獸醫(yī)傳染病試驗

1、實驗二 病料的采集、保存及送檢一、目的 掌握被檢病料的采取、保存、送檢的方法。二、材料 實驗動物（雞）、瓷盤、剪子、鑷子、酒精燈、酒精、接種環(huán)、載玻片、 火柴棒等。三、病料的采取1. 采取病料的基本原則（1）采集最適病料 理想的病料，應(yīng)是無菌采取的含病原微生物量高的血液、器官組 織或分泌物和排泄物。因此要根據(jù)疾病的病性采取合適的病料，如無法估計是何種疾病 時，應(yīng)根據(jù)臨床癥狀和病理變化采集病料或全面采取病料。取材時應(yīng)注意病原微生物感 染所致疾病的類型 （ 如呼吸道感染疾病、胃腸道感染疾病、皮膚和粘膜性疾病、敗血性疾 病等 ） 、病原微生物的侵入部位、病原微生物感染的靶器官等。細(xì)菌檢驗病料應(yīng)當(dāng)是采

2、自 未經(jīng)抗菌藥物治療的患病動物，并且應(yīng)多做幾張涂片。（2）適時采集 采集病料的時間一般在疾病流行早期、典型病急性期，此時病原微生。內(nèi)臟病物的檢出率高；后期由于體內(nèi)免疫力的產(chǎn)生，病原微生物減少，檢測病原微生物比較困 難，同時可能出現(xiàn)交叉感染，增加判斷的困難性。在采集供抗體測定用的血清時，可適 時地采集急性期和恢復(fù)期的兩份血清樣品，一般兩份血清的間隔時間為142ld料的采取，須于動物死后立即進(jìn)行；夏季最遲不超過46h,冬天不超過24h，否則時間過長，由腸內(nèi)侵入其他細(xì)菌，致使尸體腐敗，有礙于病原菌的檢出。供做切片的樣品采 取后必須立即投入固定液，否則時間過長，會使細(xì)菌和組織細(xì)胞死亡、溶解，影響檢驗結(jié)

3、果。 有條件做現(xiàn)場培養(yǎng)時， 剖開尸體后應(yīng)進(jìn)行接種培養(yǎng)， 然后采樣， 最后剖檢 。（3）無菌操作 采集病料所用的器械及容器要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒：刀、剪、鑷子等金屬用具可煮沸消毒30min，使用前最好用酒精擦拭，并在火焰上燒一下；器皿（玻制、陶制 及琺瑯制等）在高壓滅菌器或干烤箱內(nèi)滅菌；軟木塞和橡皮塞應(yīng)高壓滅菌；載玻片用2%5%碳酸鈉煮沸消毒510min，煮沸后用清水沖洗干凈，拭干保存或浸泡于95%酉精中以備使用；注射器和針頭放于清潔水中煮沸30min即可，或用一次性注射器。病料采取過程都應(yīng)該無菌操作，盡量避免雜菌污染。采取一種病料，使用一套器械，或器械酒精擦拭火 焰滅菌后再采取另一種病料；一種病料放

4、入一種容器，不可混放。（4）剖前檢查 若有突然死亡或病因不明的尸體， 須先采取末梢血液制成涂片， 鏡檢， 觀察是否有炭疽桿菌存在。若疑似炭疽時，不得進(jìn)行解剖；如需要剖檢并獲取病料時， 應(yīng)經(jīng)上級有關(guān)部門同意，選擇合適的場地，做好嚴(yán)格的防范工作，剖后要進(jìn)行嚴(yán)格的消 毒處理。只有在確定不是炭疽后，方可進(jìn)行剖檢。2. 病料采集的方法（ 1 ）液體材料 一般用滅菌棉拭子采取破潰的膿汁、鼻液、陰道分泌物與排泄物。 未破的膿腫、胸水、腹水在皮膚表面消毒后，用無菌注射器抽取。（ 2）血液 無菌采取血液，供病原培養(yǎng)、抗體檢測和血液檢查之用。體型較大的單 蹄和偶蹄類動物少量血樣可以從耳背靜脈采血；毛皮動物少量采血

5、可通過耳殼外側(cè)靜脈采??；鼠類可以通過尾尖、耳背靜脈、眼窩內(nèi)血管采血；兔可從耳背靜脈、頸靜脈、心 臟等處采血；鳥類可以從肘關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)的翅靜脈、跖部內(nèi)靜脈或心臟采血。（ 3）乳汁 乳房先用消毒藥水洗凈（取乳者的手也應(yīng)事先消毒），并把乳房附近的 毛刷濕，最初所擠的34股乳汁棄去，然后再采集 10ml左右乳汁于滅菌試管中。若僅供 顯微鏡直接染色檢查，則可于其中加入0.5%的福爾馬林液。（ 4）淋巴結(jié)及內(nèi)臟組織 應(yīng)在尸體解剖后立即采取。將淋巴結(jié)、肺、肝、脾及腎等 有病變的部位各采取12cm的小方塊，分別置于滅菌容器中，并盡可能采取有病變及病 變交界處的部位。（5）胃腸及內(nèi)容物 可將胃腸剪下，兩端扎好，送往

6、實驗室。或用燒紅的器具燒烙 表面后穿一小孔，用滅菌棉拭子取其內(nèi)容物，放入無菌的器皿內(nèi)或放入裝有生理鹽水或 PBS勺試管內(nèi)。（6） 腦、脊髓 按病理解剖方法取出腦、脊髓。取一部分放入10%福爾馬林溶液的瓶中，供組織學(xué)檢查；一部分放入50%甘油生理鹽水瓶中，供微生物學(xué)檢查。或者將頭部取下，用塑料口袋包好直接送檢。（ 7）膽汁 先用燒紅刀片或鐵片燒烙膽囊表面，再用滅菌細(xì)管或注射器刺入膽囊內(nèi) 吸取膽汁，置于滅菌試管中。（8）皮膚鹽水溶液中，或（9）骨頭然后包于浸過 5%石炭酸水或 0.1%升汞液的紗布或麻布中， 裝于木箱內(nèi)送到實驗室。去大小約10 x10cm的皮膚一塊，保存于 30%甘油緩沖溶液中，或

7、10%包和 10%福爾馬林液中。需要完整的骨頭時， 應(yīng)將附著的肌肉和韌帶等全部除去， 表面撒上食鹽，將流產(chǎn)胎兒及小動物尸體包入不透水塑料薄膜、油紙30ml（10） 流產(chǎn)胎兒及小動物尸體 或油布中，裝于木箱內(nèi)送到實驗室。二、病料的保存NaCl1. 常用保存劑的配制 （1）30%甘油緩沖溶液 純中性甘油1.0g1.5ml0.5g堿性磷酸鈉0.02%酚紅中性蒸流水加至100ml混合分裝后，0.105Mpa 咼壓火菌 30min(2) 50%甘油緩沖鹽水溶液NaCl2.5g酸性磷酸鈉0.46g堿性磷酸鈉10.74g純中性甘油150ml中性蒸流水150ml混合分裝后，0.105Mpa高壓滅菌30min(

8、3) 10%畐爾馬林溶液取福爾馬林10ml加入蒸餾水90ml即成。(4) 飽和鹽水溶液取一定的蒸餾水加入純 NaCI，不斷攪拌至不能溶解為止(一般 為38% 39%左右)，然后用濾紙過濾。(5) 雞蛋生理鹽水溶液先將新鮮雞蛋的表面用碘酒消毒，然后打開內(nèi)容物傾入滅菌的三角瓶中，加入滅菌鹽水(占總量的10%)，搖勻后，用無菌紗布過濾，然后加熱至5658 C 30min，第2d及第3d按上法再加熱一次，即可應(yīng)用。2. 常用保存方法( 1)液體病料 檢查抗體用的血液，不加抗凝劑，待凝血后，分離血清放入青霉素 小瓶中。供病原分離培養(yǎng)用的液體病料，同容器一起放入有冰的保溫瓶或4C冰箱內(nèi)。(2)供細(xì)菌學(xué)檢驗

9、的實質(zhì)臟器 若12d內(nèi)能送到實驗室，可放在有冰的保溫瓶或 冰箱內(nèi)，也可放入滅菌液體石蠟或 30%甘油緩沖鹽水內(nèi)。如無冰，也可在保溫瓶內(nèi)放氯化 銨500g加水1500ml，使保溫瓶內(nèi)保持 OC左右達(dá)24h。( 3)供病毒學(xué)檢驗的實質(zhì)臟器 應(yīng)盡快送檢，如不能即刻送檢而需要保存時，必須 保持在冷的環(huán)境中，48h內(nèi)送到實驗室。一般放在 50%甘油緩沖鹽水溶液或雞蛋生理鹽水 溶液中，4C保存最好，原因是凍化過程能使病毒破壞。如需保存較長時間才能進(jìn)行檢查，最好放在一 20 C以下或干冰中保存。(4)病理組織病料 采取的病料立即放入 10倍體積的 10%福爾馬林溶液或 95%100% 酒精中，如用10%畐爾

10、馬林溶液固定組織時，經(jīng)24h應(yīng)重?fù)Q新鮮液一次。神經(jīng)系統(tǒng)組織(腦、 脊髓等)，需固定于 10%中性福爾馬林溶液內(nèi)(福爾馬林溶液的總?cè)莘e中加入5%10%碳酸鎂) 。在寒冷季節(jié)， 為了避免病料凍結(jié)， 在運送前， 可將預(yù)先固定的病料置于含有 30% 50%甘油的 10%福爾馬林溶液中。三、 病料的送檢 供細(xì)菌檢驗用的病料，要防止腐敗，必須及時送檢。一般可用有 冰塊的保溫瓶或其他低溫條件，以使病料不腐敗。最好由專人送檢，并帶好送檢的有關(guān) 病情、病例、剖檢等記錄，以供檢驗人員的參考。為避免散播病原，盛有病料的容器，瓶口要蓋緊，用膠布封好或石蠟封固，并用消 毒液充分擦拭容器的表面。瓶上加貼標(biāo)簽，注明樣品來源

11、、種類、保存方法、采集時間 等。為避免病料外漏，應(yīng)立放于金屬筒內(nèi)，填塞防震填充料 （ 木屑、紙渣、稻草、塑料泡 沫的渣屑等 ） 。實驗三 免疫接種一、目的 掌握免疫接種的方法和步驟，熟悉生物制劑的保存、運送和用前檢查方法。二、內(nèi)容及方法（一）免疫接種的方法 按疫苗使用說明的方法接種， 常用以下幾種方法。1.注射免疫 操作簡單，劑量準(zhǔn)確。（1）皮下注射法 部位：馬、牛等大家畜在頸側(cè)，豬在耳根后方，家禽在胸部、大腿內(nèi)側(cè)。先剪毛， 用酒精或碘酒消毒，然后注入藥液。優(yōu)點：操作簡單，吸收較皮內(nèi)快。 缺點：使用劑量多，反應(yīng)較皮內(nèi)大。 用途：疫苗和免疫血清。（2）肌肉注射法 部位：馬、牛、豬、羊在臀部和頸部

12、，家禽在胸部。先剪毛，用灑精或碘酒消毒， 然后把針頭刺入肌肉，注入藥液。優(yōu)點：操作簡單，吸收快。 缺點：一個部位不能大量注射，臀部接種不當(dāng)時易引起跛行。 用途：疫苗和血清。（3）皮內(nèi)注射法部位：馬在頸側(cè)、眼瞼，牛羊在頸側(cè)、尾根、肩胛中央，豬在耳根，雞在肉髯。優(yōu)點：用量較少，反應(yīng)?。ǜ弊饔眯。?，免疫力高（同量與皮下相比） 。缺點： 用途：痘苗和診斷液。 （4）靜脈注射 部位： 優(yōu)點：缺點：比較麻煩。馬牛羊在頸靜脈，豬在耳靜脈，雞在翼下靜脈。 使用劑量大，見效快，可及時搶救病畜。 比較麻煩，易引起過敏反應(yīng)（接種異種動物血清時，即血清病）免疫血清。雞新城疫、 雞痘疫苗常用此法接種， 選定翅內(nèi)側(cè)無血

13、管處， 用刺種針 或鋼筆尖蘸取疫苗刺入。3.滴鼻或點眼法 用滴管吸取疫苗滴在鼻孔內(nèi)或眼結(jié)膜。4.口服法用法：將疫苗混入飲水或拌入飼料通過飲水或采食經(jīng)口免疫。必須注意，飲水免疫用途：2.皮膚刺種法前要停水46h,稀釋疫苗的水要純凈，尤其不能用含有消毒劑的水稀釋疫苗；用于拌疫苗的飼料要新鮮，不宜用酸敗或發(fā)酵飼料，大小動物要分開喂，使其能均勻吃到含疫苗優(yōu)點：省時、省力。 缺點：每頭(只) 5.噴霧法(1)使用儀器劑量不準(zhǔn)。的飼料；口服免疫前后 24h 不得飲用任何消毒藥物，用活菌制劑時不能應(yīng)用抗菌藥物。氣霧發(fā)生器。壓力為2kg/cm疫苗的運送 要求包裝完善， 防止碰壞瓶子和散播活的弱毒病原體， 因此

14、， 運送疫 苗，逐瓶包裝，然后裝箱。弱毒疫苗(活疫苗)一般要求“冷鏈”運送，即需要冷藏工 具如冷藏車、冷藏箱、保溫瓶等，以免其性能降低或喪失。嚴(yán)防在高溫和日光下運輸。 滅活苗運送中也要防止凍結(jié)和曝曬。 疫苗的用前檢查 玻璃瓶或安瓿應(yīng)無破損， 瓶塞應(yīng)密封； 瓶簽上記載的名稱、 批號、 有效期、容量、檢查號碼及使用方法等必須清楚；藥品色澤及其物理性狀必須和藥品說 明書上記載相符合，否則不得使用。(三) 免疫接種的組織工作 接種時的組織工作是特別重要的，因為它可以決定全部措施的結(jié)果和成效。接種時 組織工作如下：1 .進(jìn)行免疫接種時， 應(yīng)事先取得當(dāng)?shù)貓觥?隊等領(lǐng)導(dǎo)的支持， 并商請給以人力物力等保 證。

15、并向有關(guān)人員宣傳免疫接種的基本知識和注意事項等。2. 組織好接種人員，準(zhǔn)備好場地和保定工具。3. 編訂全部注射家畜的登記表冊，進(jìn)行編號， 避免錯亂而造成重復(fù)注射。 (使70%的微粒在110um)。( 2)分類動物進(jìn)入室內(nèi)，關(guān)閉門窗，噴頭由門窗縫伸入，與動物頭部同高，室內(nèi)氣霧免疫 持續(xù) 20 30min。四周有矮墻的圈內(nèi)，噴頭與動物頭同高，人員要走動，站上風(fēng)，數(shù)室外氣霧免疫 分鐘。注意 操作者要防護(hù)自己，帶大而厚的口罩穿工作服，膠靴，如出現(xiàn)癥狀，及( 3 )時就醫(yī)。影響因素 霧化粒子大小 1 1 0um ，如過大被鼻粘膜阻止，過小吸入后被絨毛 風(fēng)力、風(fēng)速；溫度、濕度。優(yōu)點 省時、省力。適于大群動

16、物免。缺點 需要的疫苗數(shù)量多。( 4 ) 運動排除；( 5 ) ( 6 )(二) 疫苗的保存、運送和用前檢查1. 疫苗的保存 按說明保存。一般弱毒疫苗保存在 一15C以下，滅活疫苗在410C。（四）預(yù)防接種的注意事項1. 根據(jù)當(dāng)?shù)貍魅静〉陌l(fā)生和流行情況，選擇適合本地的有效疫苗。2. 接種前應(yīng)對接種畜群進(jìn)行詳細(xì)檢查和了解，凡體質(zhì)過于瘦弱、年幼、孕母畜（尤其是臨產(chǎn)母畜） 、泌乳期母畜或產(chǎn)卵期家禽及有慢性病的， 一般情況下均不應(yīng)注射。3. 準(zhǔn)備好各種物品，如疫苗、注射器、針頭、酒精、碘酊、脫脂棉、煮沸消毒器、登 記表格等。注射針頭盡可能做到每注射一頭動物換一個針頭，用完要經(jīng)消毒后再用。吸 取藥品時，

17、先除去封口上的火膠或石蠟，用酒精棉擦凈瓶塞，然后把消過毒的針頭插入， 用注射器吸取藥液。一次不能吸完時，不要把針頭拔出，用酒精棉球包裹，以便繼續(xù)吸 取。不用已注射過的針頭吸取，以免污染。注射工具（注射器、針頭、鑷子等 ）用前要煮沸消毒。用畢后浸泡于消毒溶液內(nèi)， 時間至少 lh ，洗凈揩干用白布分別包好保存。4. 所用疫苗應(yīng)按規(guī)定的稀釋倍數(shù)用生理鹽水、蒸餾水或瓶簽上規(guī)定的稀釋液進(jìn)行稀 釋。稀釋了的疫苗必須當(dāng)天用完，否則廢棄。5. 接種弱毒活菌苗前后 5 天，停止使用對菌苗菌株敏感的藥物。以免影響免疫效果。6. 要做好預(yù)防接種的詳細(xì)記錄，包括接種日期、動物品種、年齡、數(shù)量、所用疫苗的名稱、廠名、批

18、號、生產(chǎn)日期及有效期、稀釋劑及稀釋倍數(shù)、接種方法、操作人員等。7. 接種后，要注意觀察畜群接種反應(yīng)（包括正常的及異常的反應(yīng)），如有不良反應(yīng)或發(fā)病等情況，應(yīng)根據(jù)具體情況采取適當(dāng)措施（如治療） ，疫苗接種經(jīng)過一定時間后，應(yīng)檢 查免疫效果，以便及時發(fā)現(xiàn)問題。8. 工作人員注意自己的防護(hù)， 需穿工作服及膠鞋， 必要時戴口罩。 工作前后均應(yīng)洗手 消毒，工作中不應(yīng)吸煙和吃食物。9. 針筒排氣溢出的藥液， 應(yīng)吸積于酒精棉花上， 并將其收集于專用瓶內(nèi)， 用過的酒精 棉或碘酒棉和未使用完的藥液等，應(yīng)集中后燒毀之。一、目的 于疾病的治療；實驗四 藥敏試驗要求掌握藥物敏感性試驗的操作技術(shù)，達(dá)到選擇最適合的抗菌藥物，

19、用 了解某地致病菌的耐藥性的變遷情況； 識別真假抗菌藥。二、原理敏試驗，有的以抑制細(xì)菌生長為評定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，測定抗菌藥物在體外對病原微生物的生長有無抑制作用的方法，稱為藥有的則以殺滅細(xì)菌為標(biāo)準(zhǔn)。1. 稀釋法 以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列的不同倍數(shù)稀釋，經(jīng)培養(yǎng)后觀察最低抑菌濃度 （minimal inhibitory concentration或 MIC） 。常用試管法。2. 擴(kuò)散法 將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi) 向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此敏感細(xì)菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長受到抑制， 形成一個抑菌圈。常用紙片法、挖洞法。三、材料與

20、試劑1. 含細(xì)菌的病料2. 藥敏紙片 購買標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片；或自制藥敏紙片：取直徑 6mm的無菌濾紙片，浸于一定濃度的抗菌藥液（藥液配制見表，根據(jù)需要稀釋藥液）中。一般每毫升藥液中浸濾紙片 100片，浸泡 12h 后干燥備用，藥劑維持 12個月有效。SS瓊脂）。試管、平皿、酒精燈、鉑金耳、鑷子等。3. 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂（或4. 其他 滅菌棉拭子、四、擴(kuò)散法操作步驟（1）細(xì)菌分離、鑒定將病料直接接種到麥康凱瓊脂或營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)24h，鑒別。2）增菌培養(yǎng) 吊取12個菌落，接種于2ml液體培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)16h或6h。稀釋培養(yǎng)物培養(yǎng)16h的用生理鹽水1000倍稀釋，6h的10倍稀

21、釋或不稀釋。4）涂菌 用滅菌的棉拭子蘸取細(xì)菌培養(yǎng)液或稀釋的菌液，擠壓，致密而均勻地涂 布到培養(yǎng)基表面。 （或用經(jīng)火焰滅菌的接種環(huán)， 挑取細(xì)菌的純培養(yǎng)物 （量要適當(dāng)多一點） 以劃線接種方式涂布到培養(yǎng)基表面。也可挑取待試驗細(xì)菌在少量生理鹽水中制成細(xì)菌混 懸液，再用滅菌的棉拭子蘸取菌液）。（5）貼藥敏紙片 用滅菌尖頭鑷子，鑷取已制備好的各種干燥抗菌藥紙片，分別貼 到培養(yǎng)基表面（為了貼緊可用鑷子按一下紙片）。紙片在培養(yǎng)基上的分布，一般在中央 貼一種紙片，這樣一只平板（90m命可貼67個抗菌藥紙片。如果藥敏紙片沒有標(biāo)記， 在每貼一種紙片后， 應(yīng)在平板底的對應(yīng)部位上， 用蠟筆藥品名或貼上標(biāo)簽。(6)作用

22、將貼紙片的平板底部向上，置37C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,取出觀察結(jié)果。五、結(jié)果與判定標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)培養(yǎng)后，有抑菌能力的抗菌藥物，在紙片周圍出現(xiàn)一個無 菌生長的圓圈，稱為抑菌圈。抑菌圈越大，說明該菌對藥敏感性越大，若無抑菌圈，則 說明該菌對此藥具有耐藥性。判定結(jié)果時，應(yīng)按抑菌圈直徑大小(mm來判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。一般抑菌圈直徑20mm以上為極敏，1520mm為高敏，1015mm為中敏，10mm以下為低敏，無抑菌圈 為耐藥。實驗五 布氏桿菌病檢疫、目的掌握平板和試管凝集實驗的操作方法和結(jié)果的判定。二、試劑和材料抗原：由獸醫(yī)生物藥品廠供給。使用時用稀釋液按說明書稀釋，長霉或出現(xiàn)凝集塊 的抗原不能使用。待檢血清

23、： 必須新鮮， 無嚴(yán)重溶血和明顯蛋白凝塊， 無腐敗氣味。 血清采集后應(yīng)在 1 2d內(nèi)送到實驗室，不能按期送達(dá)者，需加入石炭酸防腐，每0.9m1血清加5%石炭酸0.1ml ,立即震蕩混合。陽性血清和陰性血清：由獸醫(yī)生物藥品廠供給。稀釋液： 0.5%石炭酸生理鹽水，用化學(xué)純石炭酸與氯化鈉配制，經(jīng)高壓滅菌后備用。檢疫羊時用0.5%石炭酸10%NaC溶液。其他 試管、吸管、玻璃板、火柴棒。三、操作方法1 .試管凝集反應(yīng)(1 )加稀釋液于試管架上置7支小試管，第1管加2.3ml、第25管加0.5ml 0.5%石炭酸生理鹽水。(注：第一管理加 0.5ml 稀釋液，待檢血清直接是 1：6.25 的濃度。)(

24、2) 稀釋待檢血清及加陽、陰性血清吸取待檢血清0.2ml加入第1管中，吸吹混合 3次后棄去1.5ml，再吸0.5ml移于第2管中，如前法吸吹混合 3次吸出0.5m1加入第3管，此 法稀釋至第 4管，混勻后棄去 0.5ml 。第五管不加血清為抗原對照。第六管加 1:12.5 的陽 性血清 0.5ml 。第七管加 1:12.5 的陰性血清 0.5ml 。(3) 加稀釋抗原每管加入0.5%石炭酸生理鹽水稀釋抗原0.5m1,充分振搖混合。1:25 、1:50 、1:100、1:200 。第14管待檢血清的稀釋倍數(shù)依次為(4) 作用置37 C溫箱中感作4h，再移出放室溫下1824h,然后觀察并記錄結(jié)果。

25、(5) 判定標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果判定根據(jù)各管中液體的清朗程度和管底沉淀物的形狀可予判100%凝集。定。+：液體完全透明，菌體完全凝集呈傘狀沉于管底，為+：液體基本透明， 略有混濁， 菌體大部分被凝集沉于管底，為75%凝集。+：液體半透明，管體有明顯的凝集沉淀，為50%凝集。+：液體透明度不明顯或不透明，管底有不甚顯著的沉淀或僅有沉淀的痕跡，為 凝集。- ：液體不透明，管底無沉淀，不凝集。 根據(jù)試驗結(jié)果，可以確定血清的凝集價，以出現(xiàn)“+”以上凝集的最高血清稀釋度為血清的凝集價。鹿、駱駝、牛等大動物凝集價 1:100 以上，狐、犬、羊等中小動物凝集 價1:50 以上為陽性。大動物 l:50 、中小動物 1:

26、25 為可疑?？梢烧甙朐潞蟛裳貦z， 2次可 疑者判為陽性。( 6)注意事項 待檢血清稀釋時：牛、馬、駱駝等大動物為1:50 ，1:100 ，1:200,l:400 四個稀釋度；豬、羊、犬等中小動物為 1:25 ，1:50 ，1:100 ，1:200 四個稀釋度。大規(guī)模檢疫時也可用 兩個稀釋度，即牛、馬、駱駝等大動物為1:50和1:100 ；豬、羊、犬等中小動物為 1:25 和1:50 。2. 平板凝集反應(yīng)(虎紅平板凝集試驗)(1) 取潔凈玻板一塊。(2) 吸取虎紅抗原0.03m1和待檢血清，用牙簽混勻。(3) 4-5min 觀察結(jié)果。(4) 結(jié)果判定100%凝集。即75%凝集。50%凝集。2

27、5%凝集。+: 出現(xiàn)大的凝集塊，液體完全透明，即 +: 有明顯的凝集片，液體幾乎完全透明， +：可見有凝集片，液體不甚透明，即 +：液體混濁，有少量凝集顆粒，即- ：液體均勻混濁。實驗六 雞新城疫（ ND ）抗體檢測（微量血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）一、目的 掌握病毒的紅細(xì)胞凝集試驗和凝集抑制試驗的操作方法。二、材料 96 孔型微量反應(yīng)板、微量移（加）液器（或滴管） 、稀釋棒、微型混合振 蕩器、雞新城疫抗原、待檢血清（或卵黃液） 、生理鹽水、 0.5%雞紅細(xì)胞懸液。三、方法（一）微量血凝試驗1. 加生理鹽水 用微量移液器， 吸取生理鹽水 0.025m1 加入各孔。 或用滴管每孔加 1

28、 滴（0.025ml）生理鹽水。2.稀釋抗原吸取0.025ml抗原，滴于第1孔中，用移液器擠3次混和后，吸至第2孔,依次倍比稀釋到第 10孔，棄去 0.025m1 ，第 11、 12兩孔作對照?；蛴孟♂尠粽喝】乖?.025ml）,放入第1孔中稀釋，然后把稀釋棒放入第2孔，依次倍比稀釋到第10孔。3. 加紅細(xì)胞懸液 吸取 0.5%紅細(xì)胞懸液，每孔滴加 0.025ml 。或用滴管每孔加 （0.025ml）?；旌匣蛘袷嶪min。4. 作用 放入37C恒溫箱中1530min，取出觀察結(jié)果。以 100% 紅細(xì)胞凝集的抗原最大稀釋度為抗原的血凝滴度。每排孔檢查 1 份血清樣品。用移液器在各孔中滴加 0.

29、025m1 生理鹽水?；蛴玫喂苊靠准?. 結(jié)果判定（二）微量法1. 加生理鹽水10（0.025ml）生理鹽水。2. 稀釋待檢血清 吸取 0.025m1 待檢血清，滴加于第 1 孔中，然后倍比稀釋至第孔，棄去0.025m1，第11孔為病毒凝集對照，第12孔為生理鹽水對照?；蛴孟♂尠粽喝?0血清（0.025ml）,放入第1孔中稀釋，然后把稀釋棒放入第2孔，依次倍比稀釋到第孔。血清的稀釋倍數(shù)依次為1:2、1:4、1:8 1:1024。3. 加 4個單位抗原吸取 4 個單位抗原， 滴加于 111 孔，每孔中 0.025m1 ?；蛴玫蝜min 。管每孔加1滴（0.025ml）,第12孔加0.025ml生理鹽水，混合或振蕩混合或振蕩 lmin 。HI 效價，以 lg24. 加紅細(xì)胞懸液 在每孔中各滴加 0.5%的紅細(xì)胞懸液 0.025m1，5. 作用 置于37C恒溫箱中1530min。取出，觀察結(jié)果。6. 判定結(jié)果 以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋倍數(shù)為該血清的 表示，或用 2 的指數(shù)表示。每次試驗均設(shè)陽性、陰性血清對照孔。四、判定標(biāo)準(zhǔn)+：紅細(xì)胞完全凝集，呈云霧狀均勻分布于孔底。+：孔底紅細(xì)胞呈薄層， 但面積較上者小， 孔中央略有下沉。+：孔底的紅細(xì)胞呈薄層，但面積較小，中心較致密，邊緣較松散。+：紅細(xì)胞大部分沉于孔底中央, 周圍有散在的凝集紅細(xì)胞顆粒。- ：紅細(xì)胞完全