生化工程復(fù)習(xí)題(2013下)

1、復(fù)習(xí)題一、名詞解釋1.冷凍干燥：冷凍的提取液在真空狀態(tài)下，可以由固體直接變?yōu)闅怏w的方法稱冷凍干燥法，該法能起到濃縮作用。凍干過程中，有效成分幾乎不會(huì)破壞，能保持生物大分子的天然性質(zhì)，還具有疏松，易于溶解的特性，便于保存應(yīng)用。2.有效成分：欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。3.抽提：從一種固體或一種液體混合物中將所需要的物質(zhì)根據(jù)其特性用溶劑提取分離出來的方法。亦即用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒?，從原料中把有效成分分離出來的過程。4.鹽析：是利用不同物質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度的差異，向溶液中加入一定量的中性鹽，使原來溶解的物質(zhì)沉淀析出的分離技術(shù)。5有機(jī)溶劑沉淀：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，

2、降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。6等電點(diǎn)沉淀：調(diào)節(jié)體系pH值，使兩性電解質(zhì)的溶解度下降而析出的操作稱為等電點(diǎn)沉淀。7. 分配系數(shù)(K)：在一定溫度、壓力下，一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值叫分配系數(shù)。8.吸附平衡：在吸附的同時(shí)發(fā)生脫附，吸附速度和脫附速度相等表觀吸附速度為零，吸附物質(zhì)在溶液中的濃度和吸附劑表面上的濃度都不再發(fā)生改變時(shí)的狀態(tài)。9洗脫：利用適當(dāng)?shù)娜軇瑢渲降奈镔|(zhì)釋放出來，重新轉(zhuǎn)入溶液的過程。10.洗脫體積：將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積，用Ve表示。11層析分離：利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同的程

3、度分布在兩個(gè)相中的分離方法。12.層析分辨率：層析中相鄰兩個(gè)峰的分開程度。用Rs來表示。Rs = 兩峰尖距離/兩峰寬度和的一半。13.流動(dòng)相：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。14.固定相：層析中固定不動(dòng)的一相，是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附、溶解、交換等作用。15.吸附劑：凡能夠?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì)，都稱為吸附劑。16吸附層析：是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。17分配層析：是根據(jù)在一個(gè)有兩相同時(shí)存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)

4、到分離目的的一種層析技術(shù)。18凝膠過濾：層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。19離子交換層析：是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。20疏水層析：是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)（疏水性配基）的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行分離純化的層析技術(shù)。21高效液相色譜：是指選用顆粒極細(xì)的高效耐壓新型固定相，借助高壓泵來輸送流動(dòng)相，并配有實(shí)時(shí)在線檢測器，實(shí)現(xiàn)色譜分離過程全部自動(dòng)化的液相色譜法。22.液相色譜：用液體作為流動(dòng)相的色譜法稱為液相層析，或稱液相色譜。23.氣相色譜：以氣體

5、作為流動(dòng)相的色譜法稱為氣相層析，或稱氣相色譜。 24.陽離子交換劑:其電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電。因此，可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)行交換反應(yīng)。25.陰離子交換劑：其電荷基團(tuán)帶正電，反離子帶負(fù)電。因此，可以與溶液中的負(fù)電荷化合物或陰離子進(jìn)行交換反應(yīng)。26離子交換平衡：當(dāng)正反應(yīng)、逆反應(yīng)速率相等時(shí)，溶液中各種離子的濃度不再變化而達(dá)平衡狀態(tài)，即稱為離子交換平衡。27.正相色譜:指固定相的極性高于流動(dòng)相的極性，這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動(dòng)的速度快，先流出。28.反相色譜：指固定相的極性低于流動(dòng)相的極性，這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動(dòng)的速度快而先流出

6、。29.離子交換劑的轉(zhuǎn)型：指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子的過程。如對(duì)陰離子交換劑用HCl處理可將其轉(zhuǎn)為Cl型，用NaOH處理可轉(zhuǎn)為OH型，用甲酸鈉處理可轉(zhuǎn)為甲酸型等。30.交換容量：在一定條件下，某種組分與基質(zhì)（固定相）反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，稱為交換容量，數(shù)值越大，表明基質(zhì)對(duì)該物質(zhì)的親合力越強(qiáng)。31.基質(zhì)體積：凝膠顆粒實(shí)際骨架體積，用Vg表示。32.外水體積：凝膠顆粒之間體積的總和。33.洗脫體積：將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積，用Ve表示。34.排阻極限：不能進(jìn)入凝膠顆粒孔穴內(nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從

7、凝膠顆粒外流出，所以它們同時(shí)被最先洗脫出來。35.分級(jí)分離范圍：表示一種凝膠適用的分離范圍，對(duì)于分子量在這個(gè)范圍內(nèi)的分子，用這種凝膠可以得到較好的線性分離。36. 梯度洗脫：在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k 達(dá)到良好的分離目的。當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時(shí)，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強(qiáng)度或pH值等，最常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強(qiáng)度梯度?；蛘叽鹆鲃?dòng)相由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動(dòng)相中各溶劑組成的比例改變流動(dòng)相的極性，使每

8、個(gè)流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分可在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳分離。（可在離子交換層析中查)。37.親和層析：利用生物分子與其配體間特異性的、可逆性的親和結(jié)合作用而對(duì)樣品進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。配體被固定在載體上，特異性結(jié)合經(jīng)過的與其有親和性的生物分子。38.配體：親和層析中被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體。44.親和吸附劑：親和層析中被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價(jià)結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。39.分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑凝膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。40.線性梯度凝膠：梯度凝膠電泳通常采用聚丙

9、烯酰胺凝膠，不是在單一濃度（孔徑）的凝膠上進(jìn)行，而是形成梯度凝膠，凝膠的濃度從上到下逐漸增加，孔徑逐漸減小，呈線性變化。41.再生：使用過的柱子，采用一定的方法令其恢復(fù)原來性狀的過程。42.擔(dān)體：氣相色譜中，填充在層析柱內(nèi)的顆粒狀惰性支持物，其上涂布固定相。43.聚酰胺薄膜層析: 聚酰胺對(duì)極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時(shí)，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x物質(zhì)在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附；再吸附、再解吸附的連續(xù)過程，就能達(dá)到分離目的。44.聚焦層析: 聚焦層析是利用層析

10、過程中固定相偶聯(lián)具有兩性解離功能的有機(jī)分子為配基，與流動(dòng)相中某些具有兩性的粒子發(fā)生等電聚焦反應(yīng)而進(jìn)行分離的一種方法。45. 聚焦效應(yīng)-蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在PH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程。46.基線：樣品進(jìn)入檢測器前，在實(shí)驗(yàn)操作條件下，記錄筆所走的路徑，稱為基線。47.噪聲：基線在短暫時(shí)間內(nèi)的波動(dòng)。48.漂移：基線在較長時(shí)間內(nèi)的位移。只有當(dāng)噪聲和漂移均很小時(shí)，儀器穩(wěn)定性才好。 49.調(diào)整保留時(shí)間：扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間，稱為tR。50.基線寬度：通過色譜峰兩側(cè)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)(拐點(diǎn))作切線，在基線上的截距，稱為基線寬度。51.半峰寬: 色譜峰高一半處的峰寬度，又稱半寬度。即通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，

11、此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離。52.死體積: 不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰值所需的流動(dòng)相體積。53.保留時(shí)間tR: 被分離樣品組分從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)該組分濃度最大值時(shí)所需的時(shí)間，也即從進(jìn)樣開始到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點(diǎn)時(shí)為止所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為此組分的保留時(shí)間。54.高壓電泳：電泳的電壓1000V5000V，電泳時(shí)間短，有時(shí)只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質(zhì)的分離。55.低壓電泳：電泳的電壓100V500V，電泳時(shí)間較長，適于分離蛋白質(zhì)等生物大分子。55.等電聚焦：使電泳的介質(zhì)中形成一個(gè)連續(xù)的、穩(wěn)定并有一定范圍的線性pH 梯度，電泳時(shí)蛋白質(zhì)等待分離的兩性分子

12、可以在這種pH 梯度中遷移，直到遷移聚集于與其等電點(diǎn)（pI）相同的區(qū)域，從而形成一種分辨率極高的電泳聚焦效應(yīng)。這種按等電點(diǎn)的大小，生物分子在pH梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)行聚焦的行為稱等電聚焦。56.雙向電泳：是一種由任意兩個(gè)單向電泳組合而成的，在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)行第二向電泳的分離方法。一般使用根據(jù)等電點(diǎn)和分子量兩次分離（IEF/SDS-PAGE）。通常用等電聚焦電泳和SDS-PAGE 的組合的電泳方法，即先進(jìn)行第一向水平電泳等電聚焦電泳（按照pI 分離），然后再進(jìn)行第二向垂直電泳SDS-PAGE（按照分子大小）。57.免疫電泳是以瓊脂（糖）為支持物，在免疫學(xué)基礎(chǔ)上，將瓊脂（

13、糖）區(qū)帶電泳與免疫擴(kuò)散相結(jié)合產(chǎn)生特異性的沉淀線、弧或峰。58.電滲：是指在電場中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。如支持物帶有負(fù)電荷，吸引溶液中帶正電荷的離子，這些帶正電荷的離子在電場中向負(fù)極移動(dòng)，引起緩沖液向負(fù)極移動(dòng)(反之，緩沖液的移動(dòng)方向相反)，從而影響到待分離物在電場中的移動(dòng)。59.區(qū)帶電泳：電泳過程中，待分離的各組分分子在支持介質(zhì)中被分離成許多條明顯的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的電泳技術(shù)。60.泳動(dòng)度：帶電顆粒在電場中泳動(dòng)的速度稱泳動(dòng)度。61.毛細(xì)管電泳(CE)：又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE),是指離子或帶電粒子以毛細(xì)管為分離室,以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的

14、差異而實(shí)現(xiàn)分離的液相分離分析技術(shù)。62.Eastern印跡法：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法；對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。63.脈沖電場凝膠電泳：用于分離大分子DNA的一種電泳方法。由于超過一定大小(20 kb)的線狀DNA分子在瓊脂糖凝膠中電泳的速度幾乎相同，無法在恒場強(qiáng)凝膠電泳中分離。此電泳法則以兩個(gè)不同方向的電場周期性交替進(jìn)行，DNA在電場方向變更中作出反應(yīng)所需要的時(shí)間取決于其大小，較小的分子重新定向較快，在凝膠中移動(dòng)也較快，從而能使不同大小的DNA分子(可大至5 Mb)分開。電場變換方向的間

15、隔時(shí)間為脈沖時(shí)間，通常脈沖時(shí)間越長分辨的DNA片段越長。64.酶傳感器：是由固定化酶與轉(zhuǎn)換器密切結(jié)合而成的傳感裝置，是生物傳感器的一種。 65. 固定化酶的相對(duì)酶活力：游離酶的活力為100，與同樣量的酶偶聯(lián)于載體后所顯示的活力之比。66.固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù):是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)。67.固定化酶:固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。 68.固定化細(xì)胞：固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命的活動(dòng)稱為固定化細(xì)胞。又稱為固定化活細(xì)胞、固定化增殖細(xì)胞或固定化完整細(xì)胞。 69.交聯(lián)固定化技術(shù)：借助雙功能團(tuán)試劑使酶蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)，可制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的

16、固定化酶。此固定化法稱為交聯(lián)固定化技術(shù)。 二、填空題1、目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的關(guān)鍵技術(shù)是 、 和 。電泳、層析、高速與超速離心2.常用于提取有效成分的生物材料有： 、 和 。動(dòng)物臟器、植物組織、微生物。3.在提取、純化酶的過程中， 和 要逐漸增高。純度、比活性4.有效成分的提取、純化過程中，常用的活性測定方法有： 、 、 、 和 。光譜法、電化學(xué)法、生物活性檢測法、免疫分析法和生物傳感器法。5.通常提取堿性蛋白質(zhì)選用 的溶液，提取酸性蛋白質(zhì)選用 的溶液。低pH值、高pH值6.提取有效成分時(shí)，提取液與提取物的比例要適當(dāng)，一般以 為宜。5:17.透析法濃縮大分子樣品溶液時(shí)，應(yīng)選用 溶液為透析

17、液。聚乙二醇8.減壓蒸餾法濃縮，一般適用于 的物質(zhì)。常溫下穩(wěn)定性好9.冰凍干燥法干燥樣品，優(yōu)點(diǎn)是：有效成分幾乎不會(huì)破壞，能保持生物大分子的天然性質(zhì)，還具有疏松，易于溶解的特性，便于保存應(yīng)用。10.一般來說，選擇分離方法的依據(jù)，是提取液中有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異性。11. 所用的操作壓比超濾更大，膜的平均孔徑最小，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。反滲透12.除鹽、除少量有機(jī)溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到 的技術(shù)。透析13.一般來說，在第一次鹽析時(shí)，pH應(yīng)偏離 的pI值，靠近 的pI值；而在第二次鹽析時(shí)pH應(yīng)調(diào)至接近 的pI值。有效成分、雜質(zhì)、有效成分14.鹽析時(shí)

18、，蛋白質(zhì)濃度 ，共沉淀現(xiàn)象越明顯，鹽析分離效果則越差。越高15影響鹽析的主要因素有（溶質(zhì)種類） ，（溶質(zhì)濃度），（pH值）和（溫度）。16.鹽析用鹽的選擇需考慮（鹽析作用強(qiáng)）、（溶解度大）、（生物學(xué)惰性）和（來源豐富、經(jīng)濟(jì)） 等幾個(gè)方面的因素；17.影響有機(jī)溶劑沉淀的因素有（溫度）、（pH）、（樣品濃度）、（中性鹽濃度）和（金屬離子）。18、DNP是 和 以復(fù)合物形式存在的，解聚它們用去污劑 。DNA，蛋白質(zhì)，SDS19.純DNA溶液的OD260/OD280應(yīng)等于 。1.8 20.提取核酸時(shí)，溶液中的多糖類物質(zhì)應(yīng)該用 除去。CTAB或十六烷基三甲基溴化銨；21.蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將

19、蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析和凝膠過濾的辦法除鹽。22.常用的蛋白質(zhì)沉析方法有（等電點(diǎn)沉淀），（鹽析）和（ 有機(jī)溶劑沉淀 ）。23. 利用沉淀法分離純化蛋白質(zhì)時(shí)常用的中性鹽是 。硫酸銨；24.生物大分子制備的整個(gè)過程分為 、 、 、 、 五個(gè)階段。材料選擇和處理，確立測定方法，分離與純化，抽提，濃縮25.純化方案評(píng)價(jià)的指標(biāo)主要有 、 和 。回收率，純化倍數(shù)，比活力26. 生物大分子主要包括： 蛋白質(zhì) 、 酶 、 核酸 、 多糖 和 脂類 ，它們是生物體內(nèi)存在的具有特殊生物學(xué)功能的高分子化合物。27. 生化分離技術(shù)主要有沉淀分離技術(shù)分離、層析分離技術(shù)分離、電泳分離技術(shù)分離和超離心分離技術(shù)。

20、28. 蛋白質(zhì)和酶的種類繁多，在提取時(shí)應(yīng)根據(jù)其存在的部位、分子結(jié)構(gòu)及溶解性質(zhì)的不同選擇不同的提取方法。29. 影響提取的因素主要有 溶劑 、 溶解度 、 溫度 、 pH 和 濃度差 等。30. 水溶液法提取酶和蛋白質(zhì)時(shí)，要注意控制好鹽濃度、溫度、pH值等因素。31. 沉淀分離技術(shù)包括鹽析 沉淀、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑沉淀等技術(shù)。32. 在核蛋白提取時(shí)，應(yīng)選用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取 核糖 核蛋白，而選用1mol/L的氯化鈉溶液提取 脫氧核糖 核蛋白。33. RNA的提取方法主要有 稀鹽溶液 提取和 苯酚水溶液 提取。34. 苯酚水溶液提取核酸時(shí)， 蛋白質(zhì) 和 DNA 沉淀于 苯酚 層中

21、，而 RNA和 多糖 溶解于 水層 中。35. 核酸沉淀分離主要有 有機(jī)溶劑沉淀法 、 等電點(diǎn)沉淀法 、 鈣鹽沉淀法 和 選擇性溶劑沉淀法 四種方法。36. 能夠選擇性地沉淀DNA的試劑是 異丙醇 。37. 根據(jù)物質(zhì)吸收光譜的頻率范圍不同分光光度檢測可分為：紫外分光光度檢測 、 可見光分光光度檢測 和 紅外光分光光度檢測 。38. 層析分離技術(shù)按流動(dòng)相狀態(tài)可分為 液相 層析和 氣相 層析；按分離過程所主要依據(jù)的物理化學(xué)性質(zhì)分為 吸附層析、分配層析、離子交換 層析、 分子排阻(凝膠過濾) 層析、 親和 層析等。39.聚酰胺薄膜層析只適用于 極性分子 的分離。40. 紙上層析是以濾紙纖維 的 結(jié)合

22、水 為固定相，以 有機(jī)溶劑 作為流動(dòng)相，展開時(shí)樣品中各物質(zhì)在兩相之間不斷地進(jìn)行分配，由于各物質(zhì)有不同的 分配系數(shù) 、 移動(dòng)的速率 也就不同，從而達(dá)到分離的目的。41. 溶質(zhì)在濾紙上移動(dòng)的速度可用Rf值表示，Rf = 溶質(zhì)斑點(diǎn)中心移動(dòng)的距離溶劑前沿移動(dòng)的距離 ，Rf值決定于 分配 系數(shù)，不同的物質(zhì)在兩相間的 分配系數(shù) 不同，Rf值也不同，由此可根據(jù)Rf值的大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。42. 薄層層析中用的薄層板有 硬板(濕板) 與 軟板(干板) 之分，常用的薄層板制作方法有浸涂 法、 噴涂 法、 傾斜涂布法 法和推鋪法 法。43. 氣相層析根據(jù)其固定相的不同可分為 氣固 層析和 氣液 層析兩種。44

23、. 氣相層析具有 分辨率高 、 分析速度快 、 靈敏度高 和 應(yīng)用范圍廣 等特點(diǎn)。45. 氣固層析的固定相為 固體 ，其分離的主要依據(jù)是 吸附劑 對(duì) 被吸附物 的 吸附力 不同，所以又稱為 氣相吸附 層析；氣液層析的固定相為 液體 ，其分離的主要依據(jù)是 分配系數(shù) 的不同，又稱為 氣相分配 層析。46. 氣相層析的流動(dòng)相是 氣體 ，稱為 載氣 ，常用的有 氫氣 、 氮?dú)?、 氦氣 、 氬氣 等。載氣的選擇主要根據(jù)所使用的 檢測器 和 載體氣流 決定。47. 紅色擔(dān)體用于分離 非極性 和 弱極性 物質(zhì)；白色擔(dān)體用于分離 極性 物質(zhì)48. 氣相層析時(shí)，樣品在進(jìn)柱前必須變?yōu)闅怏w，有些物質(zhì)難于氣化必須先

24、將其轉(zhuǎn)變?yōu)?易揮發(fā) 的衍生物再進(jìn)行氣相層析。49. 離子交換層析的操作過程包括上柱(加樣) 、 洗脫 和 收集 、樹脂再生四大步驟。58.大孔網(wǎng)狀吸附劑有（非極性）、（中等極性）和（極性）三種主要類型；50.影響離子交換速度的因素有（樹脂粒度）、（交聯(lián)度）、（溶液流速）、（溫度）、（離子的大小）、（離子的化合價(jià)）和（離子濃度）。51.分配色譜的基本構(gòu)成要素有（載體）、（固定相）和（流動(dòng)相）。52.分子篩色譜也稱（凝膠色譜）的主要應(yīng)用是（脫鹽）和（分級(jí)分離）53.配體與基質(zhì)之間引入 可以減少 效應(yīng)。手臂，空間位阻54.紙層析中，各物質(zhì)的Rf值決定于被分離物質(zhì)在兩相間的 以及兩相間的 。分配系數(shù)、

25、體積比55.一般說來，極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。無機(jī)吸附劑有極性的和非極性的兩種。羥基磷灰石、硅膠、硅藻土、氧化鋁和人造沸石屬前者，活性炭屬后者。56.柱層析的設(shè)備主要有層析柱、部分收集器、磁力攪拌器、梯度混合器、恒流泵、檢測儀和記錄儀，構(gòu)成一個(gè)完整的層析系統(tǒng)。57.裝好的層析柱中基質(zhì)應(yīng)合乎表面平整、填裝均勻、松緊一致和沒有氣泡的標(biāo)準(zhǔn)。68.床體積可通過測量柱內(nèi)徑和凝膠床高度計(jì)算出來，即Vt = 0.25R2h 58.G類葡聚糖凝膠常用GX 代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表持水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越

26、小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。59.凝膠層析分兩類： 是將樣品混合物按分子量大小分成兩組。如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)等。 是將一組分子量比較接近的組分分開。分組分離、分級(jí)分離60.凝膠層析中凝膠柱的鑒定 通?？梢?上柱，觀察有色區(qū)帶在柱中的洗脫行為，以檢測凝膠柱的均勻程度。藍(lán)色葡聚糖-200061.親和層析，基質(zhì)的活化，常用的方法有： 法和 法。溴化氰活化、環(huán)氧乙烷基活化。62.親和層析中糖蛋白常用的配體是凝集素，用于抗體純化的配體通常是抗原或者金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)。63.高效液相色譜儀通常由溶劑輸送系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)和檢測記錄系統(tǒng)四部分組成。

27、64.HPLC樣品可用微量注射器通過 的進(jìn)樣口注入樣液。六通進(jìn)樣閥65.按所使用的支持體的不同分為 紙 電泳、 薄層 電泳、 薄膜 電泳、 凝膠 電泳和 等電聚焦 電泳。按支持介質(zhì)的形狀分為 平板 電泳和 柱狀 電泳。66. 分子在電場中移動(dòng)的方向決定于所帶 電荷 的種類，帶正電荷的向的 負(fù)極 移動(dòng)；帶負(fù)電荷的向 正極 移動(dòng)； 靜電荷為零 的分子在電場中不移動(dòng)。分子在電場中移動(dòng)的速度主要決定于于顆粒所帶 凈電荷的量 ，同時(shí)受分子的 大小 和 形狀 的影響。67. 影響電泳的外界因素有電場強(qiáng)度 、 溶液的pH值 、 溶液的離子強(qiáng)度 、 電滲 以及緩沖液的粘度和溫度。83. 凝膠電泳與其他電泳的主

28、要區(qū)別，在于凝膠電泳同時(shí)具有電荷效應(yīng) 和 分子篩效應(yīng)的雙重作用，具有很高的 篩選效率 。68. 聚丙烯酰胺凝膠電泳按其凝膠系統(tǒng)的組成可分成 連續(xù) 凝膠電泳 、 不連續(xù) 凝膠電泳、 梯度 凝膠電泳和 SDS 凝膠電泳。69. 不連續(xù)電泳的凝膠由上至下可分為 樣品膠 、 濃縮膠 、 分離膠 。70. 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，其遷移率主要取決于它 所帶的電荷 以及分子的大小和形狀 。在聚丙烯酰胺系統(tǒng)中加入SDS，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于其 相對(duì)分質(zhì)量 ，而與它的 所帶的電荷 及 分子的形狀無關(guān)。71. 在聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)電泳系統(tǒng)中不僅具有 電荷效應(yīng) 效應(yīng)和分子篩效應(yīng) 效應(yīng)，而且還具有

29、 濃縮效應(yīng) 效應(yīng)，因此比連續(xù)電泳系統(tǒng)具有更高的分辨率和區(qū)帶清晰度。72.瓊脂含有 ，帶大量 電荷，因此，電泳過程中有強(qiáng)烈的 作用。瓊脂膠，負(fù)，電滲73.核酸電泳中可以用EB即 來對(duì)樣品區(qū)帶染色。溴化乙錠74.離子交換纖維素目前種類很多，其中以 和 最常用，在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)，酶，核酸等）的分離方面顯示很大的優(yōu)越性。DEAE-纖維素（二乙基氨基乙基纖維素）、CM-纖維素（羧甲基纖維素）75.離子交換劑的電荷基團(tuán)對(duì)不同的離子有不同的結(jié)合力。一般來講， 結(jié)合力越大； 結(jié)合力越大。離子價(jià)數(shù)越高、價(jià)數(shù)相同時(shí)，原子序數(shù)越大；76.陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶 電，可交換陰離子物質(zhì)。正77.凝膠過濾層析中

30、常用的凝膠有 、 和 。葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠78.對(duì)于 的酶，可以用酸溶液提取。在酸性條件下穩(wěn)定且溶解度大79.DEAE-纖維素的中文全稱叫 ，CM-纖維素的中文全稱叫 。 二乙基氨基乙基纖維素、羧甲基纖維素； 80. 二乙基氨基乙基纖維素的英文簡稱叫 ，羧甲基纖維素的英文簡稱叫 。DEAE-纖維素，CM-纖維素81.層析分辨率一般定義為 ，用 表示。兩峰的分開程度 、 Rs82.聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng)：只有分離膠的 和有濃縮膠與分離膠的 。連續(xù)系統(tǒng)、不連續(xù)系統(tǒng)83. 法的靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色高100倍，可以檢測低于1 ng的蛋白質(zhì)。銀染84

31、.精氨酸的pI值為10.76,將其溶于pH7的緩沖液并置于電場中，則精氨酸應(yīng)向電場的 方向移動(dòng)。負(fù)極85.蛋白質(zhì)雙向電泳時(shí)，如果第一向要根據(jù)等電點(diǎn)分離，第二向根據(jù)分子量分離，我們可以在第一向使用 ，第二向使用 電泳。第一向電泳后，必須 ，再進(jìn)行第二向電泳。86.離子交換劑帶有一定的反離子。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。所此，強(qiáng)陽性和強(qiáng)陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型；弱酸性和弱堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。 87.對(duì)于增加離子強(qiáng)度的梯度溶液，不管用于何種類型的離子交換劑，其離子強(qiáng)度絕大部分是增加的。而改變pH值的梯度溶液則不然，如果使用的是陽離子交換劑，pH值應(yīng)

32、從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑，pH值應(yīng)從高到低遞減。88.陽離子交換樹脂按照活性基團(tuán)分類，可分為（強(qiáng)酸型），（弱酸型）和（中等強(qiáng)度）；其典型的活性基團(tuán)分別有（磺酸基團(tuán)），（羧基），（磷酸基）。89.離子交換分離操作中，常用的洗脫方法有（pH梯度） 和（離子強(qiáng)度（鹽）梯度）。90.陰離子交換樹脂按照活性基團(tuán)分類，可分為（強(qiáng)堿型），（弱堿型）和（中等強(qiáng)度）；其典型的活性基團(tuán)分別有（季氨基）、（伯、仲、叔氨）、（強(qiáng)弱基團(tuán)都具備）。91.離子交換樹脂由（載體），（電荷基團(tuán)）和（反離子）組成。92DEAE Sepharose是（陰）離子交換樹脂，其活性基團(tuán)是（二乙基氨基乙基）。93CM Sep

33、harose是（陽）離子交換樹脂，其活性基團(tuán)是 （羧甲基）94. 影響吸附的主要因素有（吸附劑的性質(zhì)），（吸附質(zhì)的性質(zhì)） ，（溫度），（溶液pH值），（鹽濃度）和（吸附物濃度和吸附劑用量）。95.簡單地說，離子交換過程實(shí)際上只有（外部擴(kuò)散），（內(nèi)部擴(kuò)散）和（化學(xué)交換反應(yīng)） 三步；96.等電聚焦電泳法分離不同蛋白質(zhì)的原理是依據(jù)其（等電點(diǎn)（pI）的不同；97.根據(jù)分離機(jī)理的不同，色譜法可分為（吸附色譜） ，（離子交換色譜），（凝膠色譜），（分配色譜）和（親和色譜）。98.根據(jù)吸附劑與吸附質(zhì)之間存在的吸附力性質(zhì)的不同，可將吸附分為（物理） 、（化學(xué)） 、（極性）和（交換）吸附；99.如果想分離出抗原

34、，那么配體應(yīng)該是 ，如果想分離出糖蛋白，那么配體應(yīng)該是 。 抗體，凝集素100.離子交換劑可分為疏水性離子交換劑和親水性離子交換劑，而疏水性離子交換劑又可分為 交換劑和 交換劑。101.多緩沖劑的PH值決定PH梯度的 ，多緩沖交換劑的PH值決定pH梯度的 。下限，上限102.離子交換劑由 、 和 幾部分組成。基質(zhì)，電荷基團(tuán)，反離子103. 氣相色譜儀的基本構(gòu)造有兩部分，即 單元和 單元。前者主要包括 、 、 、 和 ，后者主要包括 和 。顯示，分析，氣源，進(jìn)樣裝置，恒溫器，色譜柱，檢測器，自動(dòng)記錄儀104.高效液相色譜儀的基本系統(tǒng)有 、 、 、 和 。進(jìn)樣系統(tǒng)，輸液系統(tǒng)，分離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)，數(shù)

35、據(jù)處理系統(tǒng)105.GC層析柱有兩種，一是 二是 。 填充柱，毛細(xì)管柱 106. 含 25%硫酸銨飽和度的細(xì)胞色素C溶液150ml，需加入 克硫酸銨或 毫升飽和硫酸銨溶液，才能使其達(dá)到55%的飽和度?(已知溫度為20，即G=533，A=0.3)。 28.95g, 100ml107.堿性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，最常用系統(tǒng)中電極緩沖液使用 ，凝膠緩沖液是 ；電極緩沖液PH值為 ，濃縮膠緩沖液PH值為 ；前導(dǎo)離子是 、尾隨離子是 。Tris/甘氨酸，Tris/HCI，8.3， 6.7，氯離子，甘氨酸根離子108.離子交換劑的電荷基團(tuán)對(duì)不同的離子有不同的結(jié)合力。一般來說， ，結(jié)合力越大； ，結(jié)合力越大

36、。離子價(jià)數(shù)越高；價(jià)數(shù)相同時(shí)，原子序數(shù)越大；109.聚酰胺薄膜層析中，DNS-Cl與氨基酸反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生 和 兩種主要副產(chǎn)物。DNS-NH2；DNS-OH；110.疏水層析中的固定相是由 和配體兩部分構(gòu)成，其配體對(duì) 具有一定的吸附力?；|(zhì)；疏水性物質(zhì)；111. Sephadex G75(分級(jí)分離范圍是3 000-80 000) 分離分子量為1.0105 Da和8104 Da的蛋白質(zhì)混合物。（填能或不能）不能；112.氣相色譜儀檢定器中，應(yīng)用較多的有 和 。氫火焰離子化檢測器（FID）；火焰光度檢測器（FPD）；電子捕獲檢測器（ECD) ；熱導(dǎo)檢測器（TCD)（填對(duì)兩種就可以）。113. 凝膠過濾層

37、析中常用的凝膠有 、 和 。葡聚糖凝膠；瓊脂糖凝膠；聚丙烯酰胺凝膠114. 離子交換纖維素目前種類很多，其中以 和 最常用，在蛋白質(zhì)的分離純化方面顯示很大的優(yōu)越性。DEAE-纖維素（二乙基氨基乙基纖維素）；CM-纖維素（羧甲基纖維素）；115. 疏水層析中的固定相是由基質(zhì)和配體兩部分構(gòu)成，其配體對(duì) 具有一定的吸附力。疏水性物質(zhì)116.陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶 電，可交換陽離子物質(zhì)。負(fù)117.如果想利用親和層析法純化抗原，配體可選擇 ?？贵w118.一般來說，酶固定化會(huì)使酶的活性 。降低119.泳動(dòng)度與球形分子半徑、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷以及電場強(qiáng)度有關(guān)。120.疏水層析中的固定相是由 和配體兩部

38、分構(gòu)成，其配體對(duì) 具有一定的吸附力?；|(zhì)；疏水性物質(zhì)121.HPLC的檢定器中，應(yīng)用較多的有 、 和 。紫外檢測器；示差折光檢測器；熒光檢測器；光電二極管陣列檢測器（答出其中三種即可）122. 電泳可分離20Kb1 000 Kb的DNA。脈沖電場凝膠電泳123.高效液相色譜定量分析方法有：面積百分法、歸一化法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法 。124.高效液相色譜定量分析使用內(nèi)標(biāo)法可以抵消儀器穩(wěn)定性差、進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確等原因帶來的定量分析誤差。125.毛細(xì)管電泳是20世紀(jì)80年代研制出的一種新型的區(qū)帶電泳方法，具有分辨率好、靈敏度高、檢測快捷等特點(diǎn)。126.DNA樣品緩沖溶解液內(nèi)含有0.25% ,在電泳中形成肉

39、眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置。 溴酚藍(lán)127.1983年，Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時(shí)間與DNA分子大小有關(guān)的特性，設(shè)計(jì)了脈沖電場梯度凝膠電泳。128.PAGE據(jù)電泳裝置不同分為垂直的圓盤及板狀兩種。129.毛細(xì)管電泳中的樣品各組分，不管是否帶有電荷或帶何種電荷，都會(huì)從正極向負(fù)極移動(dòng)，遷移速率正離子最大，負(fù)離子最小，中性分子_居中。130.常用的電泳染色法有考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染色法，其中銀染色法靈敏度高，考馬斯亮藍(lán)染色法線性寬。131.固定化酶的細(xì)胞或原生質(zhì)制備方法有： 、 、 和 。吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合（偶聯(lián)）法和交聯(lián)法。三、簡答題1、選擇制備生命大分子的

40、材料應(yīng)遵循的原則是什么? 答：材料選擇應(yīng)遵循的原則是有效成分含量高，來源豐富，穩(wěn)定性好，保持新鮮；提取工藝簡單；有綜合利用價(jià)值。在實(shí)踐過程中則需抓住主要矛盾，全面考慮，綜合權(quán)衡。2、一般理想的提取溶液應(yīng)具備下述條件？答：對(duì)有效成分溶解度大，破壞作用??；對(duì)雜質(zhì)不溶解或溶解度很??；來源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等。 3、吸附層析有什么優(yōu)點(diǎn)？答：吸附層析是應(yīng)用最早的層析方法，吸附劑來源豐富、價(jià)格低廉、易再生，裝置簡單、靈活，又具有一定的分辨率等優(yōu)點(diǎn)，至今仍廣泛應(yīng)用于各種天然化合物和生物發(fā)酵產(chǎn)品等初級(jí)產(chǎn)品的分離制備，如尿激酶、絨毛膜促性腺激素等粗品的制備。4、增加吸附劑表面積的方法有哪些？答：增加吸附劑

41、表面積的方法有：將吸附劑磨碎成小的顆粒；通過處理使顆粒表面凹凸多變；使吸附劑成為凝膠狀態(tài)；將吸附劑制成具有大量微孔的顆粒。5、與PAG圓盤電泳相比，PAG垂直板電泳有什么優(yōu)越性？答：（1）表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰。（2）在同一塊膠板上可同時(shí)進(jìn)行10個(gè)以上樣品的電泳，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影。（3）膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備。（4）膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長期保存與掃描。（5）可進(jìn)行雙向電泳。 6. 破碎生物細(xì)胞的常用方法有哪些？ 答：機(jī)械法：研磨，高速搗碎機(jī)；物理法：反

42、復(fù)凍溶，超聲波破碎，壓榨法，溶脹法；化學(xué)法：自溶，酶解法，有機(jī)溶劑處理。7、有機(jī)物的色譜分析，如何確定是選用HPLC還是GC？一般認(rèn)為，對(duì)于有機(jī)物的色譜分析，當(dāng)其相對(duì)分子質(zhì)量小（一般在200以下）、沸點(diǎn)較低時(shí)，加熱又不易分解的樣品，可用GC進(jìn)行分析；當(dāng)沸點(diǎn)較高(450)、不能氣化或熱穩(wěn)定性差者，可用HPLC分析。相對(duì)分子質(zhì)量在200-2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對(duì)分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。 8.交變脈沖電場凝膠電泳原理和應(yīng)用。答：電泳系統(tǒng)是由一個(gè)水平式電泳槽和兩組獨(dú)立，彼此垂直的電極組成，一組電極負(fù)極為N，正極為S；另一組負(fù)極為W，正極為E。

43、一塊正方形瓊脂糖凝膠板呈45置于中央，電場在N-S和W-E之間交替建立。 電場交替改變的時(shí)間長短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。電泳時(shí)，DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場中。首先向S極移動(dòng)，然后改向E極。在每次電場方向改變時(shí)，DNA分子就要有一定的時(shí)間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當(dāng)DNA分子達(dá)到一定構(gòu)型后，才能繼續(xù)前進(jìn)。DNA分子凈移動(dòng)方向與加樣線垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬bp的大分子DNA。9.試述聚丙烯酰胺凝膠與瓊脂糖凝膠的不同之處？（1）分離范圍不同：瓊脂糖凝膠電泳分離分子量比較大的物質(zhì)，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝膠分離分子量較小的物質(zhì)，如蛋白

44、質(zhì)，多肽等。（2）凝膠配置程序不同：瓊脂糖凝膠在緩沖液中加熱融化，在凝固前倒入槽中即可；聚丙烯酰胺凝膠在配置時(shí)還要加多種成分，并且對(duì)聚合溫度也有一定的要求，否則會(huì)影響凝膠孔徑的大小。（3）凝膠的厚度不同：瓊脂糖凝膠最薄只能達(dá)到；聚丙烯酰胺凝膠可以制成.，分辨率高。（4）安全性不同：瓊脂糖沒有毒性；聚丙烯酰胺凝膠單體及交聯(lián)劑有毒性。10.離子交換層析的梯度洗脫，所用梯度溶液按組成來分，一般有哪兩種？答：一種是增加離子強(qiáng)度的梯度溶液。是用一簡單的鹽（如NaCl或KCl）溶解于稀緩沖液制成的，習(xí)慣上不用弱酸或弱堿的鹽類；一種是改變pH值的梯度溶液。該溶液是用兩種不同pH值或不同緩沖容量的緩沖液制成的

45、，所用緩沖液的種類、pH值以及緩沖容量要認(rèn)真選擇，否則將達(dá)不到預(yù)期目的。11、HPLC（高效液相色譜）具有哪些特點(diǎn)？ 答：高壓：由于液體比氣體通過色譜柱時(shí)所受的阻力要大得多，所以必須施加高壓，一般為15-30MPa，最高可達(dá)50MPa。 高速：由于HPLC采用了高壓，使流動(dòng)相液體的流速加快，一般分析周期為數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘。通常分析一個(gè)樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。 高效：由于HPLC的柱效較高(以理論塔板數(shù)計(jì)大約700010000)，有時(shí)一根柱子可分離數(shù)十種乃至上百種組分。比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。 高靈敏度：采用靈敏的檢測器和自動(dòng)化裝置

46、，可檢出10-9g乃至10-11g 的物質(zhì)；所需試樣量很少，通常只需數(shù)十微升試樣即可進(jìn)行全分析。12、在酶的純化過程中，如果某一純化步驟中酶活力超過了100%，可能的原因是什么？ 答：在酶的純化過程中，如果某一純化步驟中酶活力超過了100%，則很有可能是由于此酶的激活劑（包括別構(gòu)激活劑）的加入或抑制劑的丟失所造成的。這些激活劑或抑制劑可能原先并不知道。13.簡述影響抽提的決定因素及其原則影響抽提的因子有溶劑的濃度和極性，PH值，離子強(qiáng)度，水解酶，溫度，攪拌，氧化，金屬離子，抽提液和抽提物的比例。14、選擇分離純化方法的依據(jù)和主要的要求是什么？如何評(píng)價(jià)分離純化的可靠性？ 答：依據(jù)就是生物大分子與

47、雜質(zhì)之間的生物學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)上的差異。早期分離純化要求：要快速、粗放。能較大地縮小體積。分辨力不必太高。負(fù)荷能力要大。晚期分離純化要求：分辨力要高。分離純化的可靠性可通過生物大分子制備物的均一性（即純度）和活性的鑒定。純度要高，最好是一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰。活性回收率要高，酶比活力要高。15、吸附劑的比表面積對(duì)吸附容量有什么影響？如何克服細(xì)顆粒吸附劑流速慢的問題？為什么？ 答：比表面積指每克吸附劑所具有的表面積。吸附現(xiàn)象發(fā)生在吸附劑的表面，因此吸附劑比表面積愈大，吸附量愈多。為克服細(xì)顆粒吸附劑流速慢的問題，可以在吸附劑總量不變的情況下，選擇較大徑高比

48、的層析柱或/和增加操作壓。增大層析柱直徑會(huì)使層析柱有較大橫截面，使流速加快，分辨率降低；壓強(qiáng)增大，流速加快，層析分辨率提高（流速慢有擴(kuò)散現(xiàn)象）。16、在疏水作用層析純化苯丙氨酸裂解酶時(shí)，為什么要用雙梯度 NH4SO41.00.0mol/L,甘油020%Tris-HCl緩沖液(pH7.5)進(jìn)行洗脫？答：雙梯度指硫酸銨濃度從大到小和甘油濃度從小到大。降低鹽濃度，使洗脫液的離子強(qiáng)度降低，疏水層析時(shí)洗脫液的洗脫能力增大。增加甘油濃度，使洗脫液極性減小，疏水層析時(shí)洗脫液的洗脫能力增大。17.下列五肽的混合物，上陰離子交換柱，以pH10到pH1連續(xù)變化的緩沖液洗脫，它們洗脫的次序是怎樣的？為什么？ a.

49、Lys-Gly-Ala-Thr；b. Lys-Gly-Ala-Glu；c. His-Gly-Ala-Glu； d. Glu-Gly-Ala-Glu；e. Val-Gly-Ala-Lys答：陰離子交換樹脂與帶負(fù)電多的肽段結(jié)合牢固，后洗脫。帶電相同的情況下，與疏水性較強(qiáng)的肽段結(jié)合牢固。所以從由先到后的洗脫順序是 a, e ,b ,c ,d。18、為什么在凝膠過濾層析時(shí)，分子量小的蛋白質(zhì)有較長的保留時(shí)間，而在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它又跑得最快？ 答：凝膠過濾常用的是葡聚糖凝膠(Sephadex)，這種凝膠顆粒的交聯(lián)介質(zhì)排阻分子量較大的蛋白質(zhì)，僅允許分子量較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入顆粒內(nèi)部，所以分子量較

50、大的蛋白質(zhì)只能在凝膠顆粒之間的空隙中通過。這意味著它通過柱的體積為床體積減去凝膠顆粒本身所占的體積。而分子量小的蛋白質(zhì)必須通過所有的床體積才能流出，所以，分子量小的蛋白質(zhì)比分子量大的蛋白質(zhì)有較長的保留時(shí)間。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其凝膠介質(zhì)并不存在象凝膠過濾中Sephadex那樣的顆粒之間的空隙。所以，所有的蛋白質(zhì)分子必須通過交鏈介質(zhì)而移動(dòng)。蛋白質(zhì)的分子量越小，通過介質(zhì)就越快，移動(dòng)得越迅速。19.一種分子量為24,000、pI為5.5的酶被一種分子量類似、但pI為7.0的蛋白質(zhì)和另外一種分子量為100,000、pI為5.4的蛋白質(zhì)污染。提出一種純化該酶的方案。答：用凝膠過濾(即分子排阻

51、層析)法先除去分子量為100,000、pI為5.4的蛋白質(zhì)，余留7、下來的低分子量的含酶的混合物再用離子交換層析法分離，于是就能獲得所需要的純酶。20.凝膠過濾層析中的分子篩效應(yīng)與SDS-PAGE中的分子篩效應(yīng)有什么異同點(diǎn)？ 答：相同點(diǎn)：根據(jù)生物大分子的分子量大小進(jìn)行分離。不同點(diǎn)：二者作用機(jī)制不同，凝膠過濾層析主要依靠分子篩效應(yīng)，即大分子物質(zhì)經(jīng)凝膠間隙被洗脫，而小分子物質(zhì)由于進(jìn)入了凝膠顆粒內(nèi)部，洗脫時(shí)走的路徑較長，故而在凝膠中能保留較長的時(shí)間，中等大小的分子由于進(jìn)入凝膠顆粒的程度不同，按照分子量由大到小的順序先后洗脫。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)被SDS所掩蓋，SDS-蛋白

52、質(zhì)復(fù)合物變成雪茄狀，其短軸均相同，而長軸與分子量大小成正比，在電泳時(shí)，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的遷移率與其形狀有關(guān)，分子量小的遷移較快。21、影響電泳時(shí)帶電顆粒泳動(dòng)度的主要因素有哪些？它們是分別如何影響的？ 答：（1）首先決定于帶電顆粒的性質(zhì)，即顆粒所帶凈電荷的數(shù)量，大小及形狀。一般說來，顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動(dòng)速度快，反之則慢。（2）電場強(qiáng)度。一般電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動(dòng)速度越快。（3）溶液的pH值。溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少，對(duì)于蛋白質(zhì)，氨基酸等兩性電解質(zhì)而言，溶液pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶凈電荷越多；電泳速度越快；反之則越慢。（4）溶液的離子強(qiáng)度。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動(dòng)速度越慢，反之越快。 （5）電滲作用。電滲是指在電場中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。在電場中，若帶負(fù)電荷顆粒向正極移動(dòng)，而介質(zhì)卻向陰極移動(dòng)，從而對(duì)顆粒的泳動(dòng)起阻礙作用；反之加快。（6）支持物。對(duì)支持物的一般要求是均勻，吸