拉曼光譜法指導原則

1、拉曼光譜法指導原則拉愛光譜法是研究化介物分了受光照射后所產(chǎn)生的散射光與入射光能啟差與化合物振動頻率間關系的分析方仏。與紅外光譜類似，拉曼光譜是一種振動光譜技術。所以不同的是，前者與分子振動時偶極矩變化和關，而拉曼效 應則是公子極化率改變的結果，被測最的是非彈性的散射輜射。拉曼光譜通常采用激光作為單色光源，將樣品分了激發(fā)到某i虛態(tài)，隨后受激分子弛豫躍到-個與阜態(tài)不同的振 動能級，此時，散射輜射的頻率將與入射頻率不同。這種頻率變化與基態(tài)和終態(tài)的振動能級差相當。這種“非彈性散 射”光就稱Z為拉曼散射。頻率不變的散射稱為彈性散射，即所謂瑞利散射。如果產(chǎn)生的拉曼散射頻率低J：入射頻率, 則稱之為斯托克散

2、射。反Z,則稱Z為反斯托克散射。實際上，幾乎所冇的拉曼分析都是測昴斯托克散射。拉曼光譜與紅外吸收光譜相似。用散射強度對拉曼位移作圖。拉曼位移（以cn?為單位）為激發(fā)光的波數(shù)與散射 輛射的波數(shù)Z差。由丁功能團或化學鍵的拉變位撼與它們在紅外比譜中的吸收波數(shù)相-致，所以譜圖的解析也與紅外 吸收光譜相同。然而，通常在拉曼光譜屮出現(xiàn)的強譜帶在紅外光譜中卻成為弱譜帶共至不出現(xiàn)，反Z變?nèi)?。所以，這 兩種比譜技術簾互為補充。拉曼光譜的優(yōu)點在丁它的快速、準確，測駅時通常不破壞樣品（固體、半固體、液體或氣體），樣品制備簡單及至 不需樣品制備。譜帯信號通常處在町見或近紅外光范尉，可以有效地和光纖聯(lián)用。這也意味著譜帶

3、信號町以從包封在 任何対激光透明的介質，如玻璃、塑料內(nèi)，或將樣品溶丁水中獲得?，F(xiàn)代拉曼光譜儀使用簡單，分析速度快（幾秒到 兒分鐘），性能町犠。因此，拉曼光譜與其他分析技術聯(lián)用比苴他光譜聯(lián)用技術從It種意義上說更加簡便（可以使用單 變彊和筋變吊方法以及校準）。除常規(guī)的拉疊光譜外，還仃一此較為特殊的拉曼技術。它們足共振拉曼、衷面增強拉曼光譜、拉曼旋光、相關一 反斯托克拉曼光譜、拉曼增益或減失光譜以及超拉曼光譜等。貳中，在藥物分析應用相對較多的是共振拉曼和表【杠増 強拉曼光譜法。共持有拉曼光譜法半激光頻率接近或等丁 分子的電子躍遷頻率時，可引起強烈的吸收或共持冇，導致他子的某 些拉曼譜帯強度急劇增強

4、數(shù)白力倍。這就是共振拉曼效應。許多藥物在紫外一可見光區(qū)仃強的電了躍遷。某些金發(fā)色團化含物的拉曼光譜因共振而增強，而其基體物質的光 譜卻不會増強。共振拉曼技術與常規(guī)拉曼光譜技術不同Z處在耍求光源可變，町調諧染料激光器是獲得共持有拉曼 光譜的必要條件。仃些化介物可通過化學反應改變Jt結構，介Z最人吸收峰接近激發(fā)光頻率，如生成仃色化介物，然后再進行共振 拉曼光譜測定也是一個提高靈敏度的較有效的方法。共振拉曼技術山丁靈嫩度高而特別適用藥物和生物人分子的研究。缺點是山樣品本身或山雜質引起的熒光擾, 以及這一光譜技術需經(jīng)特殊的激光光源和光學設計。表面增強拉曼光譜法 吸附在極微小金屬顆粒農(nóng)|何或其附近的化合

5、物（或離子）的拉曼散射耍比該化合物的止常 拉曼散射W1JII 103-106倍。這種表而増強拉曼散射（SERS）在銀表而上最強，在金或銅的表面上也可觀察到。SERS現(xiàn)象主耍由金屬表面基質受激而使局部電磁場増強所引起。效臧的強弱取決光波長相對應的表面和糙度人 小，以及和波長相關的復雜的金加電介質作用的程度。許多SERS基質町以用丁藥物分析，級常用的包括溶膠，電極, 電介質表面金屬膜等。帯孤對電子或兀電子公的分子呈現(xiàn)的SERS效應垠強，其他芳氮或含氧化合物，如芳胺和酚，也1強的SERS 活性，這一效應在其他電負性功能團如竣酸中也能觀察到。從少數(shù)分子獲得人最結構信息的可能性使得SERS可用J：解決髙

6、只敏度化學分析的許影問題。面表面増強拉曼光譜中,熒光的干擾可有效地得到抑制。1儀器裝置根據(jù)獲得光譜的方式，拉曼光譜儀町分為F T拉曼光譜儀和色散型拉曼光譜儀，但所有的現(xiàn)代拉曼光譜儀均包括 激光光源、樣品裝置、濾光系統(tǒng)、光波處理系統(tǒng)（單色器或干涉儀）和檢測器等。（1）激光光源卜表列出兒種在藥學應用屮經(jīng)常使用的激光。紫外激光有時也有特殊應用，但是由種種原因在 常規(guī)分析中很少采用。激光波長X/nm（近似整數(shù)）類型激光典熨功率波長范H；l/nm斯托克 區(qū)域（100300cm）備注近紅外激光1064785紫外可見光488632.8紫外可見光固態(tài)（飲：YAG） 二極管 離子，（和固態(tài)，雙頻率激光染料激光器

7、最人3W最人500NIW最人1W町調107515637911027488781在紫外和可見光區(qū)可調常在傅里葉變換儀器中使用在多數(shù)色散拉曼中廣泛存在熒光風險熒光風險（2）樣品裝置可冇并種乞樣的樣品放置方式，包括直接的光學界、顯微鏡、光纖維探針（不接觸或光浸入）和 樣品室（包括特殊的樣胡盛器和口動樣胡轉換器）。樣胡光路也町被設計成能獲得偏振相關拉曼光譜，這種光譜通希包 含附加信息。樣品裝置的選擇應根據(jù)待測物的貝體（如樣品的狀態(tài)、體積等）以及測駅的速度、激光的安全性和樣品 圖譜的質龜要求等決定。（3）濾光系統(tǒng) 激光波長的散射光（瑞利光）要比拉妙信號強兒個數(shù)吊級，必須在進入檢測器前濾除。陷波濾波 器幾

8、乎被普遍應用丁-這個冃的，它貝冇濾波效果好和體積小等優(yōu)點。另外、為防止樣品不被外輜源（例如：房間的燈 光、激光等離子體）照射，需發(fā)設胃適宜的濾波器或者物理屏障。（4）光波處理系統(tǒng)光波倍號町通過色散或者干涉（傅里葉變換）來處理。任何合格儀器都適用丁定性鑒別。然 而，選擇定最測定儀器時，應注意色散和線性響應可能在整個波譜范用內(nèi)并不均衡（例如當使用階梯光柵分光鏡時）。（5）檢測器硅質CCD是色散儀器屮址常用的檢測器。這種冷卻的陣列檢測器允許在低噪聲卜的快帯全光譜打描。 常與通常使用的785iini -極管激光器配介使用。傅里葉變換儀器通常采用單通道或錮稼砂化介物（IiiGaAs）檢測器以 配介飲：億

9、-鋁-石榴紅（Nd:YAG） 1064nm的激光器在近紅外區(qū)使用。2. 儀器的校正與檢定拉曼儀器的校準包括三個耍索：初始波長（X軸）、激光波長以及強度（Y軸）。儀器供應應該提供一種由用戶可以執(zhí)行的，對儀器相關參數(shù)校正的方法，除另仃規(guī)定外，使用者應根據(jù)儀器所提 供的校正方法制訂的SOP,并嚴格按照SOP對上述參數(shù)進行檢定。特別需發(fā)注意到，激光波長變化對影響儀器的波粘度和光度（強度）橋度。即使是址穩(wěn)定的激光器在使用過程 中，直輸出波長也會冇輕微變化。所以，激光器必須被校正以確保拉曼位移的準確性。町以使用儀器公司提供的拉曼 位曼位移標準參考物質進行泄期校止。某些儀器町以用-種拉曼內(nèi)標物與初級光路分離

10、，外在校準裝置通過散射輜射 可準確地重現(xiàn)這一光路。推薦使用外部參考標準對儀器進行校正。3. 樣品制備獲得拉曼光譜町以采用卜述任一物質態(tài)：結晶態(tài)、無定形、液體、氣體或等離子體。液體能夠在玻璃管或石英管中苴接測定。為了獲得較人的拉曼散射強度，通常使照射在樣品上的入射光與所檢測 的拉曼散射光之間的夾角為0、90和180。樣品池的放置可有多種方式。除另白規(guī)定外，一般用作鑒別的樣品不必制樣，用作品型、界構體限度檢査或律駅測定時，供試品的制備和人體 測泄方法町按各品種項卜的有關規(guī)泄操作。表而増強拉曼光譜和顯微拉曼光譜的測定需要菜吐特殊的制樣技術。為防止樣品分解常采用的-種辦法是旋轉技 術，利用特殊的裝置使

11、激光光束的焦點和樣陽的表面做相對運動，從而避免樣品的局部過熱現(xiàn)象。樣品旋轉技術除 能防止樣品分解外，還能捉高分析的靈散度。4. 定性鑒別拉曼光譜可提供有關樣品分子中存在何種功能團的結構佇息。所以可用于鑒別試驗和結構解析.在相同的測定條 件卜，繪制供試品與對照品的拉曼光譜進行比對，若兩光譜相同，即鑒別為同一化介物.其有多晶現(xiàn)象的尚體藥品，由I：品熨的不同，町能導致所收集供試胡的光譜圖與對照品光譜圖與對照品光譜圖或 與標準光譜集所收取的光譜圖不-致，遇此情況，可參照紅外分光光度法鑒別的相關內(nèi)容進行處理。光譜的形狀與所用的儀器型號和性能、激發(fā)波長，樣品測定狀態(tài)及吸水程度等因素相關。因此，進行光譜比對

12、時, 應考慮各種因素可能造成的影響。5. 含量測定拉曼譜帶的強度與待測物濃度的關系遵守比爾定律：Iv=KicIo式屮幾為給定波長處的峰強；K為儀器和樣品的參數(shù)；右為光路長度；C為樣品中特定組分的糜爾濃度:I。為激光強度實際丁作中，光路長度被更準確地描述為樣品體積，這是一種描述激光聚焦和采集光學的儀器變杲。上述等式是 拉曼定最應用的皋礎。6.影響定量測定的因素址主要的十擾因素是熒光、樣品的熱效應和基質或樣品自身的吸收。在拉曼光譜中，熒光十擾表現(xiàn)為一個典型的 傾斜寬背景。因此，熒光對總理的影響主要為基線的偏離和信噪比卜降，熒光對定吊的影響主要為廉線的偏離和信噪 比卜降熒光的波長和強度取決丁熒光物質

13、的種類和濃度。與拉曼散射相比，熒光通常是一種杲子效率更高的過程，決 至很少屆不純物質的熒光也町以導致顯普減弱。然而，拉曼信號的強度與廠成比例，入是激發(fā)波長。通過平衡熒光十 擾、信號強度和檢測器響應可獲得最侍信噪比。測最前將樣品用激光照射一定時間，固態(tài)物質的熒光也可得以減弱。這個過程被稱為光致漂白，它是通過降解高 吸收物質實現(xiàn)的。光致漂白作用在液體屮并不明顯町能是由丁液體樣品的流動性或熒光物質魚較多所致。樣品加熱會造成一系列的問題，例如物理狀態(tài)的改變（熔化）、品型的轉變或樣品的燒灼。這是仃色的、八強吸收 或低熱傳導的小顆粒物質出現(xiàn)的問題。樣晶加熱的影響通常是可觀察的，表現(xiàn)在一定時間內(nèi)拉曼光譜或樣

14、晶的衣觀變 化。除了減少激光通最，仃許多種方法可用來降低熱效應，例如在測杲過程中移動樣品或激光，或者通過熱接觸或液 體浸入來改善樣品的熱傳導。甚質或樣品木身也可吸收拉曼信兮。在長波傅里葉變換拉曼系統(tǒng)中，拉曼信號訶以與近紅外的泛頻吸收匝替。這 種影響與系統(tǒng)的光學以及樣品的形態(tài)有關。裝填和顆粒人小的差異而引起的固體散射的可變性與這種效應何關。然而, 山丁在拉曼光譜與許多其他的光譜屮樣品的仃限穿透深度和相對狹窄的波2范用，所仃這些效應的人小都沒仃近紅外 光i普嚴乖。迄磧拉曼光譜與許多其他的比譜技術不同，它是單光束零背景測磺。謹慎地進行樣胡測泄以及便用設計合理的儀 器可以使這種變杲減到最小，但是并不能

15、全部消除。所以的拉曼信兮強度難以準確測駅。變異的潛在來源是樣品的不 透明性和樣品的不均勻性、照射樣品的激光功率的變化以及光學兒何學或樣品位置的變化。這些影響對以通過能晅復 的或仃代衣性的樣品處置方式了以減小。由拉曼信號絕對強度的波動，使用內(nèi)標是最泮通和冇效的減少可變性的方法。在激光照射卜，加入的內(nèi)標也產(chǎn) 生拉曼光譜，選釋其一條合適的拉曼譜帶作為參比譜帶強度進行比較（通常比較譜帶的面積或高度）。由J：內(nèi)標和樣晶 完全處丁相同的實驗條件2 些影響因素可以相互抵消。所選擇的內(nèi)標應滿足以卜耍求：化學性質比較穩(wěn)定，不與親品中被測成分或其他成分發(fā)生化學反應；內(nèi)標拉 曼譜帯和待測物的拉曼譜帶互不F擾：內(nèi)標應

16、比較純，不含仃被測成分或其他擾成分。對罪水溶液，簾用的內(nèi) 標是硝酸根離子（1050cm-1）和高氯酸根離子。對丁固體樣品，仃時選擇樣品中某一拉曼譜帶作為自少對照內(nèi)標譜帶。內(nèi)標方法彳j兒種變通選擇。町以有H的地加入一種內(nèi)標，該內(nèi)標MzHYj與待測物耳不十擾的譜帶以便檢測；欄溶 液屮，也町利用溶劑的獨特譜帶，因為溶劑隨樣品不同將相對保持不變另外，在制劑屮，如杲賦形劑負人人超過待測 紐分，則町以使用該賦形劑的峰；在假設激光和樣骷定位的改變町同等地影響全光譜的前提卜，全光譜同樣可以用作 參比。樣品測定中需考老的幣:要因素還冇光譜的污染。拉曼散射是一種可以被許多外源影響掩蔽的弱效應。普通的污染 源包括樣

17、品支持物（容器或慕質）和周川光線。通常，這些問題可以通過細致的實驗方法來講別和解決。7.測定方法驗證対拉曼光譜方法進行驗證是必須的，至少應考察準確度、楷密度等主耍指標，然而，這些指標受諸幺吋變因素的 影響，其中熒光町能是影響適用性的主耍變彊。樣品中熒光雜質的存在完全隨樣品而異。所以，方法必須能適應不同 品體系，必須足以將雜質的影響降到最小。檢測器的線性必須適麗叮能的信巧水半范|羽。熒光町能使信號壟線比驗證時高，這時必須設法將熒光減謝或者使 驗證的方法適應較高的熒光水平。這-耍求對方法的轎密度、檢測限（LOD）和定吊限（LOQ）同樣適用，因為廉線 噪聲的増加會對這些數(shù)值產(chǎn)牛影響。由丁熒光使基線漂移町能同樣