蛋白質(zhì)的分離純化方法

1、根據(jù)分子大小不同進行分離純化蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì) ,并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同 , 因此可以利 用一些較簡單的方法使蛋白 質(zhì)和小分子物質(zhì)分開 , 并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同 進行分離的方法主要有透析、 超濾、 離心和凝膠過濾等。 透析和超濾是分離蛋白 質(zhì)時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中 , 再浸入 透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜 , 而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程。 這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機 鹽為主的小分子分開。它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用, 在進行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去

2、引入的無機鹽。由于超濾過程中, 濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞 ,以致超濾速度減慢 , 截流物質(zhì)的分子量也越來越小。 所以在使用 超濾方法時要選擇合適的濾膜 , 也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜 質(zhì)的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如 , 在從大米渣中提取蛋 白質(zhì)的實驗中，加入纖維素酶和a -淀粉酶進行預(yù)處理后，再用離心的方法將有 用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進行初步分離 3 。使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離 心的方法稱為密度梯度 ( 區(qū)帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、 聚蔗糖梯度和 其它合成材料的密度梯度。 可

3、以根據(jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯 度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白 , 得到的產(chǎn)品純度高 但產(chǎn)量偏低。蔣辰等 6 通過比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果 , 利用溴化鈉密度 梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。 凝膠過濾也稱凝膠滲透層析 是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。 凝膠過濾的原理是當(dāng) 不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時 ,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) , 而被排阻在凝膠珠之外 , 隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動并最先流出柱外 反之, 比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝

4、膠等。 在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法 可以得到很好的效果，純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32 kDa、成分是多糖：蛋 白質(zhì)(88 : 12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白1。凝膠過濾在抗凝血蛋白的 提取過程中也被用來除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì) 7 。根據(jù)溶解度不同進行分離純化影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強度、介電常數(shù)和 溫度等。但在同一條件下 , 不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度 , 根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點 , 適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件 , 就可以選擇性地控制蛋白質(zhì) 混合物中某一成分的溶解度 , 達到分離純化蛋白質(zhì)的目的。常用的方法有等電點沉

5、淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團 萃取法等。等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法。每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點，而且在 等電點時溶解度最 低；相反，有些蛋白質(zhì)在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的 pH 值來分離純化蛋白質(zhì)。王洪新等 8 研究茶葉蛋白質(zhì)提取過程發(fā)現(xiàn) ,pH 值為時茶 葉蛋白提取效果最好,提取率達到36 8%初步純化得率為91 0%李殿寶9 在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時將蛋白溶液的 pH值調(diào)到34,使目標蛋白于等電 點沉淀出來。等電點沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取。 李鳳英等 10 測得 葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點為3 &他們利用堿溶法提

6、取葡萄籽蛋白質(zhì)，得到了最佳 的提取工藝為：以1xi0-5mol L-l的NaOH液,按1 : 5的料液比,在40C攪拌 40 min,葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達73 78%另外還可以利用堿法提取大米蛋白,其 持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取 11 。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉 蛋白質(zhì)無腥味、色澤潔白 , 蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達 90%12 。蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象 , 其中, 增 加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶 , 反之為鹽析。應(yīng)當(dāng)指出 , 同樣濃度的二價離子中性 鹽,如MgCI2、（NH4）2SO4對蛋白質(zhì)溶解度影響的效果，要比一價離子中性鹽如 NaCI、NH4Cl大得

7、多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用 鹽溶法來提取蛋白質(zhì)，其最佳提取工藝是：以10%NaC溶液,按1 : 25的料液比， 在30E攪拌提取30min,蛋白質(zhì)提取率為57 25%10。鹽析是提取血液中免疫 球蛋白的常用方法 , 如多聚磷酸鈉絮凝法、 硫酸銨鹽析法 , 其中硫酸銨鹽析法廣泛 應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性 , 為防止其對蛋白質(zhì)的破壞 , 應(yīng)用氨水調(diào) pH值至中性。為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制 在0 2% 2 0%利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進行提純后，通常要使用透析或者凝 膠過濾的方法除去中性鹽 13 。有機溶劑提取法的原理是 ： 與水

8、互溶的有機溶劑 （如甲醇、乙醇 ）能使一些蛋白質(zhì) 在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強度下，引起蛋白質(zhì)沉 淀的有機溶劑的濃度不同 , 因此, 控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。 例如, 在冰浴中磁力攪拌下，在4C預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇（-25 C）,可以使冰核 蛋白析出 , 從而純化冰核蛋白 14 。由于在室溫下 , 有機溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的 沉淀, 而且伴隨著變性。因此 , 通常要將有機溶劑冷卻 , 然后在不斷攪拌下加入有 機溶劑防止局部濃度過高 , 蛋白質(zhì)變性問題就可以很大程度上得到解決。對于一 些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、 不溶于水的蛋白質(zhì) ,

9、可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取 , 它們有一定的親水性和較強的親脂性 ,是理想的提 取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前 WHOffi程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法,不僅分辨 率高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分 , 而且有抑菌、清除和滅病毒的作 用 15 。萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法 , 而雙水相萃取和反膠團萃取可以 用來分離蛋白質(zhì)。雙水相萃取技術(shù) (Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相 , 由于被分離物在兩相中分配的不 同, 便

10、可實現(xiàn)分離 , 被廣泛用于生物化學(xué)、 細胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分 離和提取。此方法可以在室溫環(huán)境下進行 , 雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì) 的穩(wěn)定性,收率較高。 對于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì) ,需要先對細胞進行有效破碎。 目的蛋 白常分布在上相并得到濃縮 , 細胞碎片等固體物分布在下相中。采用雙水相系統(tǒng) 濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的 影響16 。反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質(zhì)包裹其中而達到提取蛋白質(zhì)的目的。 反膠團 是當(dāng)表面活性劑 在非極性有機溶劑溶解時自發(fā)聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。 這種方法的 優(yōu)點是萃取過程中蛋白質(zhì)因位于反膠團的內(nèi)部而受

11、到反膠團的保護。 程世賢等1 7 就利用反膠團萃取 法提取了大豆中的蛋白質(zhì)。根據(jù)電荷不同進行分離純化 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層 析兩類。在外電場的作用下 , 帶電顆粒 (如不處于等電點狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子 )將向著與 其電性相反的電極移動 , 這 種現(xiàn)象稱為電泳。聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺為介質(zhì)的區(qū)帶電泳 , 常用 于分離蛋白質(zhì)。它的優(yōu)點是設(shè)備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種 高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù) ,也可以用于蛋白質(zhì)的等電點測定。利用等電聚焦技 術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)中進行的。在外電場作用下各種蛋 白質(zhì)將移向并聚焦在等于

12、其等電點的 pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等18 研究了聚丙烯酰胺電泳、 等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質(zhì)中的應(yīng) 用。結(jié)果發(fā)現(xiàn) , 聚丙烯酰胺電泳的條帶分辨率低 , 加樣量不高 ;等電聚焦電泳分辨 率最高,可以分離同種蛋白的亞成分 ,加樣量最小 ; 等速提純電泳區(qū)帶分辨率較高 可將樣品分成單一成分 , 加樣量最大。離子交換層析 (Ion exchange chromatography,IEC) 是以離子交換劑為固定相 , 依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結(jié)合力大小的 差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中 , 基質(zhì)由帶有電荷的樹脂或纖 維素組成。帶有

13、正電荷的為陰離子交換樹脂 ; 反之為陽離子交換樹脂。離子交換 層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH值條件下，其帶電 狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負電荷的蛋白質(zhì) ,被留在層析柱上 ,通過提 高洗脫液中的鹽濃度 ,將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來 ,其中結(jié)合較弱的蛋 白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì) ,結(jié)合的蛋 白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等19 將離子交換層析應(yīng)用于濃縮蘋果汁中蛋白質(zhì)的提純。另外,離子交換層析還用于抗凝血蛋白的提取 7 。利用對配體的特異親和力進行分離純化 親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對

14、其配體分子特有的識別能力 (即生物學(xué)親和力 ) 建立起來的一種有效的純化方法。 它通常只需一步處理即可將目的蛋白質(zhì)從復(fù)雜 的混合物中分離出來 , 并且純度相當(dāng)高。應(yīng)用親和層析須了解純化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和 生物學(xué)特性,以便設(shè)計出最好的分離條件。 近年來,親和層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于靶 標蛋白尤其是疫苗的分離純化 ,特別是在融合蛋白的分離純化上 ,親和層析更是 起到了舉足輕重的作用 ,因為融合蛋白具有特異性結(jié)合能力 20 。親和層析在基 因工程亞單位疫苗的分離純化中應(yīng)用也相當(dāng)廣泛 21 。范繼業(yè)等22 利用殼聚糖 親和層析提取的抑肽酶比活達到 71 428 BAEE mg-1,純化回收率達到62 5% 該方法成本較低 , 吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸 附較小、可反復(fù)使用、適用性廣 , 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。3 展望在實際工作中 ,很難用單一方法實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化 ,往往要綜合幾種方法 才能提純出一種蛋白質(zhì)。理想的蛋白質(zhì)分離提純方法 ,要求產(chǎn)品純度和總回收率越高越好 ,但實際上兩