牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測(cè)方法

1、牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測(cè)方法 隨著奶牛飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，抗生素在預(yù)防和治療奶牛疾病方面得到廣泛的應(yīng)用。生鮮牛奶中抗生素的來(lái)源主要是：第一，治療泌乳期病牛時(shí)使用的抗生素會(huì)從奶牛體內(nèi)移行到乳腺殘留進(jìn)入牛奶中，資料表明治療后的奶牛，其擠出的牛奶5天內(nèi)都有抗生素殘留；其二，為了預(yù)防奶牛疾病并提高產(chǎn)量，在奶牛飼料中添加抗生素也會(huì)造成牛奶中抗生素的殘留；第三，由于牧場(chǎng)管理不善，擠奶、儲(chǔ)奶沒(méi)有嚴(yán)格的衛(wèi)生制度和配套的設(shè)施，人為添加或造成牛奶抗生素的污染。牛奶中含有抗生素，不僅對(duì)人的健康造成很大的危害，而且對(duì)乳品加工企業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失（因無(wú)法生成酸奶和奶酪）。因此必須嚴(yán)格控制牛奶中抗生素殘留，除了要做好科學(xué)飼養(yǎng)

2、、精心管理；正確擠奶和預(yù)防疾病外，還要規(guī)范抗生素的使用，按國(guó)標(biāo)中有關(guān)規(guī)定，用藥后的奶牛5天后所產(chǎn)的牛奶才可作為原料乳，并且要檢測(cè)其殘留。世界糧農(nóng)組織（FAO）、世界衛(wèi)生組織（WHO）、歐盟（EC）及美國(guó)的食品和藥品管理局（FDA）等對(duì)食品中抗生素最大殘留量都有明確的規(guī)定，我國(guó)也有鮮奶中抗生素殘留量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（GB4689.2794）。目前，鮮奶中抗生素殘留的檢測(cè)方法大致分為三類：生物測(cè)定法（微生物測(cè)定法、放射受體測(cè)定法）、免疫法（放射免疫法、熒光免疫法、酶聯(lián)免疫法）、理化分析法（波譜法、色譜及聯(lián)用技術(shù)）。下面介紹幾種常用的牛奶中抗生素殘留檢測(cè)方法。TTC法TTC法是我國(guó)鮮奶中抗生素殘留量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

3、（GB4689.2794）的檢測(cè)法，屬生物檢測(cè)法。其測(cè)定原理基于抗生素對(duì)微生物的抑制作用。如果牛奶中含有抗生素，則加入菌種（嗜熱鏈球菌）經(jīng)培育2.53小時(shí)后,加入TTC指示劑(三苯基四氮唑)不發(fā)生還原反應(yīng),所以樣品呈無(wú)色狀態(tài);如果牛奶中不含抗生素,則樣品呈紅色.這樣實(shí)驗(yàn)后樣品顏色不變的為陽(yáng)性,樣品染成紅色的為陰性。TTC法的具體操作步驟:1.菌液制備:將單菌種(嗜熱鏈球菌)以脫脂乳為培養(yǎng)基,在361培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15小時(shí)后,再以脫脂乳以至于1:1稀釋待用;2.取待檢樣液9mL,在80水浴加熱5分鐘后冷卻到37以下,加活菌液1mL,在361水浴2小時(shí),加入4%的TTC指示劑0.3mL, 361水浴

4、培養(yǎng)30分鐘;3.若樣液顏色不變?yōu)殛?yáng)性,呈紅色為陰性;若陽(yáng)性的樣液,再置于水浴中培養(yǎng)30分鐘,不顯色的為陽(yáng)性,呈紅色為陰性.TTC法測(cè)定各種抗生素的靈敏度為:青霉素:4ppb,鏈霉素:500ppb,慶大霉素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有費(fèi)用低,易開(kāi)展的優(yōu)點(diǎn);缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，要求操作人員需有一定專業(yè)知識(shí)且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中菌液的制備、水浴過(guò)程控制都要求嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性，以致出現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。Delvotest? sp法（戴爾沃檢測(cè)法）該法最早在香港傳到廣東的，其使用是基于20世紀(jì)80年代初香港要求廣東出口的生奶必須“無(wú)抗”且要求采用Delvotest法檢測(cè)。該方法

5、也是生物測(cè)定法，其試劑是由荷蘭DSM公司生產(chǎn)并由AOAC認(rèn)證。原理是利用微生物嗜熱芽胞菌在64條件下培養(yǎng)2.53小時(shí)后會(huì)產(chǎn)酸,酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變?yōu)辄S色;若牛奶樣品中不含抗生素,培養(yǎng)后樣品呈黃色,如樣品中含有抗生素, 嗜熱芽胞菌生長(zhǎng)受到抑制而無(wú)法產(chǎn)酸,指示劑將不變色.推薦精選Delvotest? sp 法的操作步驟:1.以無(wú)菌操作將一片營(yíng)養(yǎng)藥片夾放入小試管內(nèi);2.用微量移液管將0.1mL牛奶樣品注入小試管內(nèi);3.把小試管放入已預(yù)熱至64的水浴箱或恒溫器中培養(yǎng);4).定時(shí)3小時(shí)取出觀察顏色變化.如果底部2/3的固體介質(zhì)是黃色,則為陰性, 如果底部2/3的固體介質(zhì)是紫色,則為陽(yáng)性.De

6、lvotest? sp 法具有廣譜性,可檢測(cè)到?-內(nèi)酰胺類抗生素在內(nèi)的更多抗生素,如磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氯霉素等，其中對(duì)青霉素和磺胺類抗生素特別靈敏. 其靈敏度為：青霉素:3ppb,鏈霉素:300ppb,慶大霉素:400ppb,卡那霉素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便，嚴(yán)格實(shí)用，容易判斷，結(jié)果可靠，費(fèi)用適中等優(yōu)點(diǎn)；但也易出現(xiàn)假陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)證明：當(dāng)牛奶樣品中添加微生物防腐劑（如乳酸鏈球菌素Nisn）或樣品中有足夠的洗滌劑殘留時(shí)，便可影響嗜熱芽胞菌生長(zhǎng)而使實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。Snap?法該方法是酶聯(lián)免疫法，由美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)其檢測(cè)分析儀及其試劑盒，均獲得

7、AOAC認(rèn)證，它利用了竟?fàn)幟嘎?lián)免疫技術(shù)。其基本原理是用特異性抗體將固相載體激活，加入含待測(cè)抗原的溶液和一定量的酶標(biāo)記抗原在455共同保溫，使樣品內(nèi)的抗生素與內(nèi)置抗生素標(biāo)志物竟?fàn)幣c固定的抗體結(jié)合，然后進(jìn)行洗滌和顯色，內(nèi)置抗生素標(biāo)志物與固定的抗體結(jié)合形成的復(fù)合體，通過(guò)酶的作用分解可形成有色物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定色度并與參照物對(duì)照，就可以確定結(jié)果是陽(yáng)性或陰性。Snap?法操作步驟：1.加入乳樣于樣品管中,搖勻,加熱樣品和檢測(cè)板5分鐘;2.加入乳樣于樣品孔中,當(dāng)激活圓環(huán)開(kāi)始退卻時(shí),按Snap鍵;3.反應(yīng)4分鐘,由Snap?讀數(shù)儀讀取并打印結(jié)果.檢測(cè)讀數(shù)小于1.05時(shí)判為陰性,大于1.05時(shí)判為陽(yáng)性.Snap?

8、法是一種將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的方法,其敏感性和特異性好,檢測(cè)的靈敏度以普遍使用的?-內(nèi)酰胺類計(jì)：青霉素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨芐西林:10ppb,頭孢西林:8ppb.其他抗生素如四環(huán)素等的檢測(cè),則需購(gòu)買相應(yīng)的試劑來(lái)檢測(cè). Snap?法檢測(cè)結(jié)果快速準(zhǔn)確, 9分鐘內(nèi)即可檢測(cè)出牛奶中?-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素的殘留含量，且有半定量的讀數(shù)，可監(jiān)控牧場(chǎng)用藥的情況；檢測(cè)儀器穩(wěn)定性良好，結(jié)果重現(xiàn)性高，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單方便；但需購(gòu)置專用儀器和試劑，成本較高。高效液相色譜檢測(cè)法它是一種理化檢測(cè)方法,是利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)來(lái)測(cè)定其含量.檢測(cè)

9、的過(guò)程采用了氣相色譜理論,通過(guò)高壓液相和高靈敏度的檢測(cè)器,分離速度快、效率高和操作自動(dòng)化。一般要經(jīng)過(guò)樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟，能檢測(cè)抗生素的具體含量，敏感性較高，但檢測(cè)程序復(fù)雜，費(fèi)用較高，需購(gòu)買色譜儀等檢測(cè)設(shè)備，不適合小型檢驗(yàn)室。推薦精選傳統(tǒng)的抗生素檢測(cè)方法不少,有的操作煩瑣,有的實(shí)驗(yàn)條件要求高,有的檢驗(yàn)時(shí)間太長(zhǎng);這些不僅會(huì)給乳制品生產(chǎn)企業(yè)造成經(jīng)濟(jì)上和時(shí)間上的損失,而且檢測(cè)結(jié)果常常會(huì)被原輔材料和人為操作等因素所影響.鑒于牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題,乳品企業(yè)及牧場(chǎng)應(yīng)重視和加強(qiáng)檢測(cè)工作,應(yīng)用一些簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確性高的方法來(lái)監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量，保證消費(fèi)者的健康

10、。反應(yīng)原理 本產(chǎn)品主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的基本原理來(lái)進(jìn)行的。在整個(gè)反應(yīng)當(dāng)中,樣品中氯霉素含量越多，反應(yīng)呈色就越淡。反之，樣品中氯霉素含量越少，則呈色越深。 試劑盒組成 1、微量測(cè)試孔：每條8孔，每板12條 2、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液： 0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35 ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶 3、10倍濃縮萃取稀釋液：一瓶，30ml/瓶 4、10倍濃縮洗滌液：一瓶，30 ml /瓶 5、氯霉素酶標(biāo)記物： 一瓶，8 ml/瓶 6、底物溶液：一瓶，12 ml/瓶 7、反應(yīng)終止液：一瓶，13 ml/瓶 使用說(shuō)明 A、注意事項(xiàng) 1、使用前先

11、將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標(biāo)記物，底物溶液及微量測(cè)試孔條置于室溫下，回溫30分鐘。 2、原倍萃取稀釋液及洗滌液配制 用蒸餾水將10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別以1： 9的比例稀釋(即1mL濃縮液+9mL蒸餾水)，即可作為樣品萃取稀釋液與微孔板清洗液。 3、回溫后，取出所需微量測(cè)試孔條，將剩余板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置于4oC保存。 B、樣品制備1.待測(cè)物為生乳，則依以下方法進(jìn)行處理 (5倍稀釋) 取100ul待測(cè)生乳加入400ul萃取稀釋液，振蕩混合后備用。 2.待測(cè)物為蜂蜜，則依以下方法進(jìn)行處理 a.取2g蜂蜜、4ml蒸餾水與2ml 乙酸乙酯置入離心管中

12、，震蕩約5分鐘，使其充分混合均勻。 b.離心10分鐘(3000rpm)，取0.5ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50下氮?dú)獯蹈?溫度請(qǐng)勿超過(guò)50oC)。 c.加入0.5ml萃取稀釋液，震蕩約10秒鐘后備用。 3. 待測(cè)物為血清、則依以下方法進(jìn)行處理 a.抽取待檢動(dòng)物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。 推薦精選b.將3ml血清加入離心管中，再加入6ml乙酸乙酯，震蕩混合約30秒。 c.離心10分鐘(3000rpm)，取2ml上層液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50oC下氮?dú)獯蹈伞?d.于此玻璃管中加入正己烷2ml，先將殘余物完全溶解后，再加入1 ml萃取稀釋液，震

13、蕩約30秒鐘。 e. 離心10分鐘(3000 rpm)，用吸管吸去上層液(正己烷) 及中間乳化層部分，棄掉。再吸取下層液(水層)備用。 f.若有乳化現(xiàn)象，請(qǐng)先將大部分上層液(正己烷)取出后，再將玻璃管置入80oC水中，隔水加熱約510分鐘，可改善乳化情形。 4. 待測(cè)物為雞肉或魚、蝦，則依以下方法進(jìn)行處理 a.將3克樣品剪碎后放入50 ml離心管中，再加入6ml乙酸乙酯，并以均質(zhì)機(jī)均質(zhì)約1分鐘，再震蕩約30秒。 b.離心10分鐘(3000rpm)，取2ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50oC下氮?dú)獯蹈伞?c.于此玻璃管中加入正己烷2 ml，先將殘余物完全溶解后(若未能完全溶解，可能會(huì)導(dǎo)致回

14、收率降低)，再加入1 ml萃取稀釋液，震蕩約30秒鐘。 d.離心10分鐘(3000 rpm)，用吸管吸去上層液(正己烷) 及中間乳化層部分，棄掉。再吸取下層液(水層)備用。 e.若有乳化現(xiàn)象，請(qǐng)先將大部分上層液(正己烷)取出后，再將玻璃管置入80oC水中，隔水加熱約510分鐘，可改善乳化情形。待測(cè)物為血清、則依以下方法進(jìn)行處理 5.待測(cè)物為內(nèi)臟(肝、心等)，則依以下方法進(jìn)行處理(5倍稀釋) 同上述步驟ad，但下層液吸出后，再以萃取稀釋液稀釋5倍(即下層液50ul加萃取稀釋液200ml)。 6.待測(cè)物為飼料，則依以下方法進(jìn)行處理(10倍稀釋) 同上述步驟ad，但下層液吸出后，再以萃取稀釋液稀釋1

15、0倍(即下層液30ul加萃取稀釋液270ml)。 C、操作步驟 本產(chǎn)品的酶標(biāo)記物與氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液均直接使用，無(wú)需再稀釋。 1、于適當(dāng)微孔中分別加入100mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。 2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。 3、再于每一微孔中另再加入50mL酶標(biāo)記物。 4、輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育1小時(shí)。 5、將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。 6、最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。 7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，輕敲盤子四周，使其充分混合。 8、于室溫下避光靜置溫育

16、20分鐘。 9、于每一微孔中加入100mL反應(yīng)終止液。 10、用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm下判讀。 D、判定推薦精選1. 計(jì)算B/B0值。用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B0)再乘以100%。 2. 以B/B0值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線。 3. 根據(jù)每個(gè)樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對(duì)應(yīng)樣品的濃度。 4. 由于樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。 E、標(biāo)準(zhǔn)曲線 F、靈敏度 氯霉素試劑檢測(cè)盒的平均檢測(cè)下限為 0.05ppb，此濃度之吸光值與陰性標(biāo)準(zhǔn)溶液(0ppb)之吸光值有明顯的差異。G、 特異性 針對(duì)以下抗生

17、素進(jìn)行交叉反應(yīng)之測(cè)試，結(jié)果如下： Chloramphenicol =100% Chloramphenicol(free base) 0.1% Gentamycin 0.1% Tetracycline 0.1% Penicillin G 0.1% Sulfamethazine 0.1% H、再現(xiàn)性 針對(duì)氯霉素檢測(cè)試劑盒精密度測(cè)試，重復(fù)6次，所得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值變異系數(shù)(%CV)如圖2所示，顯示氯霉素試劑盒有很高的再現(xiàn)性: I、回收率 生乳(添加1.0ppb)104117%蜂蜜(添加0.3ppb)90110%蝦及魚肉(添加0.5ppb)95110%雞肉(添加0.5ppb) 90120%血清(添加0.5ppb)100120%內(nèi)臟(添加1.0ppb) 100120%飼料(添加2.0ppb)80110%氯霉素檢測(cè)試劑盒 簡(jiǎn)介氯霉素(Chloramphenicol)是一種廣譜抗生素。由于其具有效果好以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前已被普遍應(yīng)用于各類家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂制品的各種傳染性疾病的治療。然而氯霉素有其嚴(yán)重的副作用,它會(huì)抑制人體骨髓的造血功能，從而引起再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥。目前，我國(guó)已禁止其使用。 我公司采用國(guó)內(nèi)外先進(jìn)的工藝與技術(shù)，研發(fā)出氯霉素ELISA檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)化了樣品處理方式，使用簡(jiǎn)便，省時(shí)省力省錢，整個(gè)操作過(guò)程不到90分鐘。本產(chǎn)品檢測(cè)范圍廣(雞肉、魚、蝦、蟹、牛奶