǎng)基增殖，用無菌生理鹽水懸浮。經(jīng)計數(shù)后采用等對數(shù)間距設(shè)計約液體培養(yǎng)基增殖，用無菌生理鹽水懸浮。經(jīng)計數(shù)后采用等對數(shù)間距設(shè)計約5 5 個感染劑量個感染劑量進(jìn)行感染試驗。對照組以無菌生理鹽水。進(jìn)行感染試驗。對照組以無菌生理鹽水。 3 3注射方法：注射方法：感染前實驗魚用感染前實驗魚用MS-222MS-222麻醉，用濕毛巾裹住魚體頭部。麻醉，用濕毛巾裹住魚體頭部。 （1 1）腹腔注射：腹鰭基部無鱗片處。）腹腔注射：腹鰭基部無鱗片處。 （2 2）肌肉注射：背鰭前端與側(cè)線之間的中部區(qū)

6、域。）肌肉注射：背鰭前端與側(cè)線之間的中部區(qū)域。 7 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 （四）藥物敏感性實驗（四）藥物敏感性實驗 （一）紙片擴(kuò)散法（一）紙片擴(kuò)散法 1.1.原理：原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸 取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度遞減的濃度梯度，細(xì)菌的生長被抑，細(xì)菌的生長被抑 制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，即抑菌圈愈大，藥制，形成透明的抑菌圈。抑

7、菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，即抑菌圈愈大，藥 物敏感性越強(qiáng)。物敏感性越強(qiáng)。 8 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 2.2.實驗操作實驗操作 1 1）倒平板）倒平板 2 2）菌懸液制備：）菌懸液制備：挑取斜面中菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將菌液濃度調(diào)到挑取斜面中菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將菌液濃度調(diào)到1 1* *107 107 cfu/mLcfu/mL。以玻璃刮鏟將。以玻璃刮鏟將0.1mL0.1mL細(xì)菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面；細(xì)菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面； 3 3）貼片：）貼片：將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片將鑷子

8、于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片 與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了能準(zhǔn)確觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了能準(zhǔn)確觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的 分布于平皿培養(yǎng)基上（在平皿中均勻貼四片）；分布于平皿培養(yǎng)基上（在平皿中均勻貼四片）； 4 4）培養(yǎng)：）培養(yǎng)：2828溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)24 h24 h，記錄結(jié)果；，記錄結(jié)果； 9 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 結(jié)果觀察：抑菌圈直徑大小與藥物濃度、細(xì)菌濃度有直接關(guān)系，觀察抑菌圈的有無。若有抑菌結(jié)果觀察：抑菌圈直徑大小與藥物濃度、細(xì)菌濃度有直接關(guān)系，觀察抑菌圈

9、的有無。若有抑菌 圈，則測量抑菌圈直徑；若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。圈，則測量抑菌圈直徑；若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。 抑菌圈直徑抑菌圈直徑15mm 15mm 高度敏感高度敏感 抑菌圈直徑抑菌圈直徑10-15mm 10-15mm 中度敏感中度敏感 抑菌圈直徑抑菌圈直徑10mm 10mm 低度敏感低度敏感 無抑菌圈無抑菌圈 不敏感或耐藥不敏感或耐藥 氟：氟：7575g/mLg/mL；恩：；恩：5 5 g/mL g/mL 磺：磺：300300g/mLg/mL；青：；青：10IU/mL10IU/mL 10 磺磺氟氟 靑靑嗯嗯 12 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 （二）

10、肉湯試管稀釋法（二）肉湯試管稀釋法 1.1.原理：原理：以肉湯液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接入待檢菌，定量測定以肉湯液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接入待檢菌，定量測定 抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度（抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度（MICMIC）。）。 2.2.實驗操作實驗操作 1 1）菌液準(zhǔn)備：）菌液準(zhǔn)備：挑取金黃色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將挑取金黃色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將 菌液濃度調(diào)到菌液濃度調(diào)到1 1* *107cfu/mL107cfu/mL備用；備用； 13 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 2 2）抗菌

11、藥物稀釋（硫酸慶大霉素注射液）：）抗菌藥物稀釋（硫酸慶大霉素注射液）：配制藥物原液濃度為配制藥物原液濃度為8 8萬萬IU/mLIU/mL（80mg/mL80mg/mL），）， 0.45 0.45 m m濾器除菌。濾器除菌。 準(zhǔn)備準(zhǔn)備1111支支2 mL2 mL無菌無菌EPEP管編號管編號010010排好，在排好，在0 0號管和號管和1 1號管中加號管中加1.8 mL1.8 mL無菌生理鹽水，無菌生理鹽水，210210號管加號管加1 mL1 mL； 吸取吸取0.2 mL0.2 mL藥原液加入第一支藥原液加入第一支EPEP管中混勻，從第一支試管中吸取管中混勻，從第一支試管中吸取0.2 mL0.2

12、mL加入第二支加入第二支EPEP管混勻，然后吸管混勻，然后吸 取取1 mL1 mL加入第三支混勻加入第三支混勻以此類推，直到第十一支；以此類推，直到第十一支； 取取1212支滅過菌的玻璃試管編號支滅過菌的玻璃試管編號1-121-12排好，各加入排好，各加入1.8mL1.8mL滅過菌的培養(yǎng)液，然后從編號相對應(yīng)的滅過菌的培養(yǎng)液，然后從編號相對應(yīng)的EPEP管中管中 吸取稀釋過的藥液再做吸取稀釋過的藥液再做1010倍比稀釋。倍比稀釋。 14 四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟 3 3）接種：）接種：每只試管中加入每只試管中加入0.1ml0.1ml的菌液；的菌液； 4 4）培養(yǎng)：）培養(yǎng)：置置3737溫

13、箱，培養(yǎng)溫箱，培養(yǎng)24h24h； 5 5）結(jié)果觀察：）結(jié)果觀察：肉眼觀察，以不出現(xiàn)肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對測試菌的肉眼觀察，以不出現(xiàn)肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對測試菌的MICMIC。 根據(jù)結(jié)果換算出最小抑菌濃度（根據(jù)結(jié)果換算出最小抑菌濃度（g/mLg/mL）。）。 8000 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 無菌生理鹽水無菌生理鹽水 1.8mL 0.2mL 抗生素抗生素 8萬萬/mL 下排培養(yǎng)液每管下排培養(yǎng)液每管 1.8mL 對應(yīng)加對應(yīng)加0.2mL 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.6 0.3 0.15

14、 00.8 16 五、實驗注意事項五、實驗注意事項 分離、接種時嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行。 分離、接種時嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行。 革蘭氏染色過程中涂片務(wù)求均勻，切忌過厚，染色過程中不可使染液干涸。 革蘭氏染色過程中涂片務(wù)求均勻，切忌過厚，染色過程中不可使染液干涸。 藥敏實驗，在貼片時用無菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，貼片 藥敏實驗，在貼片時用無菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，貼片 后不能再更改紙片位置；鑷取藥物紙片時一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切后不能再更改紙片位置；鑷取藥物紙片時一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切 勿鑷起重新放置，以防不同抗生素

15、交叉影響。勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影響。 17 六、實驗安排六、實驗安排 1-41-4節(jié)節(jié) (1)(1)配培養(yǎng)基（固體、液體分裝），包培養(yǎng)皿（配培養(yǎng)基（固體、液體分裝），包培養(yǎng)皿（1010包），配制生理鹽水，滅菌（包），配制生理鹽水，滅菌（4 4瓶）；瓶）； (2)(2)完成細(xì)菌染色、觀察和生化指標(biāo)測定；完成細(xì)菌染色、觀察和生化指標(biāo)測定； 4-84-8節(jié)節(jié) (1)(1)倒平板接種貼紙；倒平板接種貼紙；(2)(2)藥液稀釋接種；（藥液稀釋接種；（3 3）第二天早上看結(jié)果。）第二天早上看結(jié)果。 18 七、實驗報告（一）七、實驗報告（一） 1 1記錄菌落特征、細(xì)菌形態(tài)、染色結(jié)果和生理生化結(jié)果（記錄菌落特征、細(xì)菌形態(tài)、染色結(jié)果和生理生化結(jié)果（3030分）。分）。 2 2，據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征和生化指標(biāo)初步鑒定分離自患病魚的細(xì)菌種類（，據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征和生化指標(biāo)初步鑒定分離自患病魚的細(xì)菌種類（2020分