激光共聚焦顯微鏡的樣品前處理技術(shù)研究_王志穎

1、激光共聚焦顯微鏡的樣品前處理技術(shù)研究_王志穎 DOI:10.13989/ki.0517-6611.2013.26.004 JournalofAnhuiAgriSci2013，41（26）：1060210603，10621安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，責(zé)任編輯劉月娟責(zé)任校對(duì)盧瑤 激光共聚焦顯微鏡的樣品前處理技術(shù)研究 王志穎，饒玉春，劉敏 （浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004） 摘要激光共聚焦顯微鏡是近代生物醫(yī)學(xué)圖像應(yīng)用中最重要的儀器之一，在定量共聚焦圖像分析、定量熒光測(cè)量、三維重組分析生物結(jié) 64染色法、BFA處構(gòu)等方面具有重要的作用。該研究主要介紹了實(shí)驗(yàn)室中最常用的激光共聚焦顯微鏡的幾種樣品

2、前處理技術(shù)，即FM4-理、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)等，同時(shí)介紹這些方法的原理、使用范圍以及在相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用情況等，以期更好地將激光共聚焦顯 微鏡技術(shù)應(yīng)用于科研實(shí)踐中。 關(guān)鍵詞激光共聚焦顯微鏡;樣品;前處理中圖分類(lèi)號(hào)S182;Q336文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)05176611(2013)261060202esearchofTestSamplePretreatmentTechnologyinConfocalLaserScanningMicroscopyWANGZhi-yingetal(CollegeofChemistryLifeSciences，ZhejiangNormalUniversity，

3、Jinhua，Zhejiang321004) AbstractConfocallaserscanningmicroscopyisoneofthemostimportantinstrumentsinmodernbiomedicalimagingapplicationsItplaysanimportantroleinquantitativeconfocalimageanalysis，quantitativefluorescencemeasurements，three-dimensionalanalysisofbiologicalstruc-turereorganization，andsoonThe

4、mostcommonlyusedsamplepreparationtechniquesofconfocallaserscanningmicroscopyinlaboratory 64staining，BFAtreatment，complementarybimolecularfluorescencetechnique(BiFC)，etcTheprincipleofthesewereintroduced:FM4-methods，usingscope，andtheapplicationintherelevantfieldwereintroduced，soastobetterusethelaserco

5、nfocalmicroscopeinscientific research KeywordsConfocallaserscanningmicroscopy;Sample;Pretreatment 激光共聚焦顯微鏡（Confocallaserscanningmicroscopy，簡(jiǎn)稱(chēng)CLSM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖像儀器最重要的發(fā)明之一。該儀器以激光為光源，在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加并利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，將光學(xué)成裝了激光掃描裝置， 1 像的分辨率提高了30%40%。經(jīng)過(guò)處理后，可以觀察到 選擇性膜表面熒光標(biāo)記物。 64配制成1103mol/L的母液，用去離子水將FM4-保存于20冰箱中備用。

6、菌絲染色之前，用去離子水將其稀64水溶液染料染色1用FM4-釋至適宜濃度。取試驗(yàn)材料， min后，即可用于激光共聚焦顯微鏡的觀測(cè)。 FM4-64在水溶液中基本不發(fā)出熒光，染色效果穩(wěn)定，并且與質(zhì)膜雙層結(jié)合后不能通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，必須FM4-64已經(jīng)逐步以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)行跨膜運(yùn)輸。目前， 在動(dòng)物、植物、微生物基因的亞細(xì)胞定位以及囊泡運(yùn)輸、胞吞胞吐等相關(guān)研究中進(jìn)行了應(yīng)用。 FM4-64還可以選擇性地對(duì)酵母液泡膜進(jìn)行染色，發(fā)出紅色熒光（其最大激發(fā)/最大發(fā)射波長(zhǎng)約為515/640nm）。這種親脂性染料還可以用于觀察液泡細(xì)胞器的形態(tài)和動(dòng)力學(xué)機(jī)制、研究酵母的胞吞途徑以及篩選、鑒定胞吞作用的突變體。

7、 盧曉紅等 4 細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的熒光圖像，并對(duì)樣品開(kāi)展全面、細(xì)致的研究 2 。目前，激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng) 3 用主要有以下方面：定量熒光測(cè)量；定量共聚焦圖像 分析；三維重組分析生物結(jié)構(gòu)；動(dòng)態(tài)熒光測(cè)定；熒光光活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。漂白回復(fù)（FAP） 激光共聚焦顯微鏡主要用于具有熒光樣品的測(cè)定，因此對(duì)于沒(méi)有自發(fā)熒光的生物樣品，就需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，使其具有熒光標(biāo)記，再進(jìn)行檢測(cè)。能否用激光共聚焦顯微鏡順利地觀察到樣品的熒光圖像以及觀察到圖像質(zhì)量的好壞，在很大程度上取決于樣品的前處理技術(shù)。因此，對(duì)樣品進(jìn)行的前處理應(yīng)該具有熒光標(biāo)記反應(yīng)特異性強(qiáng)，熒光定位準(zhǔn)確、強(qiáng)度適宜，不破壞樣品的結(jié)

8、構(gòu)、形態(tài)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)干擾等特還應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)材料、試驗(yàn)?zāi)康?、需檢測(cè)的指標(biāo)等確征。此外， 定合適的樣品前處理技術(shù)。目前，實(shí)驗(yàn)室中最常用的激光共64染色法、BFA聚焦顯微鏡的樣品前處理技術(shù)主要有FM4-處理、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiFC）等。1 FM4-64染色法 FM4-64是一種吡啶二溴化物，屬于苯乙烯染料。分子64通常作為分泌式C30H45Br2N3，分子量為6075136。FM4-是一種有效的研究分泌活性的囊泡動(dòng)態(tài)變化的指示性染料， 研究指出，在120mol/L的濃度范圍內(nèi)， FM4-64均能使灰葡萄孢（Bcinerea）和辣椒疫霉（Pcapsici）的質(zhì)膜發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度隨染液濃度的

9、增加而增加。當(dāng)濃度為6mol/L時(shí)，質(zhì)膜和囊泡所發(fā)出的熒光強(qiáng)度最適于觀察，并且顯示囊泡主要分布在灰葡萄孢和辣椒疫霉的菌64濃度絲頂端，菌絲亞頂端也可觀察到囊泡的存在；當(dāng)FM4-大于10mol/L時(shí)，因熒光強(qiáng)度太強(qiáng)而無(wú)法分辨出囊泡在菌64可使灰葡萄體中的分布。因此，分析時(shí)57mol/LFM4-采用孢和辣椒疫霉染色達(dá)到比較理想的觀察效果。此外，F(xiàn)M4-64最佳染色濃度6mol/L對(duì)灰葡萄孢和辣椒疫霉染色5min之內(nèi)對(duì)質(zhì)膜、隔膜和囊泡的觀察效果最為理想。2 BFA處理 布雷菲德菌素A（BrefeldinA），簡(jiǎn)稱(chēng)BFA，分子量為28036，分子式為C16H24O4。BFA可溶于DMSO（20mg/m

10、l）、乙醇（5mg/ml）和甲醇（10mg/ml）。BFA是一種真菌代謝產(chǎn) 浙江師范大學(xué)2013年度實(shí)驗(yàn)技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(sj201314)。 王志穎(1985)，女，浙江舟山人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事應(yīng)用 E-mail:zhiying348163com。微生物學(xué)研究， 07-11收稿日期2013-基金項(xiàng)目 作者簡(jiǎn)介 41卷26期王志穎等激光共聚焦顯微鏡的樣品前處理技術(shù)研究 10603 物，起初曾被用作抗病毒的試劑，現(xiàn)主要用于蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)研究。BFA也常被用于抑它是一種常用的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑。此外， 并且用于增強(qiáng)分泌蛋白的免疫染制細(xì)胞因子等蛋白的分泌， 色檢測(cè)。BFA還可激活神經(jīng)鞘磷脂循環(huán)（Sphingom

11、yelincy-cle），誘導(dǎo)一些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。它還能抑制植物對(duì)光和重力信號(hào)的向性生長(zhǎng)反應(yīng)。在黑暗或光照條件下，用BFAGFP被聚集于膨大化的內(nèi)吞囊泡狀結(jié)構(gòu)處理均可導(dǎo)致PIN2-BFA在黑暗條件下處理不會(huì)引起PIN2-GFP從之中。但是， VLC（液泡樣囊泡，Vacuole-likecompartments，VLCs）中轉(zhuǎn)運(yùn)VLC的結(jié)構(gòu)消失依賴(lài)于藍(lán)光照射。NPH3（藍(lán)光信號(hào)傳而出， GFP從VLC中轉(zhuǎn)運(yùn)而出，導(dǎo)蛋白）的缺失不僅阻止PIN2-而且使得在黑暗條件下BFA能導(dǎo)致VLC結(jié)構(gòu)的消失 5 成2個(gè)不發(fā)熒光的分子片段，再分別連接到目標(biāo)蛋白上。如果目標(biāo)蛋白之間有相互作用，熒光蛋白就會(huì)重新形成

12、活性的既可以檢熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光（圖1）。BiFC方法簡(jiǎn)單直觀，又可以定位相互作用蛋白質(zhì)的位測(cè)蛋白之間的相互作用， 點(diǎn)。多色BiFC系統(tǒng)共用或與熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FET）技術(shù)聯(lián)用，還可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)蛋白質(zhì)的相互作用 13 。 。 BFA還可特異性地可逆地阻斷蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)此外， （E）轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體（Golgi）。BFA處理后，高爾基體會(huì)很BFA并融合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。在哺乳動(dòng)物和酵母中，快被破壞， exchangefac-可能是通過(guò)一類(lèi)可以激活A(yù)fr1pGTPase的GTP-tors來(lái)抑制蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的6。 劉士平等 7 AtPIN1在膜研究指出，用BFA處理細(xì)胞后， N-注：A和

13、B分別為具有潛在的YFP相互作用的-和C-末端。沒(méi)有相互作用和熒光發(fā)射的熒光團(tuán)（左），相互作用導(dǎo)致重組后的YFP和熒光發(fā)射（右）。 圖1 BiFC原理 大多數(shù)PIN蛋白集聚在胞上正常的極性分布隨即發(fā)生改變， 內(nèi)細(xì)胞器中（有人將這一結(jié)構(gòu)稱(chēng)為BFA腔室）。去除BFAAtPIN1即迅速恢復(fù)到正常的極性定位。這表明AtPIN1后， 依賴(lài)囊泡的靶向運(yùn)輸是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程內(nèi)膜的分泌也具有可逆反應(yīng)基體、 但不影響其內(nèi)吞作用吐作用，研究成果3 11 10 7 。BFA對(duì)植物高爾 BiFC可以彌補(bǔ)免疫共沉淀技術(shù)、雙雜交技術(shù)等不能在活并且細(xì)胞狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行研究的缺陷，如研究轉(zhuǎn)錄因子間的相互已在許多

14、生命科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行了應(yīng)用， 作用及其亞細(xì)胞定位；利用BiFC尋找G蛋白可能存在相互作用的和亞基；在植物細(xì)胞中應(yīng)用BiFC技術(shù)等 14 89 。BFA可抑制細(xì)胞胞 。BFA還可用于研究鋁對(duì) 植物生長(zhǎng)素輸出載體（PIN2）囊泡運(yùn)輸?shù)挠绊懀⑷〉靡欢ǖ?。 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù) 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（Bimolecularfluorescencecomple-mentation，BiFC）是由Hu等 12 。 下面以BiFC法為例，介紹樣品采用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，觀察共聚焦顯微鏡的實(shí)驗(yàn)效果。所用材料為煙草的葉A和pSPYNE-B后，子。構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)載體pSPYCE-A+pSPYNE-B+X（一種發(fā)紅

15、色熒光的標(biāo)記蛋將pSPYCE-瞬時(shí)表達(dá)后通過(guò)型號(hào)為L(zhǎng)eicaTCSSP5的共白）共侵染煙草， 聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。與X蛋白共侵染時(shí)，用到的黃色熒光紅色熒光對(duì)應(yīng)的激發(fā)光為543nm，對(duì)應(yīng)的激發(fā)光為514nm，使用20倍鏡觀察 。 在2002年最先報(bào)道的一種簡(jiǎn) 能用于快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位及體單直觀、 內(nèi)和體外蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù)。該技術(shù)一般利用綠色熒光蛋白（GFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、青色熒光蛋白（CFP）等作為報(bào)告基因，先將熒光蛋白在某些特定的位點(diǎn)切開(kāi)，分 圖2熒光圖 A和從圖2可以看出，將雙分子熒光互補(bǔ)載體pSPYCE-pSPYNE-B放在一起，熒光蛋白的2個(gè)分子片段可以

16、在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出綠色熒光。X 標(biāo)記蛋白本身發(fā)出紅色熒光。將這2個(gè)載體和X標(biāo)記蛋白共侵染煙草，可發(fā)出混合色熒光。 (下轉(zhuǎn)) 41卷26期沈德鳳等黃連黃柏協(xié)同抗痛風(fēng)作用研究 10621 方法測(cè)定黃嘌呤氧化酶活性。抑制率（%）=（模型組酶活性各試驗(yàn)組酶活性）/模型組酶活性100。221響 結(jié)果與分析 黃連黃柏提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影由表1可知，黃連黃柏低、中、高劑量組均可降低小鼠血 3結(jié)論與討論 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連黃柏各劑量組均能在一定程度上降 表明具有一定的抗痛風(fēng)作低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平， 其對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性也具用。同時(shí)， 且抑

17、制作用強(qiáng)度大小與其相同劑量組對(duì)有一定的抑制作用， 提示其降尿酸作用機(jī)理可能血清尿酸水平的影響基本平行，是抑制黃嘌呤氧化酶的活性。 黃柏和黃連單獨(dú)使用也具有降尿酸作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)二者聯(lián)合使用時(shí)，等劑量情況下，其降尿酸作用要明顯優(yōu)于黃柏堿、木蘭花堿、藥根單獨(dú)使用。黃柏主要成分是小檗堿、 還含黃柏內(nèi)酯、黃柏堿和掌葉防己堿等多種生物堿。此外， 酮、黃柏酮酸以及7脫氫豆甾醇等多種化學(xué)成分等成分 11 10 清尿酸水平，高劑量組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P005）。黃連組和黃柏組在一定程度上也能降低尿酸水平，但作用強(qiáng)度不及黃連黃柏組。且血清尿酸水平降低程度與劑量正相關(guān)。 表1組別 空白對(duì)照組模型組

18、別嘌呤醇組黃連組黃柏組 黃連黃柏低劑量組黃連黃柏中劑量組黃連黃柏高劑量組 黃連黃柏對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響（n=10） 尿酸mg/L407790312108179845662450*79891671679420576521190557691139*52762385* 抑制率%622934024967535862266468 。黃連 此外還包含酚酸、揮發(fā)油和黃酮類(lèi)中主要生物堿和木脂素， 。二者聯(lián)用時(shí)，何種化合物在發(fā)揮協(xié)同降尿酸作 用，有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn) 1梁瑩黃柏抑菌效果的實(shí)驗(yàn)研究J現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2005，21（20）： 27462張志軍黃柏提取物的抗?jié)冃Ч鸍國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分

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21、7111然科學(xué)版， *P005，注：*與空白對(duì)照組比較，P001。 22響 黃連黃柏提取物對(duì)小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影由表2可知，黃連黃柏提取物低、中、高劑量組均可顯著 與空白對(duì)照地抑制小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性（P005）， 組比較無(wú)顯著性差異（P005）。單獨(dú)使用黃連或黃柏時(shí)，對(duì)小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性抑制率較低。 表2 黃連黃柏對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響（n=10）組別 空白對(duì)照組 模型組 別嘌呤醇組黃連組黃柏組 黃連黃柏低劑量組黃連黃柏中劑量組黃連黃柏高劑量組 XOD活性mol/L14805332571338144910721343291977376*1866256*1

22、782109*1563264 抑制率%475317002310352038475088 *P005，注：*與空白對(duì)照組比較，P001。 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 (上接)4 結(jié)語(yǔ) 激光共聚焦顯微鏡的樣品前處理方法種類(lèi)較多，應(yīng)用范圍相對(duì)較廣，可根據(jù)研究的需要進(jìn)行自主選擇。該研究主要介紹了實(shí)驗(yàn)室中幾種常用的樣品前處理方法。在實(shí)際操作還會(huì)有其他處理方法。在今后的研究過(guò)程中，需要過(guò)程中， 進(jìn)一步加以討論。參考文獻(xiàn) 1郗昕，J中國(guó)體姜泗長(zhǎng)，方耀云激光掃描共聚焦顯微鏡的原理與生物學(xué)應(yīng)用 1996，1（Z1）：7479視學(xué)與圖像分析， 2李鵬云，J瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，29曾曉榮激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)簡(jiǎn)介 （5）：4694703周濤，J軍楊怡，張德添，等激光掃描共聚焦顯微鏡及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 ，2002，26（1）：6973事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊 4盧曉紅，64在植物病原真菌和卵菌的細(xì)胞膜及囊泡染色中朱書(shū)生，劉西莉FM4-J植物病理學(xué)報(bào)，2009（4）：435438的應(yīng)用 5第九屆全國(guó)植物結(jié)構(gòu)與生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集C西安，2010 6劉成科，J洪健周雪平內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞骨架在植物病毒細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用 2008，30（5）：617621細(xì)胞生物學(xué)雜志， 7劉士平，J植物生理學(xué)通訊，2009，王璐，王繼榮