病毒載體概述

1、病毒載體概述引言基因?qū)胂到y(tǒng)（gene delivery system）是基因治療的核心技術(shù)，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。本章主要論述用于人類基因治療的病毒載體系統(tǒng)。用于基因治療的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件：1、攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒；2、介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達；3、對機體不致病。然而，大多數(shù)野生型病毒對機體都具有致病性。因此需要對其進行改造后才能用于人體。原則上，各 種類型的病毒都能被改造成病毒載體。但是由于病毒的多樣性及與機體復(fù)雜的依存關(guān)系，人們至今對許多 病毒的生活周期、分子生物學(xué)、與疾病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系等的認識還很不全面，從而限制了許多病毒發(fā)展成為具有實用性的載體。近

2、 20年來，只有少數(shù)幾種病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒（包括 HIV病毒）、腺病毒、腺病毒 伴隨病毒、皰疹病毒（包括單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成為基因轉(zhuǎn)移載體并開展了不同程度的應(yīng)用。第一節(jié)病毒載體產(chǎn)生的原理病毒載體的產(chǎn)生建立在對病毒的生活周期和分子生物學(xué)認識的基礎(chǔ)之上。研究病毒載體首先要對病毒 的基因組結(jié)構(gòu)和功能有充分的了解，最好能獲得病毒基因組全序列信息。病毒基因組可分為編碼區(qū)和非編 碼區(qū)。編碼區(qū)基因產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白；根據(jù)其對病毒感染性復(fù)制的影響，又可分為必需基 因和非必需基因。非編碼區(qū)中含有病毒進行復(fù)制和包裝等功能所必需的順式作用元件。各種野生型病毒顆粒都具有

3、一定的包裝容量，即對所包裝的病毒基因組的長度有一定的限制。一般來說，病毒包裝容量不超過自身基因組大小的105110 %?；蛑亟M技術(shù)的發(fā)展使病毒載體的產(chǎn)生成為可能。最簡單的做法是，將適當(dāng)長度的外源 DNA插入病毒基因組的非必需區(qū)，包裝成重組病毒顆粒。比如，本實驗室曾將4.5kb的lacZ基因表達盒（CMV-lacZ-polyA ） 插入HSV1病毒的UL44 （糖蛋白C）基因的XbaI位點中，病毒基因組的其余部分不改變，構(gòu)建成重組病 毒HSV1-lacZ100 （吳小兵等，1998 ）。由于UL44基因產(chǎn)物對于 HSV病毒在培養(yǎng)細胞中產(chǎn)毒性感染是非 必需的，因此，該重組病毒可以在細胞中增殖傳代

4、。用這種重組病毒感染細胞，能將lacZ基因帶入細胞并高效表達。用同樣的方法，將AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb ）插入HSV1病毒的UL2 （編碼尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44 （編碼糖蛋白C）基因中，構(gòu)建成具有提供重組AAV載體復(fù)制和包裝所需的全部輔助功能的輔助病毒rHSV-rc （伍志堅等，1999 ）。然而，這樣的重組病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體有許多缺點。首先，許多野生型病毒通過在細胞中產(chǎn)毒性復(fù) 制而導(dǎo)致細胞裂解死亡；或帶有病毒癌基因而使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此必須經(jīng)過改造使其成為復(fù)制缺陷性病 毒并且刪除致癌基因后才能用于基因治療。其次，插入外源DNA的長度受到很大限制，尤其對于

5、基因組本身較小的病毒如腺病毒伴隨病毒（ AAV , 4.7kb ）、反轉(zhuǎn)錄病毒（810kb ）、腺病毒（36kb ），如果不 去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。 因此，必須刪除更多的病毒基因以騰出位置插入較大 的外源DNA。為了增加病毒載體插入外源DNA的容量，除了可以刪除病毒的非必需基因外，還可以進一步刪去部分或全部必需基因，這些必需基因的功能由輔助病毒或包裝細胞系反式提供。病毒載體大體上可分為兩種類型：重組型病毒載體：這類載體是以完整的病毒基因組為改造對象。一般的步驟是選擇性地刪除病毒的某 些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表達；缺失的必需基因的功能由互補細胞反式提

6、供；用 外源基因表達單位替代病毒非必需基因區(qū)；病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件不變。這類載體一般通過 同源重組方法將外源基因表達單位插入病毒基因組中。如在傳統(tǒng)的重組腺病毒構(gòu)建方法中，將外源基因表 達盒（exogenous gene expression cassette）插入穿梭質(zhì)粒（如 pXCX2或pFGdX1 ）的腺病毒同源序列中，與輔助質(zhì)粒（含有腺病毒基因組的質(zhì)粒如JM17或pBHG ）共轉(zhuǎn)染293細胞，通過細胞內(nèi)的同源重組獲得含有外源基因的重組腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）。無病毒基因的病毒載體（gutless vectors ）:這類載體在不同的病毒

7、載體系統(tǒng)中的稱謂不同。對于腺病毒，一般稱為mini-Ad ；在HSV載體系統(tǒng)，一般稱為擴增子（amplicon ）載體或質(zhì)粒型載體。 重組AAV載體也屬于無病毒基因的病毒載體。這類載體系統(tǒng)往往由載體質(zhì)粒和輔助系統(tǒng)組成。重組載體質(zhì)粒主要由外源基因表達盒、病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件及質(zhì)粒骨架組成。輔助系統(tǒng)包括病毒復(fù)制和包裝所必需的所有反式作用元件。在輔助系統(tǒng)的作用下，重組載體質(zhì)粒（包含或不包含質(zhì)粒骨架）以特定形式（單鏈或雙鏈，DNA或RNA ）被包裝到病毒殼粒中，其中不含有任何病毒基因。這類病毒載體的優(yōu)點在于載體病毒本身安全性好，容量大。缺點在于往往需要輔助病毒參與載體DNA的包裝，而輔助

8、病毒又難以同載體病毒分離開來，造成最終產(chǎn)品中輔助病毒污染，從而影響其應(yīng)用。實際上，無病毒基因的病毒載體可以看作是重組病毒載體的一種極端減毒情況。表1列舉了幾種常見的病毒載體的順式作用元件和經(jīng)典的包裝方式。載體順式作用元件經(jīng)典包裝方式反轉(zhuǎn)錄病毒載體1 ）兩個長末端重復(fù)序列（LTR）:含有整合和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的必需序列；含有轉(zhuǎn)錄增強 子和啟動子；2）tRNA引物結(jié)合位點p ；3）包裝信號序列“。載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合了所有必需基因（gag,pol,env ）的包裝細胞系如 PA317，經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得產(chǎn)病毒細胞系（VPC）;細胞不 裂解，病毒不斷分泌至培養(yǎng)上清中。腺病毒載體兩個末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR）;包裝信

9、號序列。載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293細胞獲得重 組腺病毒。重組腺病毒感染 293細胞而擴增； 細胞每次被感染后發(fā)生裂解。腺病毒伴隨病兩個末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR ）;其中包括AAV載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293細胞，毒載體了病毒復(fù)制起點、包裝信號及整合和拯救 所必需的順式元件。并加輔助病毒（腺病毒或單純皰疹病毒）感染。單純皰疹病毒載體HSV病毒復(fù)制起點ori ；病毒包裝信號pac。PTCA重組病毒在互補細胞上傳代； 擴增了病毒在輔助病毒存在卜傳代。第二節(jié) 病毒載體的包裝系統(tǒng)將外源基因包裝到病毒殼粒中，是病毒載體生產(chǎn)的核心技術(shù)。一般地，病毒載體的制備包括以下要素：宿主細胞雖然現(xiàn)在已有可能對

10、有些病毒載體（如AAV載體）進行體外（無細胞）包裝（ Zhou XH et al . 1998;Ding L et al. 1997），但是這種包裝系統(tǒng)仍然需要細胞提取物，并且包裝效率相當(dāng)?shù)?，遠遠達不到可生產(chǎn)水平。至今為止，病毒載體的包裝主要是在對該病毒敏感的宿主細胞中進行的。宿主細胞不但提供了病毒 復(fù)制和包裝的環(huán)境條件，許多細胞成分還直接參與了病毒復(fù)制和包裝的過程。病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件和外源基因的表達盒一般地，病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件和外源基因的表達盒由細菌質(zhì)粒攜帶，組成病毒載體質(zhì)粒，是被包裝的對象。由于病毒復(fù)制方式的不同， 有些病毒載體如單純皰疹病毒擴增子（HSV

11、amplicon ）載體在包裝時，整個載體質(zhì)粒都被包裝進入病毒顆粒中；而有些病毒載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒伴隨病毒 載體的質(zhì)粒骨架部分并不被包裝到病毒顆粒中，只有病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件和外源基因表 達盒被包裝到病毒顆粒中。構(gòu)建重組型病毒載體時，病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件存在于病毒基因組中（病毒基因組可以由具有感染性的病毒顆粒提供，也可以質(zhì)粒形式提供）。先將外源基因表達盒插入穿梭質(zhì)粒攜帶的病毒同 源序列中；將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中，再用輔助病毒超感染；或?qū)⒅亟M穿梭質(zhì)粒與病毒基因組質(zhì)粒共 轉(zhuǎn)染細胞；重組質(zhì)粒與病毒基因組在細胞中進行同源重組而產(chǎn)生表達外源基因的重組病毒。重組腺病毒(

12、Graham FL and Prevec L 1995)和重組單純皰疹病毒 (Pyles RB et al. 1997; Kramm CM et al. 1997)的傳統(tǒng)制備方法都是采用這種方式。為了使病毒載體的生產(chǎn)更為方便，病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件和外源基因的表達盒除了可以用質(zhì)粒攜帶以外，也可以用另一種病毒(往往是輔助病毒)或生產(chǎn)細胞來攜帶。輔助元件包括病毒復(fù)制和包裝所必需的所有反式作用元件。這些元件一般包括病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因、病毒DNA合成和包裝所需的各種酶類的基因、病毒的外殼蛋白基因等。輔助元件的表現(xiàn)形式可以多種多樣。常用的 形式有： 輔助質(zhì)粒(helper plasmid

13、)，如用于產(chǎn)生重組腺病毒的質(zhì)粒JM17，用于重組AAV包裝的輔助質(zhì)粒 pAAV/Ad ( Rolli ng F and Samulski J 1995)等； 輔助病毒(helper virus )，如用于HSV擴增子載體包裝的輔助病毒HSV1 tsK株； 包裝細胞系如用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝的PA317細胞。這些表現(xiàn)形式之間可以相互轉(zhuǎn)化或合并。例如，輔助病毒可以轉(zhuǎn)化為輔助質(zhì)粒：傳統(tǒng)的AAV載體生產(chǎn)系統(tǒng)常用腺病毒作為輔助病毒。研究發(fā)現(xiàn)，并非腺病毒的所有基因?qū)AV病毒的產(chǎn)生都是必需的，只需要腺病毒E1a, E1b, E2a, E4和VA RNA 5種基因就行了。因此，將這5種基因置于同一個質(zhì)粒中，

14、構(gòu)建成的這種新的輔助質(zhì)粒就完全可以替代原來的輔助病毒(Xiao X et al. 1998; Grimm D et al. 1998)，不但提高了包裝效率，而且避免了產(chǎn)品中腺病毒污染的問題。上述幾種要素的不同組合，便產(chǎn)生了各種各樣的病毒載體包裝策略。根據(jù)病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)的組成因素的多少，可將其分成以下幾種：單組成因素生產(chǎn)系統(tǒng)( one-component system):所有的組成成分都集中在生產(chǎn)細胞中。經(jīng)典的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)就是由產(chǎn)病毒細胞(VPC )組成，重組反轉(zhuǎn)錄病毒由 VPC細胞不斷分泌至培養(yǎng)上清中。這種生產(chǎn)系統(tǒng)操作最為簡單，但是往往產(chǎn)量不高或不穩(wěn)定。采用這種策略，需要將重組病毒產(chǎn)生

15、所需要的所有元件都穩(wěn)定地置于生產(chǎn)細胞中。由于許多病毒基 因產(chǎn)物本身對細胞有破壞作用或不能在細胞中穩(wěn)定表達，因此這種策略在許多病毒載體的生產(chǎn)中難以實施。雙組成因素生產(chǎn)系統(tǒng)（two-comp onent system ）這種生產(chǎn)系統(tǒng)一般由一株病毒/一株細胞”組成。典型的例子是重組腺病毒生產(chǎn)系統(tǒng)。先用共轉(zhuǎn)染的方法獲得重組腺病毒毒種，再由該毒種和生產(chǎn)細胞（如量擴增。多組成因素生產(chǎn)系統(tǒng)（multi-comp onent system是由兩種以上的組成因素組成的生產(chǎn)系統(tǒng)。傳統(tǒng)的293細胞）組成一個雙組成因素的生產(chǎn)系統(tǒng)使病毒大）AAV載體生產(chǎn)系統(tǒng)就是由載體質(zhì)粒，輔助質(zhì)粒，輔助病毒和生產(chǎn)細胞 4種因素組成。這

16、種策略的缺點是影響因素多，操作復(fù)雜，產(chǎn)量不容易穩(wěn)定，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。 以上各種生產(chǎn)系統(tǒng)也可以相互轉(zhuǎn)化。我們實驗室通過將上述AAV載體生產(chǎn)系統(tǒng)的4種因素進行兩兩合并，即將輔助質(zhì)粒和輔助病毒合并成一種重組的輔助病毒，將載體質(zhì)粒和生產(chǎn)細胞合并成AAV前病毒細胞株，成功地將其轉(zhuǎn)化成一種雙組成因素的新型高效生產(chǎn)系統(tǒng)（伍志堅等，1999 ）。一般來說，發(fā)展新的包裝策略主要是為了以下幾種目的：（1）減少生產(chǎn)系統(tǒng)中的組成因素，簡化操作過程;（2）提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本；（3）避免或降低野生型病毒的產(chǎn)生；（4）避免使用難以與產(chǎn)品病毒分離的輔助病毒。第三節(jié)病毒載體的純化方法重組病毒的純化與基因工程產(chǎn)品的純化

17、既有許多共性，又有顯著的不同之處。病毒可以看作是一個具 有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子，一般都由位于中心的核酸和包裹于其外的蛋白外殼組成。有些病毒還具有脂質(zhì) 膜和糖蛋白或糖脂。許多分離純化蛋白質(zhì)的方法如離心和梯度離心、鹽析、柱層析、超濾、透析等方法都 可用于病毒的純化。然而，由于病毒結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，純化時不能采用蛋白質(zhì)變性和復(fù)性的方法，因為一旦 病毒蛋白發(fā)生變性，或病毒結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，在體外就很難再重建成有感染性的病毒顆粒。因此，在病毒的 純化過程中必須保持病毒的結(jié)構(gòu)不受破壞，并且監(jiān)測其感染活性。病毒的純化一般分為以下幾個步驟：初始物（start material ）的收集或制備根據(jù)病毒產(chǎn)生方式的不同而采

18、取不同的方式。對于不導(dǎo)致細胞病變和死亡的病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒，可不 斷收集產(chǎn)毒細胞（VPC細胞）的培養(yǎng)上清作為初始物；對于在生產(chǎn)病毒過程中宿主細胞發(fā)生病變和死亡的 病毒如腺病毒，在病毒產(chǎn)生達到高峰時，收集培養(yǎng)上清，并裂解細胞以釋放細胞內(nèi)的病毒。培養(yǎng)上清和細胞裂解液都可作為純化的初始物。在實驗室的小規(guī)模制備中，往往采用將培養(yǎng)上清與細胞一起反復(fù)凍融34次的方法制備細胞裂解液作為初始物。對于初始物體積大于500ml的較大規(guī)模的制備，則需要考慮采用不同初始物的損益率。如果收集時大部分（90 %以上）目標(biāo)病毒仍存在于細胞中，為了減少操作大體積初始物帶來的不便，可以考慮放棄上清中含有的目標(biāo)病毒，而通過低速離心

19、收集細胞， 重懸于較小體積的緩沖液中進行細胞裂解制備細胞裂解液。對于腺病毒和AAV病毒的大規(guī)模制備都可以采用這種方式。如果通過延長培養(yǎng)時間可以使大部分的目標(biāo)病毒釋放到培養(yǎng)液中，也可以只收集培養(yǎng)上清而 棄去細胞，從而省去反復(fù)凍融的步驟。除了用反復(fù)凍融方法裂解細胞外，還可以根據(jù)目標(biāo)病毒的生物學(xué)性質(zhì)采用其它不影響其感染性的方法， 如超聲法、化學(xué)法（如在 AAV病毒制備中用脫氧膽酸或氯仿）等。初始物的濃縮當(dāng)初始物體積較大時，要考慮對其進行濃縮后再分離純化。濃縮時最好同時能獲得初步純化對于效果。在不影響目標(biāo)病毒的感染性的前提下，可選用鹽析、超濾、透析等方法進行濃縮。鹽析法不僅可以用來濃 縮初始物，同時也

20、能達到一定的分離純化效果。最常用的鹽是硫酸銨；許多病毒如腺病毒、AAV病毒和單純皰疹病毒用聚乙二醇/氯化鈉系統(tǒng)沉淀可獲得很好的效果并且不影響病毒的感染性。目標(biāo)病毒的分離純化氯化銫密度梯度離心法至今仍是分離純化各種病毒的最常用方法。主要是依據(jù)不同病毒具有特征性的 浮力密度，使其與細胞裂解液中的其它成分分離開來。收集到目標(biāo)病毒特異的組分后，用透析法除去其中 的氯化銫，獲得純化的病毒。用這種方法有時可獲得極高純度的病毒。目前在臨床實驗中應(yīng)用的重組腺病 毒大都是用這種方法進行純化的。然而，這種方法也存在明顯的弊病，主要是費時且操作難度較大，重復(fù) 性較差；并且氯化銫對人體有毒性。因此隨著基因治療研究和應(yīng)

21、用的發(fā)展，用這種方法純化的重組病毒可 能不能適應(yīng)人體內(nèi)應(yīng)用的要求。用柱層析法尤其是親和層析法分離純化病毒可能成為用于臨床的重組病毒載體大量純化的主要方向。將病毒的特異性受體、抗體或化學(xué)合成的配體偶聯(lián)在層析基質(zhì)上并制備成親和層析柱。將含有目標(biāo)病毒的初始物經(jīng)簡單處理后直接上柱，最后洗脫和收集目標(biāo)病毒。這類方法最近在AAV病毒載體的純化中得到很高評價（Summerford C and Samulski J 1999）。第四節(jié) 病毒載體在基因治療中的應(yīng)用自1989年開展第一例人體基因轉(zhuǎn)移（標(biāo)記基因）以來，據(jù)不完全統(tǒng)計，至今已開展了近400項基因治療臨床試驗，涉及病人 1000余人。2/3以上的臨床方案

22、中應(yīng)用了病毒載體進行基因?qū)?。由于各種的病毒載體具有其特定的生物學(xué)特性，這些特性決定了其在基因治療中的應(yīng)用。表2列舉了常用的病毒載體的特性和適用范圍載體順式作用元件經(jīng)典包裝方式載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合了所有1 ）兩個長末端重復(fù)序列（LTR）:含有整必需基因（gag,pol,env ）反轉(zhuǎn)錄合和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的必需序列；含有轉(zhuǎn)錄增強的包裝細胞系如 PA317 ,病毒載子和啟動子；經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得產(chǎn)病毒細體2） tRNA引物結(jié)合位點p ；胞系（VPC）;細胞不裂3）包裝信號序列“。解，病毒不斷分泌至培養(yǎng)上清中。腺病毒載體兩個末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR）； 包裝信號序列。載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn) 染293細胞獲得重組腺

23、病 毒。重組腺病毒感染 293 細胞而擴增；細胞每次被 感染后發(fā)生裂解。腺病毒伴隨病毒載體兩個末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR ）;其中包括 了病毒復(fù)制起點、包裝信號及整合和拯救 所必需的順式元件。AAV載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)染293細胞，并加輔 助病毒（腺病毒或單純皰 疹病毒）感染。單純皰疹病毒載體HSV病毒復(fù)制起點ori ；病毒包裝信號pac。PTCA重組病毒在互補細胞上傳代；擴增子病毒在輔助病毒存在下傳代。第五節(jié)安全性檢測總的來說，病毒載體制劑的安全性檢測主要涉及以下幾個方面（Aderson RW 1996）:有復(fù)制能力的病毒（replicati on compete nt virus, RC

24、V ）RCV 一般產(chǎn)生于重組病毒生產(chǎn)過程中基因重組事件。由于RCV具有復(fù)制能力，在生產(chǎn)過程中一旦出現(xiàn)，就可能呈現(xiàn)優(yōu)勢生長，從而影響載體病毒的產(chǎn)量；另外，含有RCV的制品用于人體內(nèi)可能導(dǎo)致嚴重的病毒感染或急性/慢性病毒血癥。RCV是對用于基因治療的病毒載體制劑安全性檢測的特有項目。檢測RCV的方法因不同的病毒載體而異。對于反轉(zhuǎn)錄病毒載體，檢測有復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）的方法主要是 PG4 S+L-分析法；也可采用其它的變通方法。對于腺病毒載體，檢測有復(fù)制能力的腺病毒（RCA）主要采用空斑分析方法及PCR方法。輔助病毒對于生產(chǎn)過程需要輔助病毒參與的病毒載體如AAV病毒載體，由于這些輔助病毒本

25、身具有復(fù)制能力并對機體細胞有破壞性，因此檢測病毒制劑中的輔助病毒如腺病毒或單純皰疹病毒的殘存量十分重要。其它成分的污染檢測指標(biāo)包括細菌、霉菌、支原體、內(nèi)毒素等及在純化過程中所用試劑如氯化銫等的殘余量。第六節(jié)病毒載體的發(fā)展方向基因治療研究的快速發(fā)展對基因?qū)胂到y(tǒng)提出了越來越高的要求。病毒載體的發(fā)展也日新月異，包括對已有病毒載體的不斷改進和完善，和越來越多的其它病毒被改造成為新的病毒載體。病毒載體的發(fā)展方 向可歸納成以下幾個方面：簡便、高效的病毒載體包裝系統(tǒng)：考慮到包裝的高效性和操作的簡便性，越來越多的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)將采用雙組成因素系統(tǒng)。這種系統(tǒng)容易用于病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)（Liu XL et

26、al.1999; Conway JE et al.1999 ）。無病毒基因的病毒載體（gutless viral vector ）:去除病毒載體中所有的病毒基因，只保留其復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件，是病毒載體的重要發(fā)展方向。這種策略可最大限度地擴大載體的容量和減少病毒對細胞的直接毒性和病毒蛋白表達引起的免疫毒性。腺病毒的微載體（mini-Ad ）、AAV載體、HSV擴增子載體都是無病毒基因的病毒載體。這一發(fā)展方向需要解決的主要問題是建立高效、安全（無輔助病毒污染）的包裝系統(tǒng)。可調(diào)控表達外源基因的病毒載體：在許多疾病的基因治療中，實現(xiàn)外源基因的可調(diào)控表達十分重要。如糖尿病的基因治療，外源的胰

27、島素基因的表達最好能受血糖水平的調(diào)控；腎性貧血的基因治療，EPO基因的表達最好能受血氧含量的調(diào)控等。目前所研究的表達調(diào)控系統(tǒng)主要包括各種藥物誘導(dǎo)的表達”開關(guān)。其 中四環(huán)素控制系統(tǒng)(Tet-on和Tet-off )是人工設(shè)計的一種基因表達調(diào)控模式。這個系統(tǒng)在體外和動物體內(nèi)實驗中都表現(xiàn)出良好的表達調(diào)控作用( Fotaki ME et al.1997; Miller N and Whelan J 1997)。然而，由于其中的反式作用蛋白(tTA或rtTA )是異種蛋白，在機體內(nèi)可能引起毒性作用和免疫反應(yīng)，因此用于 人體前還需考慮其安全性和長期有效性。最近Binley K等(1999 )報道了用缺氧反

28、應(yīng)元件(hypoxia response element ,HRE )腺病毒載體中外源基因的表達。缺氧可激活bHLH/PAS 家族轉(zhuǎn)錄因子的表達，它們可結(jié)合HRE核心序列上，誘發(fā)其下游基因的表達。自我擴增型載體(self-amplifying vector) ( Herweijer H and Wolff JA 1997):目前的基因轉(zhuǎn)移方法基因轉(zhuǎn)移的效率仍相對較低，尤其是在體內(nèi)。為了提高外源基因表達總水平，除了提高基因轉(zhuǎn)移效率外，另一種方法是盡量提高外源DNA在細胞中的表達水平。用自我擴增型的表達載體是達到此目的的方法之一。這些載體是以正鏈RNA 病毒Sindbis病毒和Semliki Fo

29、rest病毒為基礎(chǔ)的。用目的基因代替病毒的外殼蛋白編碼序列，導(dǎo)入靶細胞中，病毒的復(fù)制蛋白大量復(fù)制重組的基因組，mRNA水平的大量增加導(dǎo)致高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達。自我擴增型載體的表現(xiàn)形式可以是RNA，DNA和重組病毒。特異性復(fù)制型性病毒載體(specifically replicati ng vector):指可在某種特性的組織中產(chǎn)毒性復(fù)制，而在其它組織中不增殖的病毒載體。這類病毒載體主要用于特異性裂解腫瘤細胞。如腺病毒突變株Onyx-015是55Kdal E1B基因功能缺失的腺病毒突變株，可以選擇性地在p53基因突變的腫瘤細胞中增殖，而在正常組織細胞中不增殖。用這種突變株聯(lián)合化療治療惡性腫瘤II

30、期臨床結(jié)果令人鼓舞(Kirn D et al.1998 )，已進入III期臨床試驗，從此，許多人工改造的腺病毒突變體被用于腫瘤治療研究中。如將腺病毒E1基因的表達用甲胎蛋白(AFP)啟動子控制，使得該病毒只能在甲胎蛋白陽性的肝癌細胞中增殖導(dǎo)致細 胞死亡。也可以將這種病毒的基因組分開裝在兩個互補的缺陷性腺病毒載體上(Alemany R et al. 1999)，其中一個載體除了腺病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件外，只含有E1區(qū)基因，其中E1A基因的表達受AFP啟動子的控制；另一個載體為E1區(qū)缺失的重組腺病毒。這兩個載體同時感染AFP陽性的肝癌細胞 時，病毒可不斷增殖而引起細胞死亡；對于 AFP

31、陰性的細胞，E1A基因不表達，因而病毒不能增殖。類似 的設(shè)計在HSV載體系統(tǒng)也有報道。除了用甲胎蛋白作為反式激活因子外，各種其它組織特異性表達的蛋白 和調(diào)控序列都可被用來控制病毒的增殖。嵌合型病毒載體(hybrid viral vector ):是指將不同病毒的基因元件進行組合，形成的重組雜合病毒。如腺病毒與AAV病毒的雜合體病毒，既具有腺病毒的感染性和基因組特性(雙鏈線狀DNA)，又具有AAV病毒的染色體整合性 (Lieber A et al. 1999)。各種病毒基因元件組合形成新的雜合載體的報道層出不窮，如單純皰疹病毒擴增子與AAV病毒雜合載體(Johnston KM et al. 19

32、97)、腺病毒與 EB病毒復(fù)制子雜合載體(Tan BT et al. 1999 )腺病毒與反轉(zhuǎn)錄病毒雜合載體(Caplen NJ et al. 1999)等，不一而足。這些雜合載體使重組病毒的特性多樣化，以適應(yīng)不同基因轉(zhuǎn)移目的的需要。靶向性病毒載體(targeted viral vector )：是指能特異性地結(jié)合并感染某種細胞的病毒載體。靶向性病毒載體的產(chǎn)生主要有兩種方法。一種方法是將病毒顆粒與某一靶向分子(Harari OA et al.1999)或特異性抗體(Bartlett JS et al. 1999)偶聯(lián)；另一種方法是通過改變病毒外殼蛋白的結(jié)構(gòu)，使其對細胞的親嗜性發(fā)生改變(Reyn

33、 olds P et al. 1999； Kras nykh VN et al. 1996)。用各種其它病毒構(gòu)成新型病毒載體：略。參考文獻Aderson RW. 1996. Forum96: Gene Therapy. P21-24Alema ny R, Lai S, Lou YC et al. 1999. Compleme ntary ade no viral vectors for on colysis. CancerGene Ther. 6:21-25Bartlett JS, Klein schmidt J, Boucher RC et al. 1999. Targeted ade no

34、-associated virus vectortran sduct ion of non permissive cells mediated by bispecific F(ab丫)2 an tibody. NatureBiotech nology. 17:181-186Caplen NJ, Higginbotham JN, Scheel JR, Vahanian N et al. 1999Adeno-retroviral chimeric viruses as in vivo tran sduci ng age nts. Gene Ther. 6:454-459Con way JE, Rh

35、ys CMJ, Zolotukli n I et al. 1999. High-titer recomb inant ade no-associated virus product ion utilizi ng a recomb inant herpes simplex virus type I vector express ing AAV-2 rep and cap. Ge ne Ther. 6:986-993 Ding L, Lu S and Mu nshi NC. 1997. In vitro packagi ng of an in fectious recomb inant ade n

36、o-associated virus 2. Gene Ther. 4:1167-1172Fotaki ME,Pi nk JR, Mous J 1997. Tetracycli ne-resp on sive gene expressi on in mouse brain after amplic on-mediated gene tran sfer. Gene Ther. 4:901-908Gene Ther. 6:1336-1339Graham FL and Prevec L. 1995. Methods for con struct ion of ade no virus vectors.

37、 MolecularBiotechnology. 3:207-220Grimm D, Kern A, Ritt ner K et al. 1998. Novel tools for product ion and purificati on of recomb inant ade noassociated virus vectors. Hum. Gene Ther. 9:2745-2760)Harari OA, Wickham TJ, Stocker CJ et al. 1999. Targeti ng an ade no viral gene vector tocytok in e-acti

38、vated vascular en dothelium via E-select in. Gene Ther. 6:801-7Joh nston KM. Jacoby D. Pechan PA et al. 1997. HSV/AAV hybrid amplico n vectors exte ndtran sge ne expressi on in huma n glioma cells. Hum Gene Ther. 8:359-370Kirn D, Hermiston T and McCormick F. 1998. ONYX-015: Cli nical data are en cou

39、rag ing. Nature Med. 4:1341-1342Kramm CM, Chase M, Herrlin ger U et al. 1997. Therapeutic efficie ncy and safety of asec on d-ge nerati on replicatio n-con diti onal HSV1 vector for brain tumor gene therapy. Hum. Gene Ther. 8:2057-2068Kras nykh VN, Mikheeva GV. Douglas JT et al. 1996. Gen erati on o

40、f recomb inant ade no virus vectors with modified fibers for altering viral tropism. J Virol. 70:6839-6846.Lieber A, Stei nwaerder.DS, Carls on CA et al. 1999. In tegrat ing ade no virus-ade no-associated virus hybrid vectors devoid of all viral genes J Virol. 73:9314-9324Liu XL, Clark KR, Joh nson PR. 1999. Productio n of recomb inant ade no-associated virus vectors using a packagi ng cell line and a hybrid recomb inant ade no