蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法

1、蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法編制說明征求意見稿)一、任務(wù)來源本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)二0五年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)“ 20154061-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出 并歸口， 定于2016年完成。 本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、 河北農(nóng)業(yè)大 學(xué)、浙江工商大學(xué)等單位共同組成。二、目的及意義絲氨酸蛋白酶是一類裂解肽鍵的蛋白酶，其活性中心的親和氨基酸為絲氨 酸，它們?cè)谏镉袡C(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用。絲氨酸蛋白酶超家族被 分為胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶兩個(gè)大家族，蛋白酶K(EC )屬于枯草桿菌蛋白酶家族，是由林伯氏白色念球菌 (Tritirach

2、ium album Limber )產(chǎn)生的 一類主要蛋白酶。因其能消化角蛋白(kerat in)，故將其稱作蛋白酶K。蛋白酶 K 擁有典型的絲氨酸活性位點(diǎn)： Asp39-His69-Ser224 。蛋白酶 K 具有穩(wěn)定的結(jié) 構(gòu)、極高的酶活力和廣泛的底物特異性，但偏好于帶有脂肪族及芳香烴的肽 鏈，能優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端連接的肽 鍵，因而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和科學(xué)研究領(lǐng)域，也因此吸引了來自學(xué)術(shù) 界、工業(yè)和農(nóng)業(yè)團(tuán)體的研究興趣?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展依賴于生物技術(shù)用的一些酶類，這些酶對(duì)與基因工程 技術(shù)的作用，就如同 CPU 對(duì)與電腦的重要性一樣，它們是現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中

3、 用于研究和開發(fā)基因工程產(chǎn)品和分子生物學(xué)研究的最基礎(chǔ)物質(zhì)。如果我國(guó)沒有 獨(dú)立的生物技術(shù)用酶的生產(chǎn)體系，就不會(huì)有獨(dú)立的現(xiàn)代化生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。作為 一個(gè)大國(guó)，我國(guó)應(yīng)該建立自主的蛋白酶 K 生產(chǎn)體系，以適應(yīng)生物產(chǎn)業(yè)的快速發(fā) 展。在政府監(jiān)管中，標(biāo)準(zhǔn)的重要價(jià)值在于它架起了法律與科學(xué)之間的橋梁，提 高了行政決定過程的公開性與結(jié)果的準(zhǔn)確性，為規(guī)范和控制行政裁量權(quán)提供了 工具。目前我國(guó)在誠(chéng)信制度沒有健全、存在巨大經(jīng)濟(jì)利益誘惑的情況下，對(duì)于 生物產(chǎn)業(yè)的監(jiān)督，政府主管部門才是最有公信力和最能承擔(dān)責(zé)任的。因此，開 展蛋白酶 K 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究是政府實(shí)施科學(xué)監(jiān)管、有效監(jiān)管的必要技術(shù)支撐。通過研究制定基因工程常用蛋白酶 K

4、 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，有利于加快分子生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)的速度、提高分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，從而提升整體分子 生物學(xué)研發(fā)水平，產(chǎn)生廣泛的社會(huì)效益。建立我國(guó)獨(dú)立自主的蛋白酶 K 工業(yè)系 統(tǒng)，即可創(chuàng)造出可觀的經(jīng)濟(jì)效益又能解決我國(guó)目前主要依賴國(guó)外進(jìn)口蛋白酶 K 的問題，突破國(guó)內(nèi)生物技術(shù)酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展受制于人的瓶頸。要對(duì)所檢測(cè)的產(chǎn)品或 相關(guān)過程的特性進(jìn)行符合性判定，就需要制定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。要對(duì)產(chǎn)品或相關(guān)過程 的特性進(jìn)行定量檢測(cè)，就需要依據(jù)經(jīng)過科學(xué)評(píng)估的、可重復(fù)的、公認(rèn)的檢測(cè)方 法。目前，基因工程進(jìn)步如此之快，對(duì)相關(guān)的定性定量分析方法進(jìn)行全面的分 析方法的驗(yàn)證非常有必要，只有可靠穩(wěn)定的系列檢測(cè)方法才能得出可靠的結(jié)

5、果，才能保障這一新興的產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。在我國(guó)涉及蛋白酶酶活力測(cè)定方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中， 提供的方法具有普適 性，然而其各種參數(shù)設(shè)定范圍寬，針對(duì)性差。這就導(dǎo)致不同廠商的蛋白酶 K 酶 活力單位定義不統(tǒng)一， 從而無法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量做出準(zhǔn)確的判定， 繼而影響到其合理 的使用。因此，亟待系統(tǒng)研究并確定蛋白酶 K 酶活力測(cè)定體系中的各項(xiàng)參數(shù)， 以建立蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。目前，可用于蛋白酶 K 活力檢測(cè)的方 法很多，但到目前為止，國(guó)家尚未發(fā)布相關(guān)蛋白酶 K 活力檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)，這 給人們使用蛋白酶 K 帶來很大的不變，而且不同的生產(chǎn)廠家因其檢測(cè)方法不同， 故對(duì)蛋白酶 K 的酶活力定義也不同，使得使

6、用者無法對(duì)不同廠家的蛋白酶 K 活 力進(jìn)行正確的評(píng)價(jià)與比較， 為購買與使用帶來困難。 因此， 對(duì)其活性檢測(cè)方法的 需求也越來越迫切，蛋白酶 K 活性檢測(cè)方法的建立，將為更多的行業(yè)使用蛋白 酶 K 帶來很大的便利。三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則及主要內(nèi)容（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中采用文獻(xiàn)調(diào)查法、 專家座談法、 科學(xué)試驗(yàn)法等多種研究方 法，方法科學(xué)先進(jìn)、過程周密嚴(yán)謹(jǐn)、數(shù)據(jù)真實(shí)可信、結(jié)果明確。本標(biāo)準(zhǔn)是為相關(guān)組織的蛋白酶 K 檢測(cè)提供技術(shù)支撐， 考慮到生產(chǎn)、監(jiān)管等不 同需求，在方法選擇上， 主要基于產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、 現(xiàn)有成熟的技術(shù)以及試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 基礎(chǔ)確定的，因此實(shí)用性較強(qiáng)。(二) 標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)1、 標(biāo)準(zhǔn)編寫

7、遵循GB1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和 編寫規(guī)則的有關(guān)要求。2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考了與蛋白酶 K 檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)參照了 GB/T 6379.1-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第 1 部分 總則與 定義和 GB/T 6379.2-2004 測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度第 2 部分 確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量 方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。3、本標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法參考了 GB/T 28715-2012飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測(cè)定 -分光光度法和 SB/T 10317-1999蛋白酶活力測(cè)定法中的酶活 力和酶活力單位的定義和檢測(cè)流程，還借鑒了Sigma公司和Merk公司有關(guān)

8、蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的文件。同時(shí)，通過系統(tǒng)地試驗(yàn)，驗(yàn)證了適于蛋白酶 K 酶活力 測(cè)定的底物種類、反應(yīng)體系 pH 值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和酶濃度。(三) 本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)主要包括以下 7 個(gè)部分：1)范圍；2)術(shù)語和定義；3)原理；4)儀器設(shè)備及器具；5)主要試劑；6)分析步驟；7)結(jié)果分析等。四、主要工作過程一)組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂有關(guān)程序和要求， 2015年 10月下旬，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究 院主持召開了蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定研討會(huì)。會(huì)上， 組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組， 明確了任務(wù)要求， 安排了工作進(jìn)度， 成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工 作小組，會(huì)議研究討論了蛋白酶 K 酶

9、活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法初稿，對(duì)起草小 組在標(biāo)準(zhǔn)起草過程中的一些思考及難點(diǎn)問題進(jìn)行了深刻討論， 各單位代表就標(biāo)準(zhǔn) 內(nèi)容及方法選擇進(jìn)行了討論。（二）開展相關(guān)調(diào)研情況蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)屬于生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，是支撐生 產(chǎn)方、第三方組織開展產(chǎn)品評(píng)價(jià)的技術(shù)依據(jù)。 起草工作小組首先針對(duì)生產(chǎn)和檢測(cè) 開展了大量的調(diào)研工作。 從滿足實(shí)際檢測(cè)需要出發(fā)， 開展了國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料的收 集和確認(rèn)工作， 資料的檢索和信息的收集過程中， 分析比較了大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn) 方法。（三）標(biāo)準(zhǔn)起草完善過程在廣泛調(diào)查研究的基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)蛋白酶 K 酶 活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研， 課題組成員

10、廣泛收集了國(guó)內(nèi)外蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)，了解了國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)動(dòng)態(tài)，并且明確 了工作思路和進(jìn)程安排， 分析了通過前期的實(shí)驗(yàn)摸索、 反復(fù)論證， 確定了本標(biāo)準(zhǔn) 方法設(shè)定的重要參數(shù)， 開展了實(shí)際樣品的檢測(cè)。 然后依據(jù) GB/T 1.12000標(biāo)準(zhǔn) 化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則、 GB/T 1.2 2002標(biāo)準(zhǔn)化工 作導(dǎo)則 第 2部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定方法等標(biāo)準(zhǔn)編制要求， 對(duì)蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)開展了起草工作。于 2016年 3月中 旬，起草工作小組完成了 蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（草案）。 2016年 6 月，在北

11、京組織有關(guān)單位和專家分別召開了標(biāo)準(zhǔn)草案討論會(huì)，重點(diǎn)對(duì) 蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法選擇提出了完善建議。同時(shí)對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證， 針對(duì)驗(yàn)證所出現(xiàn)的問題，在 2016年 11月11組織專家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)逐字逐句進(jìn)行了討 論完善，形成了蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。五、國(guó)內(nèi)外研究概況通過測(cè)試蛋白酶 K 水解經(jīng)尿素變性的血紅蛋白的酶活性，顯示出蛋白酶 K 在pH7.5-12.0范圍內(nèi)都具有較高的酶活性。目前蛋白酶K通常使用的pH范圍是7.5-9.0,蛋白酶K的最適pH是8.0。在37C時(shí)，蛋白酶K顯示出最高的活性， 在20-60E之間蛋白酶K的酶活性可保持在80%以上。Shu-Qun

12、Liu等人探討了 蛋白酶K在催化過程中動(dòng)力學(xué)機(jī)制，提出了在蛋白酶 K的催化三分子中，Asp39 和 His69 以及 His69 和 eSer224 之間靜電和氫鍵的相互作用，使得一些在催化 過程中起到不同功能的催化殘基，具有不同的熱動(dòng)力學(xué)和取向。之后，陶燕分 別對(duì)沒有底物結(jié)合的蛋白酶 K 和結(jié)合了肽底物 AAPA 的蛋白酶 K 進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間分 子動(dòng)力學(xué)模擬，以研究底物結(jié)合對(duì)蛋白酶 K 的動(dòng)力學(xué)行為和分子運(yùn)動(dòng)特征的影 響。結(jié)果顯示，在動(dòng)力學(xué)模擬過程中，與底物結(jié)合的蛋白酶 K 比沒有底物結(jié)合 的蛋白酶 K 具有更加致密穩(wěn)定的構(gòu)象。提出了大尺度的協(xié)同運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致的底物 結(jié)合口袋動(dòng)力學(xué)行為與底物的識(shí)別、

13、結(jié)合、定位以及產(chǎn)物的釋放相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn) 底物結(jié)合口袋區(qū)域運(yùn)動(dòng)模式可以調(diào)整酶與底物之間的動(dòng)態(tài)相互作用。補(bǔ)充了前 人的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)果，從分子運(yùn)動(dòng)和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)角度闡釋了 蛋白酶K的催化機(jī)制。蛋白酶K含有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，距離酶的活性中心有一定的距離，它們 與催化機(jī)理并無直接關(guān)系，但當(dāng)用 EDTA去除Ca2*之后，催化活性將在6 h之內(nèi) 降低至原來的20%,這是由于Ca2+的去除引發(fā)了底物識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)象的改變。同 時(shí)Ca2+的去除會(huì)影響氯甲烷類較長(zhǎng)肽抑制劑的結(jié)合，提高了 48 h之后的自溶 率，降低了蛋白酶K的熱穩(wěn)定性等。蛋白酶K在抑制劑如尿素和SDS存在時(shí)仍 能保持較高的穩(wěn)定性。在除

14、去 Ca2+后其剩余活性通常不足以降解在一般情況下 污染酸制品的蛋白質(zhì)，所以蛋白酶 K消化過程中通常加入 EDTA。但是，如果 要消化對(duì)蛋白酶 K 具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有 1mmol/LCa2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA(pH8.0)至終濃度為2mmol/L，以鰲合Ca2+。蛋白酶 K 是一種絲氨酸蛋白酶，因此可以用苯甲基磺酰氟抑制其作用，苯 甲基磺酰氟是一種絲氨酸蛋白酶的抑制劑，在純化蛋白質(zhì)時(shí)用于防止蛋白質(zhì)的 降 解 。 此 外 ， Anilkumar R. Kore 等 人 合 成了 一 種 五 肽 化 合 物 ， 即 Me

15、OSuc-AAAPF-CH 2CI，可以抑制蛋白酶K的水解活性，濃度僅需要 O.ImM。 J trgen Bajorath等人用單肽或二肽氯甲基酮對(duì)蛋白酶 K進(jìn)行了處理，發(fā)現(xiàn)該化合 物對(duì)蛋白酶 K 的水解起到了一定的抑制作用?？捎糜诘鞍酌?K 活力檢測(cè)的方法有以下幾種，每種實(shí)驗(yàn)方法都有各自的優(yōu) 缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)條件來選擇適合的檢測(cè)方法。（1） 紫外可見分光度法。該法是以酪蛋白為底物，在一定pH 和溫度下反 應(yīng)后，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定 275nm 處的吸光值，從而檢測(cè)酶活力。紫外 分光光度計(jì)為目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室普遍擁有的儀器設(shè)備， 采用紫外分光光度法檢測(cè)蛋 白酶 K 活性簡(jiǎn)單易行

16、便于實(shí)施。（2） 福林酚試劑法。該法實(shí)質(zhì)上是在一定溫度，一定pH 下，一定時(shí)間 內(nèi)，蛋白酶 K 以酪蛋白或變性血紅蛋白為底物，將其水解成氨基酸，以測(cè)定氨 基態(tài)氮的量來衡量蛋白酶活力的數(shù)值， 即用分光光度計(jì)測(cè)定 68Onm 處的吸光值， 從而測(cè)定蛋白酶 K 的酶活力。該法操作簡(jiǎn)單，靈敏度較高，但測(cè)定中蛋白質(zhì)特 異性有影響， 即不同的蛋白質(zhì)因所含酪氨酸和色氨酸不同， 顯色時(shí)其強(qiáng)度稍有差 別。另外，本法受多種因素干擾， 凡對(duì)雙縮脲反應(yīng)起干擾作用的基團(tuán)以及在性質(zhì) 上是氨基酸或肽的緩沖液均可干擾福林 -酚反應(yīng)。所測(cè)氨基酸樣品若含酚類和檸 檬酸也干擾福林 -酚反應(yīng)，在測(cè)試時(shí)應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗(yàn)。（3

17、）紫外光譜定量測(cè)定法。張寒俊等人建立了用紫外光譜法定量測(cè)定蛋白 酶 K 活力的新方法：采用不同 pH 值的磷酸氫二鈉和檸檬酸溶液作為緩沖溶液， 使用紫外光譜法測(cè)定蛋白酶 K的活力。該方法與福林-酚法比較，相對(duì)偏差w 1%, 在允許誤差范圍內(nèi)，操作便捷、快速，試劑易得，可廣泛適用于蛋白酶 K 的活 力測(cè)定。（4）以 Suc-（AIa）3-NH-Np 或 Suc-（AIa）2-Pro-Phe-pNA 等試劑為底物，在 一定溫度和 pH 下反應(yīng)后用冰醋酸終止反應(yīng)， 41Onm 測(cè)吸光值確定酶解反應(yīng)釋放 的硝基苯胺的量，從而檢測(cè)酶活性。（5）以酪蛋白或牛血清白蛋白為底物，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白酶活力，

18、以水解后剩余的蛋白質(zhì)含量來表達(dá)酶的活力?？捡R斯亮藍(lán)法不能直接反應(yīng)出酶活（6）DNA/溴乙錠熒光分析法。當(dāng)溴乙錠插入雙鏈 DNA的堿基對(duì)之間時(shí)， 可使DNA的熒光性增加，其熒光增加量與DNA的量成正比。組蛋白與DNA的 親和力很強(qiáng)，組蛋白結(jié)合到 DNA的所有結(jié)合位點(diǎn)上，使溴乙錠不能與 DNA結(jié) 合，從而熒光性降低。加入蛋白酶后水解組蛋白，使熒光性增加，通過測(cè)定熒光增加量來計(jì)算酶活力。此方法雖提高了底物特異性，但其操作復(fù)雜，儀器設(shè)備和 試劑均較為昂貴，不適宜普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行酶活測(cè)定。（7）流動(dòng)注射分析法（FIA ）。用熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記底物牛血清白蛋白（BSA），然后將標(biāo)記的BSA偶聯(lián)到2-F-1

19、甲基吡啶（FMP）活化的分離膠上， 制成分析柱，當(dāng)酶液流過分析柱時(shí)，將 BSA上的熒光基團(tuán)解離下來，通過熒光 光度計(jì)檢測(cè)酶解流出液的熒光強(qiáng)度來測(cè)定蛋白酶活力。該方法測(cè)定酶活力時(shí)所具有的優(yōu)缺點(diǎn)同（6）所示。六、關(guān)鍵試驗(yàn)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)說明6.1主要儀器與設(shè)備721G型可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司），單孔四列型電熱 恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司），PHS-3DW型pH計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司），GL-20G衛(wèi)型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）等。6.2主要材料與試劑（1）底物：酪蛋白（Solarbio公司），角蛋白（梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司），血紅蛋白（源葉生物公

20、司），組蛋白，牛血清白蛋白（BSA），明膠。（2） 蛋白酶：蛋白酶K，堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，胰蛋白酶，a 胰凝乳蛋白酶。（3） 其它試劑：L-酪氨酸，三氯乙酸（TCA ），無水碳酸鈉，三羥甲基氨基甲烷（Tris）， 磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，濃鹽酸，福林試劑（2N），化學(xué)試劑均為分析純。6.3主要試驗(yàn)方法酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線參考GB/T 28715-2012分光光度法測(cè)定。精確稱取預(yù)先于 105 C干燥至恒重的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1000 g 0.0002g,用1 mol/L鹽酸溶液20 ml溶解后，用 蒸餾水定容至100 ml，即為1 mg/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（04C保存）。

21、準(zhǔn) 確吸取1 mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液10.0 mL,用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL，即得到100卩g/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。按表1配置L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液。表1 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配置編號(hào)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度（口 g/m）酪氨酸儲(chǔ)備液體積（ml）蒸餾水體積（ml）00010.0110.01.09.0220.02.08.0330.03.07.0440.04.06.0550.05.05.0660.06.04.0770.07.03.0880.08.02.0990.09.01.010100.010.00分別吸取L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1.0 ml于具塞試管中（每個(gè)濃度作

22、2個(gè) 平行試驗(yàn)），各加碳酸鈉溶液5.0 ml和稀福林試劑1.0 ml，震蕩均勻。同時(shí)置于 在40 C水浴鍋中顯色20 min。取出，迅速冷卻至室溫，于分光光度計(jì)波長(zhǎng)680 nm下測(cè)其吸光值，以0號(hào)管作為空白調(diào)儀器零點(diǎn)。以橫坐標(biāo)為L(zhǎng)-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度C （卩g/mL），縱坐標(biāo)則為吸光值 A680繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如下圖1所示。L酪氨酸濃度CMg/mL) ilie coucciLLriiLiu口 of L-Lyiosuie圖1 L酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物的確定底物溶液的配制由于不同的蛋白質(zhì)底物的溶解性不同，故不同的底物溶液配制方法有差異。 除測(cè)定堿性蛋白酶的底物用0.1 mol/L的

23、硼酸緩沖液（pH 10.0）配制以外，測(cè)定 其他蛋白酶的底物均用磷酸緩沖液（PBS配制。（1）1%酪蛋白溶液，1%明膠溶液準(zhǔn)確稱取酪蛋白/明膠1.000 g,精確到0.001 g,加入0.1 mol/L氫氧化鈉5.0 mL濕潤(rùn)后，再加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH為受試酶的最適pH） 80 mL，于 磁力攪拌器上邊加熱邊攪拌30 min，直至完全溶解。冷卻后，用 0.1 mol/L鹽酸 或0.5 mol/L氫氧化鈉，單向調(diào)整pH至磷酸緩沖液pH值，并轉(zhuǎn)移到100 mL容 量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度。4 C冷藏備用。（2）1%角蛋白溶液用0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH為受試酶的

24、最適pH）將5%濃度的角蛋白試 劑稀釋至1%, 4 C冷藏備用。（3）1%血紅蛋白溶液，1%BSA容液，1%組蛋白溶液分別準(zhǔn)確稱取血紅蛋白，BSA 組蛋白1.000 g,用0.1 mol/L的PBS（pH為 受試酶的最適pH）溶解并定容至100 mL, 4 C冷藏備用。6.322蛋白酶溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取待測(cè)蛋白酶0.0010 g,以0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH為受試 酶的最適pH,見表2）配制成1.0 mg/mL的樣品酶液，再稀釋至適宜的濃度作為 待測(cè)酶液。6種蛋白酶的最適反應(yīng)溫度及 pH見表2。表2受試蛋白酶的最適反應(yīng)溫度與pH酶種類蛋白酶K木瓜蛋白酶菠蘿蛋白酶a胰凝乳蛋白酶胰蛋

25、白酶堿性蛋白酶反應(yīng)溫度/C374055373745pH7.56.07.27.28.010.0注：中性蛋白酶以磷酸緩沖液配制并稀釋至適宜濃度，堿性蛋白酶以硼酸緩沖液配制并稀釋。蛋白酶活力檢測(cè)方法參考GB/T 28715-2012分光光度法測(cè)定6種蛋白酶酶活力。底物種類對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響選擇適宜濃度的蛋白酶K溶液，分別以酪蛋白，角蛋白，血紅蛋白，BSA組蛋白為底物，于37 C下反應(yīng)10 min,測(cè)定酶活力；以相應(yīng)底物對(duì)其他蛋白酶 酶活力測(cè)定的影響為對(duì)照，研究底物種類對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響。各種蛋 白酶反應(yīng)的最適溫度和pH參照表2。蛋白酶K酶活力測(cè)定的最適pH值的確定（1）配制 0.1

26、mol/L 的磷酸緩沖液（ pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），并以各 pH 值緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K溶液（0.01mg/mL），按照 6.323方法在37 C水浴中反應(yīng)10 min后，離心后取上清液，顯色，檢測(cè)酶活力。（2）配制 0.01 mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液（ pH 7.1、7.5、8.0、8.5、8.9），并 以各pH值緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K溶液（0.01mg/mL）， 按照方法在37 C水浴中反應(yīng)10 min后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)酶 活力。6.3.4 蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的最適溫度的確定（1）在以上

27、試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以 pH 8.0 的 0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液分別配制牛 血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL），按方法，分別在 27C、37C、47C、57C, 67C水浴10 min之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè) 蛋白酶酶活力。（2）在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以 pH 8.0 的 0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液分別配制牛 血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL），按方法，分別在 52C、57C, 62C水浴10 min之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶活力。6.3.5 蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間的確定在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上

28、， 以 pH 8.0的 0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液分別配制牛血紅 蛋白溶液（1%）與蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL），按方法，在57C分別 水浴反應(yīng) 2， 5 ， 8 ， 10 ， 12 min 之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶 活力。6.3.6 蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的適宜酶濃度的確定以 pH 8.0的 0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（ 1%）與 蛋白酶 K 酶液（0.25，0.05，0.01，0.002 mg/mL）,按 方法，在 57C 分 別水浴反應(yīng) 10 min 之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶活力。6.3.7

29、 商品蛋白酶 K 制劑酶活力測(cè)定驗(yàn)證以 pH 8.0的 Tris-HCl 緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶 K 酶液（0.01 mg/mL），蛋白酶 K 分別來自 Solarbio，國(guó)產(chǎn)蛋白酶 K, Merck, Calbiochem 公司。按方法，在57E分別水浴反應(yīng)10 min之后，離心后取上清液顯色， 檢測(cè)蛋白酶 K 酶活力。6.3.8 蛋白酶酶活力計(jì)算酶活力單位定義：在蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和 pH條件下，1 min水解蛋白 質(zhì)底物釋放1卩mo顯色呈福林試劑陽性的氨基酸的酶量， 即為1個(gè)酶活力單位, 以U表示。酶活力計(jì)算公式：從L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的最終稀釋液酶活力。

30、樣 品的酶活力按下式計(jì)算:A 4 V n 1M m 10X:樣品酶活力（U/g）; A:由L酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出的最終稀釋液酶活力（U/mL）; V:溶解樣品所使用容量瓶的體積（mL）; 4:反應(yīng)體系試劑的總體 積（mL）; n：樣品的稀釋倍數(shù)；M : L酪氨酸的摩爾質(zhì)量（181.20 g/moL）; m: 樣品的質(zhì)量（g）; 10:反應(yīng)時(shí)間（min）。639重復(fù)性與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)試驗(yàn)取兩份平行樣，每批試驗(yàn)以相同步驟進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。使用 MicrosoftExceL97-2003工作表處理數(shù)據(jù)。6.4主要試驗(yàn)結(jié)果蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物的確定密魚仙1if-5falnn圖2酪蛋白對(duì)蛋白酶K酶活

31、力測(cè)定的影響根據(jù)圖2,與其他底物測(cè)得的酶活力相比，在以酪蛋白為底物時(shí)，蛋白酶 K和其他5種蛋白酶測(cè)得的酶活力均最高TfflQ G o o o 初 NoA E-S2豈圖3角蛋白對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖3,表明角蛋白能較好地反映出微生物蛋白酶（堿性蛋白酶和蛋白酶K）酶活力，而不能反映出植物源蛋白酶（菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶）酶活力。KI2BieRffiO 取fl圖4血紅蛋白對(duì)蛋白酶 K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖4,以血紅蛋白為底物基本能反映蛋白酶 K的酶活力，而不能完全反 映其它蛋白酶酶活力，可用于蛋白酶 K酶活力測(cè)定的底物，且其具有特異性。-1QOO L-UWP5U.口宙0匕匹礎(chǔ)蚩臺(tái)關(guān)種戔亡L

32、izyspecies圖5組蛋白對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖5,以組蛋白為底物時(shí)，各種蛋白酶測(cè)得酶活力極低，蛋白酶K，堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶酶活力甚至呈現(xiàn)負(fù)值。因此，組蛋白不適宜作為蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物。* -X-.E2 LUJ.S-C魁圖6明膠對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖6,以明膠為底物時(shí)，各種蛋白酶測(cè)得酶活力極低，除了胰凝乳蛋白 酶顯示了極低活性，蛋白酶K酶等其它五種蛋白酶活力均呈現(xiàn)負(fù)值。因此，明膠 也不適合作為蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物。200 rIOC圖7 BSA對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖7,以組BSA為底物時(shí)，蛋白酶 K酶活力較低（137 U/g），其相對(duì)酶活力 僅為2.09%，不足以展現(xiàn)蛋白酶 K的酶活力。因此，BSA也不適宜作為蛋白酶 K酶活 力測(cè)定的底物。綜合圖2至圖7的試驗(yàn)結(jié)果，在測(cè)定蛋白酶K酶活力時(shí)，可選擇角蛋白或血紅蛋白 作為底物。結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外