組蛋白去甲基化酶GASC1維持食管癌腫瘤干細(xì)胞及其抑制劑抗腫瘤分子機(jī)制研究

1、組蛋白去甲基化酶GASCit持食管癌腫瘤干細(xì)胞及其抑制劑抗腫瘤分子機(jī)制研究食管癌是全球最常見的第六大癌癥 ,其發(fā)病率我國最高 , 新確診的食管癌患 者, 每年有 50%以上來自中國。食管癌預(yù)后極差 , 多數(shù)就診時已為中晚期 , 五年生 存率僅 10%左右 1 。顯著的地域性分布差異性是食管癌流行病學(xué)的突出特征 , 高、低發(fā)區(qū)之發(fā)病 率差異可達(dá) 500 倍。以河南省為例 , 河南北部的林州、安陽等地是中國也是世界 食管癌發(fā)病率和病死率最高的地區(qū) 2 。半個世紀(jì)以來 , 經(jīng)過數(shù)代腫瘤學(xué)臨床先輩與防治專家艱苦卓絕的攻關(guān)探索 , 在食管癌的診療與預(yù)防方面取得了舉世矚目的成績 , 但該腫瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜

2、,防 治研究的工作非常艱巨 , 食管癌發(fā)生演進(jìn)的分子機(jī)制亟待有所突破 3v/sup。組蛋白去甲基化酶 GASC他稱KDM4C鱗狀細(xì)胞癌擴(kuò)增基因1 (Gene Amplified in Squamous Cell Carcinoma 1,GASC1 ),最初是從低分化食 管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC細(xì)胞系KYSE-150中克隆出來的一個高度擴(kuò)增的基因 4 。研究顯示,GASC1通過H3K9信號通路，對胚胎干細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(如 NANO、NOTCH1SOX2和OCT4等)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，從而對于維持胚胎干細(xì)胞自 我更新和分化潛能起至關(guān)重要的作用 5,6 。食管鱗狀上皮正常情況 下不斷自我更新 ,需要

3、正常干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞利用其高度增殖分化潛能 ,來維 持食管粘膜不斷脫落與更新。癌癥干細(xì)胞(Cancer stem cells,CSCs )學(xué)說認(rèn)為腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在著“干性” 細(xì)胞,負(fù)責(zé)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā) 7-9 。多能胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ESCs ） H3K9的甲基化狀態(tài)維持是通過轉(zhuǎn)錄因子和組蛋 白去甲基化酶活性間復(fù)雜的相互作用 10,11 。作為H3K9去甲基化酶GASC1研究顯示其與維持胚胎干細(xì)胞的特征至關(guān)重要6v/sup。但食管癌細(xì)胞是否存在 CSC細(xì)胞亞群,GASC1在食管癌CSC隹持中的作用 , 以及其小分子抑制劑是否具有抗腫瘤效用尚不明確12

4、。因此,本課題擬通過細(xì)胞系、 動物模型以及臨床組織標(biāo)本 ,多途徑探討 GASC1 及其小分子抑制劑在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制 , 闡明新型靶點(diǎn)治療藥物 的作用機(jī)理 , 為篩選鑒定食管癌診治新靶標(biāo)和新型藥物的發(fā)現(xiàn)設(shè)計提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究目的 :GASC1 及其小分子抑制劑在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機(jī)制。第一部分:GASC1在ESCC中表達(dá)情況及與臨床病理特征的關(guān)系方法1.利用Western blotting 、RT-PCR 免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry,IHC ）, 在已建人源ESC（細(xì)胞系、正常永生化上皮細(xì)胞系、患者源性ESC（原代培養(yǎng)腫瘤 細(xì)胞株、以

5、及新鮮ESCCS組織與癌旁正常組織,檢測GASC的表達(dá)情況。2.調(diào)查 GASC與患者臨床病理特征及生存之間的關(guān)系,明確GASC與 ESC（惡性表型之間 的相關(guān)性。結(jié)果1.利用 Western Blot檢測GASC在 4株ESCC細(xì)胞系中的2株中表達(dá) 明顯（KYSE-150 KYSE-30 ,在正常人永生化上皮細(xì)胞（SHEE呈現(xiàn)低水平表達(dá)； 在5株患者來源原代培養(yǎng) ESC（細(xì)胞株中表達(dá)3株（EC-1、2、3）。2.利用Western Blot、RT-PCR及 IHC方法分別檢測GASC在 ESC（癌與癌旁組織的表達(dá)情況：在 癌與癌旁組織間的表達(dá)沒有明顯差異 , 但在不同分化程度的癌組織間存在表達(dá)

6、差 異 , 分化越差 , 表達(dá)越高GASC的表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)：高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增高。3.總生存率的Kaplan - Meier分析表明,2年生存率GASC陽性組為62.6%,GASC陰 性組為81.6%;GASC表達(dá)增加的腫瘤患者2年總生存率明顯低于表達(dá)減少的腫瘤 患者(P=0.041 )第二部分：ESCC-CSC勺分離與鑒定方法1.利用干細(xì)胞無血清懸 浮培養(yǎng)法,觀察ESC住田胞系和原代培養(yǎng)細(xì)胞株是否可以成球懸浮生長。2.利用流式細(xì)胞熒光激活細(xì)胞分選法(Fluorescence-activated Cell Sorting,FACS )和 Aldefluor 干細(xì)胞鑒定試劑盒 ,

7、 以乙醛脫氫酶 1(Acetaldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)為干細(xì)胞分子標(biāo)志,分別在已建人源ESC(細(xì)胞系和患 者源性ESCCM代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株中檢測和分離 ALDHvsup+v/sup細(xì)胞亞群。3. 利用干細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)法,比較ALDH+/sup細(xì)胞亞群及 ALDH-v/supffl胞亞群在體外無血清培養(yǎng)基的懸浮成球能力。4. 體內(nèi)試驗(yàn) ： 在重癥聯(lián)合免疫缺陷( Severe Combined ImmunDeficiency,SCID )裸鼠乳腺脂肪墊皮下接種 ALDH+/sup及ALDH-v/sup法田胞，觀察移植瘤發(fā)生發(fā)展情況。5.進(jìn)一步研究 ALDH+

8、/sup細(xì)胞是否具有長期成瘤潛力和自我更新能力,評估子代細(xì)胞在 連續(xù)移植中成瘤能力 ： 從小鼠皮下移植瘤獲得父代移植瘤細(xì)胞 , 再次分離單細(xì)胞 懸浮液,利用FACS離選ALDH+/sup和ALDH-v/sup胞,再次移植 到受體小鼠體內(nèi) , 連續(xù)獲得三代移植瘤模型細(xì)胞進(jìn)行分析。6.再次利用FACSffi IHC方法,檢測ALDH+/sup細(xì)胞在體內(nèi)移植瘤“干 性”維持情況。結(jié)果1.ESCC細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基(非粘附、無血清、含生長因 子)形成干細(xì)胞球體,以KYSE-150，和低分化患者源性ESC住田胞成球能力為著。2.利用FACS方法,檢測ESC住田胞系和ESCCM代培養(yǎng)細(xì)胞株中ALDH+v/

9、sup細(xì)胞亞群（從 3.92%到 14.7%不等）。KYSE-15C細(xì)胞ALDH+v/sup比例約為 10.1%。3. ALDH+0 ALDH-?代細(xì)胞在非粘附、無血清的條 件下培養(yǎng)7天,ALDH+v/sup體在5000細(xì)胞/ml的密度下能夠產(chǎn)生較多的 細(xì)胞球體。從球體分離出的 ALDH+/sup細(xì)胞在體外能夠自我更新,ALDH+S體百分率和干細(xì)胞球體啟動能力顯示出幾乎無限的增長 潛力。4. 按照普通培養(yǎng)方法,經(jīng)過96小時,MTS結(jié)果顯示，ALDH+v/supffl胞較ALDH-v/supffl胞具有更強(qiáng)的增殖能力。5.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ALDH+v/supffl胞較未分類的 ESC

10、C細(xì)胞以及 ALDH-v/sup成了 更多的克隆,顯示出明顯增強(qiáng)的增殖能力。6. 從高、低分化兩位食管鱗癌患者新鮮組織制備食管癌原代細(xì)胞 , 通過ALDEFLUOR?SteCell （ STEMCELL?TECHNOLOGICS 干細(xì)胞檢測和流式細(xì)胞儀 篩選，將 ALDH+ ALDH-v/supffl胞，分別以 102、 103、104、105、106 的細(xì)胞濃 度接種到SCID裸鼠乳房脂肪墊皮下,每組5只，觀察2個月。104細(xì) 胞濃度的成瘤小鼠數(shù)目：ALDH+v/supffl胞:5/5;ALDH-v/sup 細(xì) 胞:2/5 。103細(xì)胞濃度的成瘤小鼠數(shù)目：ALDH+v/sup!田胞:5/5;

11、ALDH- 細(xì)胞:0/5。102細(xì)胞濃度的成瘤小鼠數(shù) 目:ALDH+v/sup!田胞:2/5;ALDH- 細(xì)胞:0/5 （二個月內(nèi)沒有腫瘤 形成）106細(xì)胞濃度的成瘤小鼠數(shù)目：ALDH+v/supffl胞:5/5;ALDH-v/sup 細(xì)胞:5/5,但 ALDH+/sup細(xì)胞在小鼠體內(nèi)形成 腫瘤的體積、重量以及腫瘤生長的速度均大于ALDH-v/supffl胞。7.利用FACS僉測裸鼠移植瘤細(xì)胞ALDH舌性,顯示ALDH+/sup衍生的移植瘤依然 保持著較高的ALDH+/sup細(xì)胞亞群;HE和IHC結(jié)果顯示,由 ALDH+/sup細(xì)胞形成的腫瘤組織學(xué)和GASC抗原特征類似于原發(fā)腫瘤。第三部分:G

12、ASC1參與 ESCC-CS的維持方法1.明確GASC在ESC（干細(xì)胞的 表達(dá)：利用qPCR和Western blotting, 檢測了 GASC在 ESC（細(xì)胞系及原代培養(yǎng) 細(xì)胞株 ALDH+/sup和 ALDH-v/supffl胞的表達(dá)情況。2.明確 GASC1 對ESC（普通培養(yǎng)細(xì)胞系的作用：構(gòu)建GASC慢病毒干擾載體敲減GASC基因表達(dá), 利用qPCF和Western blotting 驗(yàn)證敲減效；聯(lián)合GASC抑制劑咖啡酸（Caffeic acid,CA ）處理，觀察GASC基因敲減或CA抑制其表達(dá)對ESC（細(xì)胞克隆形成能力（平板克隆試驗(yàn)）、細(xì)胞增殖能力（MTT試驗(yàn)）、細(xì)胞周期（流式細(xì)

13、胞儀分析）的 影響。3.明確GASC對ESCCf細(xì)胞“干性”維持的作用：體外實(shí)驗(yàn)：根據(jù)干細(xì)胞“靜 止”在G0G側(cè)的特征，利用流式細(xì)胞儀分析GASC基因敲減或CA抑制下細(xì)胞周 期特點(diǎn)的變化；運(yùn)用FACS及Aldefluor分析法，分析ESCC富集培養(yǎng)干細(xì)胞在 GASC基因敲減及CA處理下ALDH+v/sup亞群比例的變化；觀察其非粘附性 無血清體外干細(xì)胞培養(yǎng)方法下 ALDH+/sup亞群成球能力和自我更新能力 的變化。4.體內(nèi)試驗(yàn)：經(jīng)SCID裸鼠乳房脂肪墊分別皮下種植 ESC親本細(xì)胞、GASC1 慢病毒敲減細(xì)胞和CA處理后細(xì)胞，觀察移植瘤潛伏期和生長速度，以明確GASC1 對原位腫瘤的作用；經(jīng)S

14、CID裸鼠鼠尾靜脈注射ESCC親本細(xì)胞、GASC慢病毒敲 減細(xì)胞和CA處理后細(xì)胞,觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成情況,以明確GASC對寸轉(zhuǎn)移瘤的 作用;在SCID裸鼠食管癌移植瘤模型,經(jīng)腹腔注射不同濃度CA,觀察移植瘤變化, 以進(jìn)一步明確GASC抑制劑CA的抗腫瘤作用。5.利用FACS和IHC方法,鑒別各實(shí)驗(yàn)組移植瘤 ADLH+v/sup細(xì)胞比例, 明確GASC寸ESC（干細(xì)胞亞群“干性”維持的作用。結(jié)果 1.通過FACS方法在 原代培養(yǎng)細(xì)胞株分選 ALDH+/sup細(xì)胞亞群,利用RT-PCR和 Western blot 方法,分別檢測GASC在 ALDH+/sup和ALDH-v/supffl胞亞群的表

15、達(dá) 情況。結(jié)果顯示,相對于 ALDH-群,GASC1 在 ALDH+v/sup亞群 中明顯高表達(dá)。2.利用RT-PCR和Western Blot證實(shí)通過shRNAs慢病毒成功實(shí) 現(xiàn)GASC 的表達(dá)敲減。3.利用平板克隆試驗(yàn)、MTT式驗(yàn)、細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)GASC1 基因敲減或其抑制劑CA處理，引起ESCC各細(xì)胞株克隆、增殖、遷移能力下降。4.Aldefluor 分析顯示GASC基因敲減或CA處理,導(dǎo)致ESC（原代培養(yǎng)細(xì)胞株 ALDH+/sup細(xì)胞比例下降，并在非粘附性無血清體外培養(yǎng)下，細(xì)胞成球能 力下降 , 在隨后的體外連續(xù)繁殖中持續(xù)下降。5.GASC1對ESC（原位瘤的影響：應(yīng)

16、用SCID裸鼠移植瘤模型顯示,GASC1敲減 及CA處理組小鼠腫瘤體積,均較對照組縮小,腫瘤潛伏期延長。6.GASC1對ESCC 轉(zhuǎn)移瘤的影響：和對照組相比,GASC1敲減及CA處理組小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目和體積 均下降。7.CA對ESC（裸鼠移植瘤模型的治療作用：利用CaA腹腔注射,引起小鼠腫瘤 體積縮小 , 且呈劑量依賴性 ;8 周后處死小鼠 , 與父代腫瘤細(xì)胞相比 , 對照組殘余瘤ALDH+v/sup細(xì)胞比例穩(wěn)定；CA處理組呈現(xiàn)ALDH+v/sup細(xì)胞比例 顯著下降。第四部分：GASC1-N0TCH通路調(diào)控食管癌干細(xì)胞作用機(jī)制方法 1.應(yīng)用Agilent 全基因組微陣列分析法 , 對采用細(xì)胞微

17、球懸浮培養(yǎng)法富集的食管癌干細(xì)胞 KYSE150S本細(xì)胞株（Esopha-sphere GASC1+ 及 GASC沉默細(xì) 胞株（Esopha-sphere GASC1-）進(jìn)行分析，評估siRNA干擾下的下調(diào)基因。利用GC分析對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋,應(yīng)用qPCRS行轉(zhuǎn)錄驗(yàn)證,并選取 重要轉(zhuǎn)錄因子Notch1進(jìn)行功能學(xué)研究。2.檢驗(yàn)通過抑制GASC可導(dǎo)致多能性相 關(guān)基因下調(diào)與組蛋白修飾相關(guān)的假設(shè) ：使用 AlphaLISA 調(diào)查去甲基化抑制劑 CA 是否影響分選的ALDH+/sup細(xì)胞中全蛋白甲基化狀態(tài)。使用了定量染色質(zhì)沉淀技術(shù)（ qChIP）, 檢測多能相關(guān)性基因啟動子在 GASC1 抑制過程

18、中組蛋白的變化。使用抗體進(jìn)行芯片分析,分別識別H3K9me或H3K9me3 在NOTCH啟動子區(qū)域的擴(kuò)增情況。3.研究CA阻斷GASC脫甲基酶功能是否通過表觀遺傳學(xué)修飾影響異種移植 瘤的生長,檢測CA是否在體內(nèi)全面影響H3K9甲基化:利用western blot 分析 ALDH+/sup來源的異種移植瘤經(jīng)CA處理后組蛋白提取物中H3K9?基化水 平。4.驗(yàn)證這些效應(yīng)是否反映了靶基因在腫瘤生長抑制中的表達(dá)：利用IHC法分 析NOTCH和H3K9me在異種移植瘤中的表達(dá)。驗(yàn)證CA處理是否促進(jìn)了 NOTCH啟動子表觀遺傳標(biāo)記的改變：利用IHC法檢 測H3K9me標(biāo)記在異種移植瘤中的狀態(tài)。結(jié)果 1.Agilent全基因組微陣列分析 ALDH+ESCC-CSCs GASC基因敲除和 CA處理48小時的細(xì)胞,我們 確定了 694個下調(diào)重疊基因。用GO分析功能注釋差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)重疊下調(diào)表達(dá)基因在乙醛脫氫酶(NAD活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合/干性維持、細(xì)胞周期調(diào)控和分化等方面具有較強(qiáng)的 功能。2.在這些基因中，NOTCH基因是維持ESCC細(xì)胞多能性和自我更新的重